CRISPR / CAS系统内切酶的底物生成

以下实验的总体目标是生成用于 Cas 核酸内切酶研究的 RNA 底物，它在细菌中发现的 crispr Cass 免疫系统和 ArcHa 中获得 Cas 核酸内切酶的 RNA 底物中起着至关重要的作用。特定 CRISPR 区域的 PCR 扩增可用于获得用于体外 RNA 生产的长 DNA 模板。如果愿意。

两个寡核苷酸可以跪下生成用于底物 RNA 生产的较短模板。或者，可以在 CAS 核酸内切酶检测中检测短的定制合成重复序列。最终，RNA 转录本的产生和随后的 CAS 六核酸内切酶的切割可以通过自动放射成像进行可视化。

演示技术的主要目标是使研究人员能够研究使用不同长度的 RNA 底物进行 CRISPR RNA 加工。因此，使用不同的方法来生成小 RNA，例如，单个重复元件或较大的 RNA，例如 crispr、RNA、跨越多个间隔区的转录本。尽管这些方法专门提供了对 CRISPR RNA 成熟的见解，但类似的模板制备策略可以用于其他 RNA 加工系统，演示该程序将静音表面研究生和博士后，两者都来自实验室在细菌和 ArcHa CRISPR 免疫系统中。

在称为驯化的过程中，可以将称为原始间隔区的病毒 DNA 序列插入不断增长的 CRISPR 簇中的两个重复元件之间。接下来，转录整个 CRISPR 簇，然后通过 Cass 核酸内切酶（例如 CAS 6）加工成小的 CRISPR RNA。然后将小 CRISPR RNA 掺入 CAS 蛋白复合物级联反应中，并利用 CRISPR RNA 和原始间隔区之间的碱基互补性作为病毒 DNA 降解的信号，以产生长的前 CRISPR RNA 底物，从而介导宿主对重复病毒攻击的防御。

首先设计 PCR 引物，通过将 T 7 RNA 聚合酶启动子序列添加到正向引物中来靶向 CRISPR 簇的间隔区。然后向两个引物添加限制性位点，以将 PCR 产物克隆到载体中。请注意，T 7 RNA 聚合酶在通过 PCR 从基因组 DNA 中扩增感兴趣的前 CRISPR RNA 序列后，需要 I guine 残基才能正确开始转录。

分离 PCR 产物，伟哥 aose 凝胶电泳和凝胶提取物禁用的欲望，然后用限制性内切酶消化 PCR 产物以产生粘性末端。接下来，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物后，为了去除任何切割副产物，加入 T 4 DNA 连接酶、T 4 DNA 连接酶缓冲液和裂解的 PCR 产物与具有相应粘性末端的 DFO 4 相关冰球载体的 3：1 摩尔比。现在将连接反应在 16 摄氏度下孵育过夜，然后将混合物转化为感受态大肠杆菌、DH 5 α 细胞，通过标准方案使用蓝白斑筛选来识别连接成功。

最后，使用质粒制备试剂盒从白色菌落中分离质粒，并通过质粒测序鉴定阳性克隆，以生成中等大小的 pre CRISPR RNA 底物。首先使用类似于此处所示序列的所需 CRISPR 重复空间序列设计正向和反向寡核苷酸。请注意，寡核苷酸在终止寡核苷酸后包含 T 7 RNA 聚合酶启动子的序列以及末端限制性位点，以确保形成粘性末端。

跪下后，将样品与 T 4 多核苷酸激酶和 T 4 多核苷酸激酶缓冲液在 37 摄氏度下孵育 1 小时，至五个引物磷酸化物，每个寡核苷酸一个异常。然后将磷酸化的正向和反向寡核苷酸与 T 4 DNA 连接酶缓冲液在 95 摄氏度下在加热块上孵育 5 分钟。样品杂交后，关闭热源，让混合物冷却约 2 到 3 小时，直到达到室温。

现在用杂交混合物、消化和去磷酸化的 P 载体、T、4 DNA 连接酶缓冲液和 TP 连接称为的寡核苷酸，在 16 摄氏度过夜。然后将连接的质粒转化为感受态大肠杆菌、DH 5 α 细胞，通过标准方案使用蓝白斑筛选来识别连接成功。最后，分离质粒并通过消化和随后的质粒测序鉴定阳性克隆。

短的单重复 cas RNA 底物序列可以设计得与此处所示类似。一定要包括脱氧核糖核苷酸。如果要确定 RNA 切割的位点，则可以利用定制的合成设施来实现 RNA 寡核苷酸的生产。

使用所选的定制底物分离质粒后，使用 maxi prep 质粒纯化试剂盒将质粒与裂解克隆片段下游的限制性内切酶线性化。然后在确保完全消化后，通过苯酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化线性化质粒。通过复苏回收核酸，将沉淀悬浮在 DEPC 处理的无菌水中。

现在将消化质粒在新鲜制备的体外 T 7 RNA 聚合酶径流转录混合物（包括 A-T-P-C-T-P-G-T-P 和 UTP）中在 37 摄氏度下孵育 3 小时。最后，在变性 8 摩尔尿素、12% 聚丙烯酰胺凝胶上分析获得的 RNA 转录物。也可以通过单 Q 阴离子交换色谱纯化转录本，然后通过乙醇沉淀 RNA 组分和在 DEPC 处理的无菌水中回收沉淀沉淀来回收转录本，以通过核酸内切酶测定分析设计底物，首先通过自动射线照相观察底物条带，并通过从变性八摩尔尿素中提取凝胶来纯化反应产物。

然后，12% 聚丙烯酰胺凝胶通过热沉淀（镍 NTA 色谱法）产生并纯化所需的重组 CAS 蛋白，如来自梭状芽胞杆菌热电池的 CAS six 蛋白所示。然后将 CAS 蛋白与新鲜制备的核酸内切酶反应混合物在 37 摄氏度下混合 30 分钟，以使核酸内切酶测定反应发生。最后，将 5 种反应混合物加载到 8 摩尔尿素上。

12% 聚丙烯酰胺凝胶，并通过自动射线照相观察电泳后的切割产物。这里显示了定制设计的 RNA 寡核苷酸和两个体外 RNA 转录本的海因蓝染色聚丙烯酰胺凝胶。请注意，RNA 生产的效率在短、长和中等长度构建体之间有所不同。

RNA 核酸内切酶活性的研究需要阳性阴性对照，以及高度纯化的重组 cas 蛋白。在这个图中。来自梭状芽胞杆菌热池的 CAS 6 样品制备的 SDS 页面凝胶。

热沉淀和镍后，NTA 层析与标准蛋白质标记物一起运行。合适的阴性对照样品应包含不含 CAS six 表达的细胞裂解物，但按照相同的 CAS six 纯化程序，确定 CAS six 制备物具有所需的高纯度。在这里，可以通过自动放射成像观察梭状芽胞杆菌热细胞 CAS six 蛋白切割的 5 个主要末端标记的重复序列底物。

每个泳道都包含放射性标记的底物、与 ca 6 蛋白孵育后的 RNA（如加号所示），或与缓冲液（如负号所示）孵育后的 RNA、长底物或短底物（添加或不添加脱氧核糖核苷酸）。在负 9 位，用于促进核酸内切酶反应。注意，当脱氧核糖核苷酸包含在 RNA 分子中时，短底物没有切割 遵循此程序。

CAS six 核酸酶也可用作生成成熟、清晰 RNA 的工具。这些 RNA 可以掺入级联复合物中，以深入了解参与病毒攻击的干扰。看完这个视频，您应该对如何设计和生产 Cas 和核酸酶的 CRISPR es 底物有很好的了解。

这些不同的底物有助于解决有关 crispr Es 成熟和利用的问题。