CRISPR/Cas系统核酸内切酶的底物制备

以下实验的总体目标是生成用于研究Cas内切酶的RNA底物，Cas内切酶在细菌和古菌中发现的CRISPR-Cas免疫系统中发挥关键作用，以获得用于Cas内切酶研究的RNA底物。可通过PCR扩增特定的CRISPR区域，以获得用于体外RNA合成的长链DNA模板。如有需要，亦可采用此方法。

两条寡核苷酸可通过退火生成较短的模板，用于底物RNA的制备。或者，可将短的、定制合成的重复序列用于Cas内切酶活性检测。最终，通过自显影技术可观察RNA转录产物及其随后被Cas6内切酶切割的结果。

演示者技术的主要目标是使研究人员能够利用不同长度的RNA底物来研究CRISPR RNA的加工过程。因此，采用了多种方法来生成小RNA，例如单个重复元件或较大的RNA，如跨越多个间隔序列的CRISPR RNA转录本。尽管这些方法特别适用于研究CRISPR RNA的成熟过程，但类似的模板制备策略也可应用于其他RNA加工系统。演示该实验流程的将是来自细菌与古菌CRISPR免疫系统实验室的研究生Muted Surface和博士后Repl。

一种称为原间隔序列的病毒DNA序列可在适应过程中被插入到不断扩增的CRISPR簇的两个重复元件之间。随后，整个CRISPR簇被转录，并由Cas内切酶（例如Cas6）加工成小型的CRISPR RNA。这些小型CRISPR RNA随后被整合到Cas蛋白复合物级联中，利用CRISPR RNA与原间隔序列之间的碱基互补性作为信号，介导宿主防御以应对重复的病毒感染，从而引发病毒DNA的降解，生成长链的pre-CRISPR RNA底物。

首先设计PCR引物，通过在正向引物上添加T7 RNA聚合酶启动子序列，靶向CRISPR簇的间隔区。然后在两个引物上添加限制性酶切位点，以便将PCR产物克隆至载体中。需要注意的是，在通过PCR从基因组DNA中扩增出目标pre-CRISPR RNA序列后，T7 RNA聚合酶在转录起始时需要一个I（肌苷）鸟嘌呤残基，以确保转录的正确起始。

通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，从凝胶中回收目标条带，然后用限制性内切酶消化PCR产物以产生黏性末端。接下来，使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除任何切割副产物，随后加入T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液，以及按3:1摩尔比的酶切PCR产物与具有相应黏性末端的DFOs4相关质粒载体。将连接反应体系在16摄氏度下孵育过夜，然后按照标准操作流程将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中，并通过蓝白斑筛选鉴定成功的连接克隆。

最后，使用质粒提取试剂盒从白色菌落中分离质粒，并通过质粒测序鉴定阳性克隆，以生成中等大小的pre-CRISPR RNA底物。首先设计含有目标CRISPR重复间隔序列的正向和反向寡核苷酸，其序列类似于此处所示序列。需要注意的是，这些寡核苷酸包含T7 RNA聚合酶启动子序列，以及在寡核苷酸末端添加的限制性酶切位点，以确保形成黏性末端。

将样本在37摄氏度下用T4多核苷酸激酶和T4多核苷酸激酶缓冲液孵育一小时，以对每种寡核苷酸的5′端进行磷酸化。随后，将磷酸化的正向和反向寡核苷酸在加热块上于95摄氏度下与T4 DNA连接酶缓冲液孵育5分钟。待样本退火后，关闭热源，使混合物冷却约两到三小时，直至达到室温。

现在将合成的寡核苷酸与经杂交混合物消化并去磷酸化的P载体T4 DNA连接酶缓冲液以及TP在16摄氏度下连接过夜。然后通过标准实验方案将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α细胞中，并采用蓝白斑筛选鉴定成功连接的克隆。最后，提取质粒并通过酶切分析及质粒测序确认阳性克隆。

可以设计较短的单重复序列的cas RNA底物序列，类似于此处所示的序列。务必包含一个脱氧核糖核苷酸。如果需要确定RNA切割位点，可利用定制合成服务来制备该RNA寡核苷酸。

使用定制底物分离质粒后，利用能够切割克隆片段下游序列的限制性内切酶，通过质粒大提纯化试剂盒对质粒进行线性化。随后，在确认消化完全后，采用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化线性化质粒。通过重悬沉淀于经DEPC处理的无菌水中，回收核酸。

现在将消化质粒在新配制的体外T7 RNA聚合酶 runoff 转录反应体系中于37摄氏度孵育3小时，反应体系包含ATP、CTP、GTP和UTP。最后，通过含8摩尔尿素的12%聚丙烯酰胺变性凝胶分析所获得的RNA转录产物。也可通过Mono Q阴离子交换色谱纯化转录产物，随后对RNA组分进行乙醇沉淀以回收转录产物，并将沉淀重悬于经DEPC处理的无菌水中，用于内切酶活性检测。首先通过放射自显影观察底物条带，然后从含8摩尔尿素的变性凝胶中通过凝胶回收法纯化反应产物，以分析设计的底物。

12%聚丙烯酰胺凝胶，然后通过热沉淀和镍NTA层析法生产并纯化目标重组Cas蛋白，如来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）的Cas6蛋白所示。接着将Cas蛋白与新配制的核酸内切酶反应混合液在37摄氏度下孵育30分钟，以进行核酸内切酶活性检测反应。最后，取5 µL反应混合物上样至8摩尔尿素变性凝胶中。

使用12%聚丙烯酰胺凝胶，通过放射自显影观察电泳后的切割产物。此处显示的是经溴化乙锭染色的聚丙烯酰胺凝胶，其中包含一种定制设计的RNA寡核苷酸及两条体外转录的RNA转录本。请注意，不同长度构建体（短、长和中等长度）的RNA产量效率存在差异。

研究RNA内切酶活性需要设置阳性和阴性对照，以及高度纯化的重组Cas蛋白。本图显示了来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）的Cas6蛋白样品制备的SDS-PAGE凝胶结果。

经过热沉淀和镍柱NTA层析后，与标准蛋白质标记物平行电泳的结果如图所示。合适的阴性对照样品应包含未表达CAS六的细胞裂解液，但需经过与CAS六纯化完全相同的步骤处理。经检测，CAS六制备样品达到了所需的高纯度水平。在此，通过自显影技术可观察到热纤梭菌（Clostridium thermocellum）CAS六蛋白对5'端标记的重复序列底物的切割作用。

每条泳道包含放射性标记的底物、与ca six蛋白孵育后的RNA（由加号指示）或以缓冲液作为阴性对照（由减号指示），底物包括长链底物或短链底物，部分添加了脱氧核糖核苷酸。在第-9位点引入修饰以促进核酸内切酶反应。请注意，在RNA分子中加入脱氧核糖核苷酸后，短链底物在此实验条件下未发生切割。

CAS 六种核酸酶也可用作生成成熟且清晰的 RNA 分子的工具。这些 RNA 可被整合到级联复合物中，以深入理解其在抵御病毒感染过程中的作用机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何设计和制备用于 Cas 蛋白及核酸酶的 CRISPR 前体底物。

这些不同的底物可用于研究 CRISPR 酶的成熟与利用相关的问题。