Name: 从大鼠脑的解剖脑表面血管及相关脑膜和脉络丛的可视描述， (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学习从大鼠脑解剖脑膜、脑表面血管及脉络丛的方法，用于神经科学研究。该技术可高效分离动脉血管树与脉络丛，通过基因表达分析评估组织完整性，为脑血流和脑脊液稳态研究提供可靠手段。

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本工作由 NCTR/FDA 资助。

尽管视频中未展示，大鼠首先被给予300 mg/kg的戊巴比妥过量注射，3分钟内即进入麻醉状态，随后通过断头法处死。迅速而小心地将大脑从颅骨中取出，并在冰浴的生理盐水中冷却5分钟。在解剖微动脉血管（MAV）之前，让大脑冷却一段时间至关重要，以便将MAV从皮层表面（I层顶部）分离。随后将大脑置于盛有冰浴生理盐水或0.1 M磷酸盐缓冲盐水（pH=7.4）的玻璃培养皿底部，液面深度约为1 cm，并将培养皿置于冰上。大部分解剖操作均在大脑浸没于盐水的条件下进行。
1. 松果体的摘除
<ol>
	<li>将脑组织背侧朝上放置（相对于培养皿底部）。松果体位于小脑前方两个半球之间最尾侧的腹侧区域（即松果体隐窝），紧邻四叠体脑膜表面或略低于该表面。首先使用两把小型弯头镊子摘除松果体。松果体呈粉红色，与大脑皮层颜色相似，但常被脑组织取出过程中残留的血液和血管组织所包裹。</li>
</ol>
2. 去除MAV
<ol>
	<li>将脑组织翻转至“倒置”位置，分离覆盖在脑桥上的椎动脉、较小的动脉及软脑膜，并将其与前脑的软脑膜和血管系统分开。随后开始移除前脑的脑膜血管复合体（MAV）。 
	解剖过程应从腹侧开始，这一点非常重要。 大脑Willis环的主要大动脉，包括大脑中动脉（MCA）和前动脉，结构最为坚固，可作为“支架”，便于随后将软脑膜上的较小表浅动脉和微动脉连同其余的脑膜一起从前脑皮层上剥离。有关大脑表面血管系统的更多图示和细节，请参见Scremin7的综述。</li>
	<li>从一侧大脑半球开始，使用小弯头镊子在颈内动脉分叉后方切断后交通动脉，从而分离前脑中较前部与较后部的动脉分支系统。对对侧大脑半球重复相同操作。</li>
	<li>用镊子夹住大脑中动脉（MCA）和前动脉，轻柔地向腹侧-背侧方向牵拉，使覆盖在腹侧前皮层（梨状皮层、嗅结节）上的MAV越过并绕过嗅束。此操作可移除覆盖在前部皮层（扣带回及眶部皮层）上的大部分MAV。</li>
	<li>将脑组织在培养皿中旋转至45°至90°角。通过夹住大脑中动脉及其伴行动脉，并沿皮层向背侧轻柔牵拉，可将包围外侧皮层区域（颗粒状岛叶、次级体感皮层和听觉皮层）的MAV从皮层上分离。如有必要，可在解剖过程中使用镊子尖端将主要动脉从皮层上抬起并分离。</li>
	<li>现在移除更靠后外侧区域的MAV。（注意：在采集过程中，建议在两个大脑半球之间交替操作，以确保MAV保持低温和湿润状态。此外，若在一侧半球上分离MAV遇到阻力，可暂时切换至对侧半球操作，稍后再返回原半球继续进行。）</li>
	<li>为移除围绕初级体感皮层和运动皮层的最背侧区域的MAV，将脑组织背侧朝上放置（相对于培养皿底部）。最终分离MAV时，可沿矢状窦使用镊子尖端进行操作。 
	采集到的这部分MAV可暂时保存于冰冻生理盐水中，待后续检测与分析使用，或冷冻保存以备后续处理。通常，覆盖在皮层最尾侧/后部区域（内嗅皮层、视觉皮层及最尾侧的听觉皮层）的MAV仍附着于皮层上。在视频后续部分中，将展示如何解剖位于后扣带回皮层与上丘之间的MAV。</li>
</ol>
3. 脉络丛的去除
<ol>
	<li>将脑组织背侧朝上放置，并用较大的镊子固定。将较小的镊子从半球间的中线向下插入，然后用镊子尖端刺穿皮层和胼胝体（约从前囟点后 -3.3 mm 处），进入海马中线的顶部。</li>
	<li>用镊子将皮层连同胼胝体从背侧海马和隔核区域剥离，暴露大部分侧脑室。脉络丛可通过其贯穿全长的主要动脉所呈现的波浪状红线进行定位和识别。使用镊子的两个尖端撬开第三脑室的侧壁，并在其最尾端（约从前囟点后 -4.3 mm 处8）扩大开口。</li>
	<li>使用小镊子，将此端的脉络丛分离取出。然后移至隔核与尾状核/壳核之间的最前部区域（最前端，约从前囟点前 +1.6 mm 处），用镊子扩大该部分脑室并取出脉络丛。对对侧半球执行相同操作，以获取第二个残留的脉络丛。 
	该组织可暂时保存在冰冻生理盐水中，待后续检测与分析使用，或冷冻保存以备后续处理。</li>
</ol>
4. 去除3中的剩余MAVrd 位于丘脑和四叠体上方的脑室，以及皮层更尾侧区域（包括压后皮层、听觉皮层和视觉皮层）上的脑室
<ol>
	<li>从两个半球中完整取出海马体，暴露位于丘脑和上丘上方的软脑膜血管网（MAV）。与大脑皮层上方的MAV相比，此处MAV的去除要容易得多。</li>
	<li>通过夹住覆盖在丘脑前部的较大血管结构，并轻柔地向尾侧牵拉，将这部分MAV游离出来。该血管结构连接上丘网络，为背侧海马体和背侧丘脑网络供血。向尾侧牵拉并逐步松解上丘网络，直至到达尾侧动脉环的最后部分。 
	此时需更加小心地清除颗粒性压后皮层、初级听觉皮层和视觉皮层表面残留的后部腹侧MAV。与之前用于覆盖大脑皮层较前区域的MAV组织相同，该组织可暂时保存于冰冻生理盐水中以待检测与分析，或冷冻保存以供后续处理。若需分别分析，此次获取的任何残留后部腹侧MAV均应移除，并加入先前分离出的覆盖皮层的MAV部分中。</li>
</ol>
5. 代表性结果
当解剖操作正确时，所获得的脑膜血管组织（MAV）应为两个完整的组织块，总重量约为35至45 mg。最初解剖得到的、覆盖大部分皮层的MAV组织重量约为25 mg，而覆盖丘脑、上丘和枕叶皮层的MAV组织重量约为15 mg。由于血管中残留的血液，组织应呈轻微粉红色。所采集的双侧脉络丛应为两个完整的组织样本，每个重量为1至2 mg。尽管在储存或处理前可使用镜头纸等纸巾去除MAV组织上多余的水分，但为了避免组织损失，不建议对解剖得到的脉络丛去除多余水分。图1是通过安捷伦-014879全鼠基因组4x44K 60mer寡核苷酸芯片（G4131F，Agilent Technologies，Palo Alto，CA；NCBI GEO登录号# GPL7294；GSE23093和GSE29733，数据存于NCBI GEO数据库）在对照条件下比较三个脑区（纹状体、顶叶皮层和MAV）基因表达谱而生成的。图中两个散点图分别展示了：1）纹状体与顶叶皮层之间的基因表达差异；2）MAV与顶叶皮层之间的基因表达差异。显然，纹状体与顶叶皮层之间的基因表达谱比MAV更相近。有关脉络丛与MAV之间的表达谱比较数据将在未来发表。然而，MAV与脉络丛之间的基因表达谱很可能比它们与纹状体和顶叶皮层之间的关系更为接近。图2展示了MAV在高热（EIH）与安非他明（AMPH）处理下相对于对照组以及彼此之间的差异基因表达反应。
在对照组动物的MAV中，超过11,000个具有官方NCBI基因符号的基因表达情况被与纹状体和顶叶皮层中的记录数据进行了比较。其中，超过2,000个基因在MAV中的表达水平与这两种富含神经元的组织相比存在2.5倍或更高的差异，550个基因的表达差异超过10倍。这些基因中略高于40%（253个）在MAV中的表达水平降低了10倍或更多，且与神经元功能相关。另有343个基因在MAV中的表达水平相较于顶叶皮层和纹状体高出10倍以上。该基因列表被用作确定在MAV中高度富集基因的起点。表1列出了在MAV中表达水平较顶叶皮层和纹状体高出15倍以上的基因，并根据其功能进行了分类。这些基因中许多与血管系统和/或免疫系统相关。由于MAV本身血管密度增加以及其中存在的血液成分，此类基因的富集程度预计应约为5至10倍。然而，即使对于已知具有普遍血管功能的基因，其表达水平超过15倍的增加也表明在MAV中存在显著富集。此外，还发现一些基因的表达倍数变化非常大，主要包括：1）细胞外基质蛋白（不特指与血管系统相关），2）溶质转运蛋白，以及3）脂质和视黄酸代谢相关基因。同时，生长与分化相关基因或转录因子的数目较少。
<img alt="火山图；log2基因表达；顶叶皮层分析；统计显著性图。" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. MAV与顶叶皮层及纹状体之间基因表达的比较。火山图比较了顶叶皮层与纹状体（上图）以及顶叶皮层与MAV（下图）之间的基因表达水平。红色符号表示在不同脑区之间差异显著（p &lt;0.05）且表达差异达到或超过1.5倍的基因。黑色符号代表在不同脑区之间无显著差异（p &gt;0.05）且表达差异小于1.5倍的基因。粉色符号表示表达差异小于1.5倍但在统计学上显著不同（p&lt;0.05）的基因。黄色符号标识表达差异达到或超过1.5倍但统计学上不显著（p&lt;0.05）的基因。
缩写
AMPH 安非他明 
EIH 环境诱导性高热 
MAV 脑膜及相关脑血管系统 
Norm 正常体温对照组
<img alt="火山图比较3小时时的基因表达差异；log2(p) 与平均 log2 表达量。" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 高温与安非他明对 MAV 基因表达的影响。火山图比较在3小时时间点，MAV在生理盐水、运动诱发的高热（EIH）或安非他明（AMPH）处理后的基因表达水平。红色符号表示差异显著的基因，而黑色点/圆圈代表区域间无显著差异的基因。额外的统计分析用于验证对照组与处理组之间哪些表达差异确实具有统计学显著性。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1in">MAV 表达 脑表达</td>
			<td fo:width="4.5in">NCBI 基因符号</td>
			<td fo:width="1.5in">组织特异性或已报道功能</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Anxa2a, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kla, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, Ogn, Tagln, Thbs2, Tnnt2 </td>
			<td>血管系统与心脏</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Ccl19, Cd74a, Defb1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da</td>
			<td>免疫系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 </td>
			<td>视黄酸与脂质代谢</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Cdh1, Col3a1, Col1a2, Colec12, Cpxm2, Cpz, Dcn, Emp3, Gpc3, Nupr1, Omd, Pcolce, Slamf9, Tmem27, Tspan8 </td>
			<td>细胞外基质与细胞间连接</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Aqp1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr </td>
			<td>离子与溶质稳态</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Alx3, Cdkn1c, Foxc2, Igfbp2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, Osr1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15, Upk1b, Wisp2, Wnt6</td>
			<td>发育与转录调控</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 50倍</td>
			<td>Gpha2, Mfap5, Mpzl2, Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1</td>
			<td>未知与杂项</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Anxa1a, Angpt2, C6a, Gjb2, Ptgis, Thbd, Timp1</td>
			<td>血管系统与心脏</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Casp12, Ccl2, Ccr1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1</td>
			<td>免疫系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Col6a3, Cpxm1, Efemp1, Fmod, Mgp, Nid2</td>
			<td>细胞外基质与细胞间连接</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5</td>
			<td>离子与溶质稳态</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2</td>
			<td>视黄酸与脂质代谢</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Bmp6, Casp12, Dab2, Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b</td>
			<td>发育与转录调控</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30至50倍</td>
			<td>Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim</td>
			<td>未知与杂项</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Adm, Angpt1, Angptl2, Bgn, Cklfa, Cnn1, Cox8h, Ctsk, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, Pros1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnipa, Vamp5, Vtn</td>
			<td>血管系统与心脏</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Adaa, Bst2, Ccl6, Cd40, Cd68, Ctsc, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, Tir4, Tubb6</td>
			<td>免疫系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Adamtsl4, Col1a1, Crb3, Dpt, Egfl3, Fbn1, Fbln1, Fbln5, Fn1, Itgb4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, Ppic, Serpinh1, Timp3</td>
			<td>细胞外基质与细胞间连接</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 </td>
			<td>离子与溶质稳态</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Agpat2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, Rbp4</td>
			<td>视黄酸与脂质代谢</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, Ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3, Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1</td>
			<td>发育与转录调控</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15至30倍</td>
			<td>Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, Cyp1b1, Dse, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, Fmo3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, Mdk, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, Plp2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2</td>
			<td>未知与杂项</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*表中包含的基因在纹状体和顶叶皮层中的表达水平必须均高于15倍，且高于背景水平5倍。每个基因的分组依据是两个比值（MAV/纹状体或MAV/顶叶皮层）中的较低者。
a基因存在于内皮细胞中，但也很可能在介导免疫反应中发挥重要作用。
表1. 与纹状体和顶叶皮层相比，在MAV中表达水平升高15倍*或以上的基因。

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</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。本文所述内容未必代表食品药品管理局的观点。

MAV 和脉络丛解剖的技术细节
在分离中动脉血管（MAV）的过程中，必须始终将脑组织“浸没”在生理盐水或磷酸钠缓冲盐水中。若在解剖过程中使MAV和皮层脱水，会导致MAV紧密黏附于皮层第I层，从而增加随MAV一同收获的皮层组织量，和/或导致无法将黏附的MAV部分从皮层上剥离。此外，解剖过程中需要保持耐心。如果在解剖一侧半球时发现MAV与皮层分离存在阻力，可先转至对侧半球操作，稍后再返回处理存在阻力的一侧。该方法需要一定练习才能熟练掌握，通常需进行约5至15次“练习性”解剖，才能实现稳定且均一的MAV组织收获。从脑底部的动脉环处开始解剖并移除MAV的方法，有助于利用较大的血管结构作为支撑“支架”来去除脑膜。
处死后，MAV 血管系统中大部分原始血液应在解剖过程中被排出，从 MAV 中提取的 RNA 中来源于血液的比例应低于 5%。在断头并取出脑组织之前，可通过组织学技术向动物体内灌注 50 至 70 ml 生理盐水，几乎完全清除血液。然而，这样做会使解剖过程中更难观察到 MAV 组织。MAV 组织中最可能的三种“污染”来源是松果体、大脑皮层第 I 层组织以及残留的嗅球组织，但也可能混入垂体组织。当 MAV 组织中含有直径约 1 至 2 mm 的深红色圆形球状结构时，即可判断存在松果体污染。松果体的主要功能通常被认为与 MAV 完全不同，其主要功能是合成褪黑素，以调节昼夜节律9 的某些方面以及脂质前体的脂氧合10。尽管调控脂氧合酶活性的基因 Lox 曾被认为主要存在于成年个体的松果体中10，但我们的结果表明，该基因在 MAV 中也持续存在且表达水平显著。残留的皮层或嗅球组织污染会导致粉红色网状的 MAV 组织中包裹着一些 1 至 2 mm 的致密组织，这些组织颜色明显更浅。可通过将 MAV 漂浮于缓冲液表面，然后使用两把解剖镊子去除较重的皮层或球状组织来识别并清除此类污染。
如果MAV受到皮层I层组织、下丘脑组织或松果体的污染，则多个基因的表达水平将显著高于“干净”分离样本中的正常水平。若MAV在分离过程中受到松果体污染，会导致芳基烷胺N-乙酰转移酶（Aanat）的表达升高，该酶是褪黑素合成所必需的。遗憾的是，如果在MAV分离过程中发生松果体污染，则无法准确测定MAV中Lox的表达水平。若MAV受到皮层组织污染，会导致神经元特异性基因如海马钙蛋白（Hpca）、小白蛋白（Pvalb）和/或神经元五聚素受体（Nptxr）的表达升高。若MAV受到下丘脑组织污染，则会导致生长激素1（Gh1）和前阿黑皮素原（Pomc）的表达升高。如果采集的组织中确实存在一定程度的污染，大多数这些基因仍可被识别，并在基因表达分析中予以排除。这一点尤其重要，因为某些存在于循环血液中的基因可能仍残留在MAV或脉络丛中。
解读收获的MAV和脉络丛的基因表达数据
大脑表面（浅层）血管系统及其相关的脑膜（MAV）和脉络丛对于脑血流和脑脊液（CSF）稳态至关重要4,11,12,13,14,15,16,17。该组织可用于生化和生理学分析，已有研究表明，通过基因表达分析可发现MAV对苯丙胺和高热所造成的损伤具有敏感性1,2。这些结果与目前已知的严重高热及苯丙胺类物质对脑血管系统普遍影响的情况相符18,19,20。人类临床数据也支持硬膜下血管系统对苯丙胺和甲基苯丙胺损伤敏感的观点21,22。此外，在研究震荡性头部创伤时，包括脑膜软脑膜层在内的大脑主要和次要血管系统（即MAV中所获取的组织）可能具有重要研究价值23,24,25。当前从MAV获得的基因表达谱表明，软脑膜以及可能的蛛网膜脑膜膜在调节脑脊液成分方面所起的作用可能超出预期。未来借助解剖显微镜技术，或许能够进一步分离MAV中的不同组织，从而将软脑膜和蛛网膜与较大的动脉血管分开，甚至可能实现两者之间的分离。这将有助于更准确地解析所获取MAV中这三个组分各自的功能。

<table><tbody><tr><td>生理盐水（9 克氯化钠 / 1 升水）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>内部</td><td></td><td>解剖缓冲液</td></tr><tr><td>0.1 M 磷酸钠 pH 7.4</td><td>内部</td><td></td><td>解剖缓冲液</td></tr><tr><td>骨剪</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>颅骨去除</td></tr><tr><td>镊子弯曲尖端（4&quot; 长 &amp;& 0.8 mm 宽尖端）</td><td>Roboz</td><td>RS-5135 或 RS-5137</td><td>解剖镊子</td></tr><tr><td>镊子-直头（5.5&quot; 长</td><td>Roboz</td><td>RS-8124 或 RS-8104</td><td>拇指敷料镊</td></tr></tbody></table>

大鼠脑表面血管系统及相关脑膜和脉络丛的解剖可视化描述

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

本视频展示了一种获取两种最重要高血管化结构的方法，这两种结构位于大脑实质之外，但对前脑功能具有支持作用。它们分别是大脑表面（浅层）血管系统及其相关脑膜（MAV），以及脉络丛，二者对于脑血流和脑脊液（CSF）稳态至关重要。所获取的组织适用于生物化学和生理学分析，且已有研究表明MAV对苯丙胺和高热所引起的损伤具有敏感性1,2。此外，在研究震荡性头部创伤时，MAV中获取的主要和次要脑表面血管系统也可能具有重要研究价值。本视频中分离的MAV包括脑膜中的软脑膜和部分蛛网膜（较少硬脑膜）以及大脑表面的主要和次要血管结构。所分离的脉络丛为位于侧脑室内的结构，其解剖位置依据Oldfield与McKinley的描述3,4,5,6。该组织获取方法还可便于分离不含脑膜和较大脑表面血管的区域性皮层组织，并可与其他脑组织（如纹状体、下丘脑、海马等）的取材相兼容。两种组织的解剖全过程耗时约5至10分钟。本视频中所展示和描述的MAV与脉络丛的基因表达水平数据可在NCBI GEO数据库中获取，编号分别为GSE23093（MAV）和GSE29733（脉络丛）。这些数据已被并正在被用于进一步阐明MAV和脉络丛的功能机制，以及严重高热和苯丙胺（AMPH）等神经毒性事件如何对其功能产生不利影响。

本视频展示了一种收获支持前脑功能的两种最重要高血管化结构的方法。这两种结构分别是大脑表面（浅层）血管系统及其相关脑膜（MAV），以及脉络丛，它们对于脑血流和脑脊液（CSF）稳态至关重要。

本视频旨在展示一种获取两种最重要且高度血管化的结构（非脑内结构）的方法……

本实验的总体目标是高效且快速地分离覆盖在前脑皮层和中脑、丘脑以及胼胝体表面的脑膜软膜层和蛛网膜部分及其相关的动脉血管系统，同时从侧脑室中采集脉络丛组织。该目标通过以下步骤实现：首先，移除松果体，并将包裹前脑的脑膜及动脉树状结构分离；其次，从腹侧的威尔斯环开始，仔细清除皮层表面的动脉和小动脉，然后逐步向背侧皮层表面推进，使软膜及残留的蛛网膜尽可能与血管系统保持附着，同时确保最大限度减少邻近皮层表面组织的采集。接下来，将皮层和连合纤维从隔区和海马体上分离，暴露侧脑室，以便采集脉络丛。最后，移除海马体，暴露丘脑和中脑胼胝体。随后解剖该区域表面的脑膜及其相关血管结构。最终，通过比较这些区域各自的基因表达谱，可以确定分离出的脑膜及其相关动脉血管以及脉络丛的完整性和特异性。该方法有助于回答与支持脑功能的血管系统相关的研究中的关键问题，包括脉络丛与脑膜及其相关动脉血管在血流、脑脊液功能、神经毒性损伤和脑外伤等方面的功能相似性、比较及差异。开始本实验方案时，将安乐死后立即取出的大鼠脑组织置于冰上预冷的生理盐水中，持续五分钟。在解剖前让脑组织冷却足够的时间至关重要，以便能够将脑表面的四层脑膜及其相关的动脉血管系统（MAV）从大脑皮层表面分离。接下来，将脑组织放入一个置于冰上的玻璃培养皿底部，培养皿中加入一厘米深的冰上预冷的生理盐水或 pH 7.4 的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）。所有解剖操作均应在脑组织大部分浸没于生理盐水的条件下进行。开始解剖时，将脑背侧朝上置于培养皿中，找到位于两半球之间最尾侧腹区的松果体，其位置紧邻小脑前方，且位于脑膜表面或稍下方。在丘脑上方，使用两把小型弯头镊子摘除松果体。注意松果体呈粉红色，与皮层颜色相似，但通常周围残留有脑组织取出时留下的血液和血管组织。接下来，将培养皿中的脑组织翻转至背面向上。然后分离覆盖在脑桥上的椎动脉、细小动脉以及脑膜与前脑的脑膜和血管结构。随后，开始移除MAV。在解剖过程中，首先应从腹侧开始，处理大脑动脉环的主要动脉，包括大脑中动脉和大脑前动脉。接着，从一侧半球开始，使用小弯头镊子在颈内动脉连接处后方切断后交通动脉，从而分离前脑的前部和后部动脉分支。然后对对侧半球重复相同的操作过程。现在用镊子夹住大脑中动脉（MCA）和前动脉，轻轻向腹侧前方向牵拉，使覆盖在腹侧前皮质的软脑膜血管网（MAV）被抬起并翻转至嗅束上方。这样可去除覆盖前皮质的大部分MAV。将脑组织在培养皿中旋转至与水平面呈45至90度角，以便松解围绕外侧皮质区域的MAV中外侧且更靠前的部分；夹住MCA及其伴行动脉，沿皮质表面轻柔地向背侧牵拉。如有必要，可在解剖过程中使用镊子的尖端抬起并分离皮层中的主要动脉。现在，移除 MAV 更靠后方的外侧区域。请注意，在此收获过程中，最好在两个半球之间交替操作，以确保 MAV 保持低温和湿润；如果在分离 MAV 与皮层时遇到任何阻力，也应切换至另一侧半球。最后，为了去除覆盖初级躯体感觉皮层和运动皮层的脑膜血管（MAV）最背侧区域，将脑组织背侧朝上，用镊子沿矢状窦末端分离该部分脑膜。采集到的这部分MAV可暂时保存在冰冻生理盐水中，待后续检测与分析时使用，也可冷冻保存以备后续处理。通常，覆盖大脑皮层最尾侧区域的MAV仍会保持附着状态。其去除过程将在本视频的后续部分展示。要移除脉络丛，首先将脑组织背侧朝上放置，并用较大的镊子固定。然后将较小的镊子沿半球间的中线向下推进，利用镊子尖端刺穿皮层和胼胝体，进入海马中线的顶部。接下来，使用镊子将带有胼胝体的皮层从背侧海马和隔区拉开，以暴露大部分侧脑室。脉络丛可通过其全长走行的主要动脉所呈现的波浪状红线进行定位和识别。使用镊子的两端撬开第三脑室的侧壁，并在其最尾端将其扩大。然后使用小镊子将脉络丛的这一端游离出来。接着，用镊子扩大隔区与尾状壳核区域之间的最前部，并在此端也将脉络丛完全游离。同样地，在对侧半球重复相同操作，以获取第二个残留的脉络丛。同样，该组织可暂时保存在冰上、冷盐水中，或冷冻以备后续处理。为去除覆盖在皮层最尾侧区域的残留脑膜血管（MAV），首先需将双侧半球的海马体完全移除，从而暴露丘脑和顶盖上方的MAV。需要注意的是，与从皮层去除MAV相比，去除这部分MAV的难度将显著降低。通过抓握覆盖在丘脑前部的较大血管，并轻柔地向外牵拉，该血管与上脑室周围网络相连，为背侧海马和背侧丘脑网络供血。继续轻柔牵拉，最终可松解上脑室周围网络，从而到达尾状动脉环的最后部分。此时需更加小心，以清除颗粒样后直线初级听觉皮层和视觉皮层表面残留的任何微小动脉血管（MAV）。若在获取第二部分丘脑和胼胝体MAV组织时同时收获了任何残留的后腹侧皮层MAV组织，应将其去除，并加入此前分离的第一部分皮层MAV组织中，以便分别进行分析。接下来，为在对照条件下比较纹状体、顶叶皮层与MAV区域之间的基因表达谱，可采用Agilent 0 1 4 8 7 9全大鼠基因组4×44,060 mer寡核苷酸芯片进行基因表达分析。有关样本处理、扫描及初始数据存储的更多细节可参见Thomas等人的研究。当解剖操作正确执行时，所获得的 MAV 组织应为两个完整的部分，总重量约为 35 至 45 毫克。最初解剖得到的、覆盖大部分皮层的 MAV 组织重量应约为 25 毫克，而覆盖丘脑、胼胝体和枕叶皮层的 MAV 组织重量应约为 15 毫克。组织因血管中残留的血液而呈现微粉红色。采集的双侧脉络丛应为两份完整的组织样本，每份重约一至二毫克，如图所示。此处展示了在对照条件下纹状体、顶叶皮层和 MAV 的基因表达谱比较。上方图表显示了纹状体与顶叶皮层相比的基因表达情况。下方图表显示了MAV与顶叶皮层相比的基因表达情况，可以看出，纹状体与顶叶皮层之间的基因表达关系比MAV与顶叶皮层之间更为接近。此处我们观察到MAV在高热条件下相对于对照组、安非他明处理相对于对照组，以及高热相对于安非他明处理时的差异性基因表达情况。最后，此处显示的是与顶叶皮层和纹状体相比，在MAV中表达水平高出15倍以上的基因，这些基因按其功能进行了分类。这些基因中的许多与血管系统和/或免疫系统相关。其他具有显著高倍数变化的基因包括细胞外基质蛋白、溶质转运蛋白，以及脂质和视黄酸代谢相关基因。在进行该操作时，需要注意在解剖 MAV 时保持耐心。在整个解剖过程中，必须始终使脑组织浸没在等渗盐水或磷酸盐缓冲盐水之中。此外，建议在获取用于产生实验数据的组织之前，先在四到五只大鼠身上练习 MAV 的切段操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从大鼠脑的解剖脑表面血管及相关脑膜和脉络丛的可视描述，

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