监测细胞自主的生物钟节律基因表达，利用荧光素酶生物发光记者

该方案详细说明了荧光素酶报告细胞系的产生以及随后对生物发光表达的细胞自主昼夜节律的监测。首先，构建慢病毒荧光素酶表达报告基因并产生慢病毒颗粒，继续感染感兴趣的细胞并扩增选定的培养物。然后使用适当的记录设备监测同步报告细胞中的生物发光表达。

最终，生物发光记录用于证明细胞自主的昼夜节律。与瞬时转染和种系保护等现有方法相比，该技术的主要优点是 VIR 是介导的。Gene 可稳定整合到细胞基因组中，并提高效率和多功能性。

这种方法可以帮助回答 cied clock 研究领域的关键问题。例如，是否有组织特异性的生物钟？如果是这样，组织特异性生物钟的特性是什么？

尽管这种方法可以提供对 clock mechanisms 的见解。它也可以应用于其他系统，例如细胞周期动力学、肿瘤发生等。当我们决定研究组织或细胞类型特异性的固定时钟时，我们首先想到了这种方法。

演示该程序的博士后研究员 Chita Norm Napkin 博士和我实验室 Atory 的研究生 Sandra。通常，哺乳动物昼夜节律报告基因构建体包含一个表达盒，其中昼夜节律启动子与荧光素酶基因融合。在这个慢病毒报告基因中，不稳定的荧光素酶受每两个启动子小鼠的控制。

有关通过重组反应构建报告基因载体的详细说明，请参阅随附的高效转染手稿。从传代数低、汇合度为 90% 至 100% 的人胚胎肾细胞的培养开始。现在包被六个孔培养板。

对于转染，向每个中加入 1 毫升 0.001% poly L 赖氨酸，在室温下孵育 20 分钟，然后用 PBS 冲洗一次。接下来，使用胰蛋白酶收获细胞，并将细胞接种到预包被板的每个孔上。旋转板以获得细胞的均匀分布。

验证接种的细胞在 1.5 mL 微量离心管中是否已达到 80% 至 90% 的汇合度。制备慢病毒报告基因质粒、DNA 和三种包装载体的质粒转染混合物，作为转染和后续感染的对照。包括一个用于慢病毒 GFP 表达载体的额外孔，该载体在 CMV 启动子的控制下含有增强的绿色荧光蛋白。

接下来，向质粒中加入 100 微升 0.25 摩尔氯化钙并充分混合。然后加入 100 微升两种 XBBS 溶液，轻轻但彻底混合。将 DNA 混合物在室温下孵育 15 分钟。

等待时，用 2 毫升新鲜培养基替换 2 9 3 T 细胞的培养基。将板放回培养箱中至少 10 分钟，以平衡培养基的 pH 值。接下来，以逐滴方式将转染混合物添加到细胞中，轻轻旋转板，在显微镜下观察颗粒形成，然后将细胞置于培养箱中过夜。

转染后约 16 小时，用 2 mL 新鲜 DMEM 补充培养基并培养过夜。接下来，为了评估转染效率，评估转染对照细胞中的 EGFP 表达。EGFP 表达高时，转染效率为 90% 至 100% 是良好病毒制备的可靠预测指标。

收获含有分泌的感染性病毒颗粒的培养基，离心以去除残留的 2 9 3 T 细胞，并收集含有 supernat 的病毒。第 3 天，在 12 孔板上接种大约 12， 003 T 3 个细胞，培养过夜至 20% 至 30% co fluness，并在第 4 天观察细胞。还是在第四天，将 poly brain 添加到收集的含有病毒颗粒的培养基中，并通过移液充分混合。

现在从三个 T 3 细胞中吸出培养基，并在每孔中加入 1 毫升病毒混合物。用 PBS 洗涤细胞一次后，在 37 摄氏度下孵育过夜，补充培养基并在 37 摄氏度下孵育细胞过夜以进行恢复和生长。汇合后，分流细胞并在第二天培养过夜。

要开始筛选感染细胞，请添加每毫升含 10 μg 的新鲜培养基。撇开稻瘟菌不谈，杀伤车中的稻瘟酸需要针对每种细胞系进行经验测定。每 2 到 3 天补充一次含有 blastin 的培养基，用于连续筛选抗生素耐药细胞。

表达时钟记者。将稻瘟菌素抗性报告细胞培养物扩增到 35 毫米培养皿中直至汇合后，我们通常在每种条件下为每个报告细胞系准备三个或更多培养皿，用于 sarcy 表型。用 PBS 洗涤一次后，加入含有 10 微摩尔叶酸或 200 纳摩尔地塞米松的 DMEM，在 37 摄氏度下孵育 1 小时以使细胞同步。

现在将细胞放入新鲜制备的记录培养基中。用 40 毫米无菌盖玻片盖住培养皿，并用真空润滑脂密封到位以防止蒸发。将培养皿加载到发光循环发光仪上并开始实时生物发光。

记录 用于记录 96 个旧板。使用 GSR 两个录音设备，见 accomp 手稿。我们很容易记录 5 到 7 天的节奏 在 lum 循环分析程序中。

第一个基线拟合原始数据。然后使用基线减去的数据来拟合正弦波，并确定所需的参数 对于显示持续节律的样本。由于高瞬态 Luminate，很容易实现超过 90% 的英尺高数据。

感应和媒介变化。我们通常会从分析中排除第一个数据周期，以便进行数据呈现。必要时，根据时间绘制原始数据。

绘制基线减去数据以比较 2 9 3 T 细胞瞬时转染和细胞系感染中的振幅和相位。转染和转导的 GFP 表达细胞的荧光图像表明，慢病毒介导的基因递送系统非常高效。生物钟的核心反馈回路由作用于昼夜节律增强子元件以产生节律基因表达的转录因子组成。

在这里，三个 T 3 细胞中的四种不同的报告基因构建体产生不同的报告基因表达阶段。通过使用 RNAi 和药理活性化合物的基因敲低，多个昼夜节律元件的组合调控可以产生新的中间相。该实验使用 lum 循环发光仪对 U2 OS 细胞中 35 毫米培养皿中的细胞进行生物发光记录。

Irna 用于阐明 cry one 和 cry two 基因的敲低效应。这里使用协同发光仪对细胞进行生物发光记录。在 96 孔板中的三个 T 中，三个报告细胞。

RNA 用于评估 triune 敲低对细胞节律的影响。在这个例子中，UX 系统和 tecan 发光仪用于 3 84 中细胞的生物发光记录。当如图所示选择板时，小分子可以在药理学上靶向和扰乱 U2 OS 报告细胞细胞节律中的蛋白质功能。

在它的发展之后。这项技术为昼夜节律生物学领域的研究铺平了道路，以探索不同细胞和组织类型的时钟机制和生理学。观看此视频后，它应该对如何生成 Lucifer、报告细胞系和监测体积有很好的了解。

并且不要忘记，使用 VIR 可能是极其危险的命令，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护和病毒净化。