通过动态和三维荧光显微照片了解线粒体形态的变化

我们研究的目的是观察线粒体网络的变化，并研究这些线粒体网络如何响应细胞条件而变化。我们使用斐济和 Python 等开源工具，将现有库与自定义宏和脚本相结合，从复杂的荧光显微镜数据中自动进行线粒体形态分析。获得可靠的定量数据和指标来描述线粒体裂变和融合的动力学及其在 3D 中的定位仍然是一个挑战。

此类数据生成的标准化并不普遍。因此，对细胞特异性裂变和融合频率以及细胞内定位的了解有限。我们将线粒体裂变和融合的生命检测添加到可用的研究指标中。

通过将这些与线粒体结构计数相结合，我们能够定义一个新的指标来理解线粒体网络动力学。我们的发现使我们能够表征细胞特异性裂变和融合参数，并首次确定线粒体系统是处于平衡状态还是移动状态。这可以防止对健康和疾病表型的重大误解，并为准确报告提供了清晰的框架。

首先，在 ImageJ 中打开原始文件。调整颜色设置以增强感兴趣区域的可见性，但不要设置任何内容。根据需要分析的单个单元格的数量复制图像。

如果视野中存在多个单元格，请导航到“分析”、“工具”，然后使用“同步窗口”工具和“手绘”工具在感兴趣单元格周围绘制感兴趣区域，然后选择“编辑”并选择“清除外部”以隔离所选单元格。将红色和蓝色通道彼此拆分，并将线粒体通道另存为 tif 文件。要生成点扩散函数或 PSF，请重新打开原始图像。

然后，通过选择插件，然后选择 PSF 生成器并选择 天生狼 3D 光学模型来打开 PSF 生成器插件。通过选择图像，然后选择显示信息或按键盘上的 I 来打开原始图像的图像信息。滚动到图像信息窗口的底部。

选择体素大小和深度选项，并将波长更改为 568 纳米。将 Pixelsize XY 设置为 166.1 纳米，将 Z 步长设置为 200 纳米。将 XYZ 大小设置为与 512 x 512 的图像分辨率匹配，并将 Z 堆栈配置为包含 10 个 Z 切片。

单击运行。将 PSF 保存为其自己的文件夹中的 tif 文件。导航到插件，选择宏，然后选择编辑，然后选择Deconvolution_time_lapse_mine。

ijm 访问反卷积宏。根据需要编辑输入和输出行，然后按运行执行宏。对于图像对比度增强和模糊，请导航到插件，选择宏，选择编辑并打开预处理。

ijm 访问预处理宏。通过将滚动球半径设置为 6 来执行背景减法。设置 Sigma Filter Plus，使半径设置为缩放因子的 1 倍。

使用的像素数为 2，最小像素分数为 0.2，确保插件设置为异常值感知。通过将块大小配置为 64、直方图条柱配置为 256、最大斜率配置为 2.5、伽玛配置为 0.8 来调整 CLAHE 设置，然后单击运行。打开已使用“预处理”修改的感兴趣文件。

ImageJ 中的 ijm 宏。导航到 插件（Plugins） 并选择 自适应阈值（Adaptive Threshold）。将局部阈值设置为加权均值，并根据需要调整像素块大小。

单击预览并调整块大小以清楚地包含尽可能多的线粒体。修改每个单元格的减去值以消除不必要的背景，并记下生成的显微照片。要优化时间，请根据应用的减去值将图像分类到文件中。

现在导航到插件，选择宏，选择编辑并打开阈值。ijm 访问阈值宏。编辑宏脚本以定义正确的输入和输出路径、块大小和减去值。

单击“运行”以执行宏。打开多达 10 张属于相同治疗条件的阈值显微照片。导航到 图像、堆栈、工具 并选择 连接，然后按 删除阈值留下的残余小点 OK.To，转到 插件，然后转到 积分图像过滤器，然后选择 删除异常值。

使用预览微调 X 和 Y 大小以消除片段。将串联的文件另存为 TIF 文件。最后，导航到插件、宏、编辑、QuickTest_new.ijm。

编辑输入和输出路径行以指向相应的目录，单击“运行”并可视化线粒体事件定位器或 MEL 结果。在 3D 和 2D 视图中，通过红色点标记裂变事件和绿色点标记融合事件跟踪线粒体动力学随时间推移。线粒体网络在结构上显示出随着时间的推移的治疗特异性差异，在二甲双胍处理的细胞中具有更细长和相互连接的形式，在二甲双胍 CCCP Baf 处理的细胞中具有高度碎片化的网络。

二甲双胍 CCCP Baf 组显示出显着高于对照组或仅二甲双胍组的裂变和融合活性，表明线粒体重塑增加。该组的线粒体计数也显着较高，与片段化增强一致。同一组的线粒体体积显着减少，进一步支持向裂变的转变。

然而，当归一化为线粒体数时，仅二甲双胍组表现出最高的相对动态活性，这表明单独使用二甲双胍促进了更活跃和更有效的重塑网络，而共同治疗则驱动了广泛但效率较低的结构更新。