Name: 核糖体RNA的蚊子肠道宏基因组RNA-seq的枯竭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学习从蚊子肠道样本中去除核糖体RNA以富集信使RNA的宏基因组RNA-seq方法。该方案使用特异性rRNA探针实现90-99%的去除率，为微生物群落功能研究提供高质量数据。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1SC2GM092789-01A1的支持，MS是新墨西哥州立大学霍华德·休斯医学研究所本科生研究项目的科研学者。该视频由Amy Lanasa执导并制作，由Philip Lewis博士与新墨西哥州立大学创意媒体研究所协调完成。

实验步骤
1. 蚊虫饲养
<ol>
 <li>在昆虫饲养室中，以 27.5 °C、80% 湿度及 12:12 小时光暗循环的条件饲养冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）G3 品系。</li>
 <li>使用研磨的猫粮与啤酒酵母按 1:1 比例混合喂养幼虫。</li>
 <li>在成蚊羽化后第 3 天，通过小鼠血液饲喂以促进产卵。</li>
</ol>
2. 蚊子肠道解剖
<ol>
 <li>对解剖工具（载玻片和镊子）进行高压灭菌。</li>
 <li>使用吸虫器收集 50 只蚊子，并将其置于 CO2 气流工作台（Ultimate Flypad）上。将蚊子标本依次在三个盛有 70% 乙醇的培养皿中清洗，以清洁蚊子体表。</li>
 <li>将标本置于体视显微镜下的玻璃载玻片上，取出肠道。</li>
 <li>每种条件下收集 50 份肠道用于宏基因组 DNA 提取；每种条件下另收集 50 份肠道用于宏基因组 RNA 提取。</li>
</ol>
3. 宏基因组DNA提取
注意：使用 Meta-G-Nome DNA 提取试剂盒（Epicentre Biotechnologies）提取宏基因组 DNA，并采用下述修改方法。
<ol>
 <li>将50个蚊虫肠道组织置于300 μl TE缓冲液中，在冰上使用Bio-Gen PRO200匀浆器（PRO Scientific Inc, USA）以2,000 rpm的速度匀浆1分钟。</li>
 <li>向细胞悬液中加入2 μl Ready-Lyse溶菌酶溶液和1 μl RNase A，涡旋混匀后于37 °C孵育30分钟。</li>
 <li>向管中加入300 μl Meta-Lysis溶液（2X）和1 μl蛋白酶K，涡旋混匀。短暂脉冲离心以确保所有溶液均位于管底，于65 °C孵育15分钟，冷却至室温后置于冰上3–5分钟。</li>
 <li>向管中加入350 μl MPC蛋白沉淀试剂，剧烈涡旋混匀10秒。</li>
 <li>在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟，沉淀杂质。</li>
 <li>将上清液转移至一个新的洁净2 ml离心管中，弃去沉淀。</li>
 <li>向上清液中加入570 μl异丙醇，反复倒置混匀数次。</li>
 <li>在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟沉淀DNA，小心去除异丙醇，避免扰动DNA沉淀。</li>
 <li>加入500 μl 75%乙醇洗涤沉淀。在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟，小心去除乙醇，避免扰动DNA沉淀。室温下空气干燥沉淀2分钟。注意：切勿过度干燥DNA沉淀。</li>
 <li>将DNA沉淀重悬于50 μl TE缓冲液中。</li>
 <li>通过1%琼脂糖凝胶电泳，将所提取的DNA与试剂盒中提供的Fosmid对照DNA（40 kb；100 ng/μl）进行比对，以验证DNA片段大小。</li>
</ol>
4. 总RNA提取
注意：使用 RNaseZap 清洁工作区域，以尽量减少 RNase 污染。采用 TriPure 提取试剂（Roche）并稍作修改，从蚊虫肠道样本中分离宏基因组 RNA。
<ol>
 <li>将50只蚊子肠道放入含有500 μl TriPure Isolation Reagent的2 ml离心管中。在冰上使用匀浆器以2,000 rpm的速度匀浆1分钟。室温静置5分钟，使核蛋白复合物解离。</li>
 <li>加入100 μl氯仿，涡旋振荡12秒，室温静置2分钟。</li>
 <li>在10,000 × g下离心10分钟。小心取出离心管，避免扰动已分离的相层。</li>
 <li>将水相转移至新离心管中，加入250 μl异丙醇，充分混匀后置于-20 °C下20分钟。</li>
 <li>在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，沉淀RNA。</li>
 <li>弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用750 μl 75%乙醇洗涤沉淀。</li>
 <li>用移液器吸除上清液，避免扰动沉淀。将离心管室温晾干2分钟。</li>
 <li>用30 μl无核酸酶水重悬RNA。</li>
 <li>在37 °C下用DNase处理总RNA 20分钟，随后在75 °C孵育15分钟以灭活DNase。用乙醇沉淀RNA，并将RNA重悬于30 μl无核酸酶水中。</li>
 <li>使用NanoDrop测定总RNA的浓度。</li>
</ol>
5. 核糖体RNA去除
注意：本实验方案基于先前描述的方法12,13,15开发。
<ol>
 <li>核糖体RNA基因片段的PCR扩增 
此步骤可生成样本特异性的rRNA文库，将用作后续反应的模板 体外 转录生成与总RNA样本中的rRNA互补的反义核糖体RNA（arRNA）探针。
 <ol>
 <li>设计并合成用于rRNA片段PCR的引物组表1). </li>
 <li>使用 Taq DNA 聚合酶（Qiagen）进行 50 μl 反应体系的 PCR，包含 50 ng DNA 模板、1 × PCR 缓冲液、1.5 mM Mg2Cl，0.2 μM 引物，进行 35 个循环：94 °C 变性 10 秒，40 °C 退火 15 秒（用于细菌 23S 扩增子）或其他扩增子在 50 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 1 分钟（最后在 72 °C 延伸 5 分钟）。</li>
 <li>在1%琼脂糖凝胶上观察PCR产物。 </li>
 <li>使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，用50 μl洗脱缓冲液洗脱。使用NanoDrop测定浓度。 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>体外 生物素标记的反义rRNA探针（arRNA）的转录。 
 注：此步骤中，使用MEGAscript T7试剂盒，从不同rRNA扩增子合成特异性探针。 
 <ol>
 <li>为每个样本特异性的rRNA扩增子建立一个20 μl的反应体系，混合以下组分（表237 °C 下孵育过夜。 注意： 通常反应产率 &gt;50 μg RNA </li>
 <li>加入1 μl DNase I（试剂盒提供），37 °C孵育20分钟，以去除DNA模板。 </li>
 <li>加入100 μl 100%乙醇至反应体系中，于4 °C、12,000 × g离心10分钟以沉淀合成的arRNA。弃上清，用750 μl 75%乙醇洗涤沉淀。将RNA探针重悬于50 μl无核酸酶水中。</li>
 <li>使用 NanoDrop 测定 RNA 浓度。探针于 -80 °C 保存。 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>使用生物素标记的arRNA进行rRNA去除。 
 注意：该步骤利用生物素标记的arRNA与总RNA样本中的rRNA杂交。rRNA与arRNA形成的杂交体通过链霉亲和素包被的磁珠被捕获。本操作基于参考文献13中描述的方案，并进行了 minor modification。 
 <ol>
 <li>试剂 
 <ol>
 <li>配制 0.1 N NaOH、含 20% 甲酰胺的 20X 氯化钠-柠檬酸盐（SSC）及 1X SSC。 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>杂交 
 <ol>
 <li>将1 μg总RNA与细菌16S和23S探针（各0.75 μg）、蚊子18S和28S探针（各0.75 μg）、1 μl RNase抑制剂、2.5 μl 20X SSC缓冲液、10 μl 100%甲酰胺加入200 μl PCR管中，用无核酸酶水定容至50 μl。 </li>
 <li>将反应管放入热循环仪中，在70 °C孵育5分钟以打开二级结构，然后以每1分钟降低5 °C的梯度从70 °C逐步降温至25 °C，使rRNA与arRNA探针充分杂交。 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>去除rRNA 
 <ol>
 <li>将300 μl包被链霉亲和素的磁珠转移至1.7 ml离心管中。将离心管置于磁力分离架上，固定磁珠。吸除上清液。加入300 μl 0.1N NaOH重悬磁珠，并充分混匀。将离心管重新置于磁力分离架上，用移液器吸除上清液。加入300 μl 1X SSC缓冲液重悬磁珠，充分混匀，固定磁珠后吸除上清液。再用300 μl 1X SSC缓冲液重复洗涤一次。 </li>
 <li>在1.7 ml离心管中分装3份磁珠，每份100 μl。将离心管置于磁力架上，用移液器吸除上清液。注意：这些磁珠分装液用于3轮捕获生物素化的rRNA-arRNA杂交体。 </li>
 <li>加入50 μl含20%甲酰胺的1X SSC至50 μl杂交反应体系中。将反应液转移至第一管珠子分装管中，充分混匀。室温孵育10分钟，使生物素标记的探针-rRNA杂交体被链霉亲和素磁珠捕获。孵育期间每2分钟轻弹管壁一次以混匀。 </li>
 <li>将试管置于磁力架上以固定磁珠，移除上清液并转移至第二份磁珠中，充分混匀后按上述条件孵育。通过将上清液转移至第三管磁珠中进行第三次捕获，混匀并孵育。 </li>
 <li>将非rRNA上清液转移至新离心管中，使用RNeasy MinElute试剂盒按照生产商说明书进行纯化，以去除甲酰胺。 </li>
 <li>使用安捷伦RNA 6000 Pico芯片试剂盒在生物分析仪上检测rRNA去除效率图4). </li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
注意：如有需要，核糖体RNA（rRNA）去除后的RNA样本可进行mRNA扩增8。

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181(2012).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li>
<li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447(2011).</li>
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<li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li>
<li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+mRNA+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li>
<li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li>
<li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767(2011).</li>
<li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li>
<li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+%28L.%29+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li>
<li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li>
<li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analyses%3A+past+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401(2009).</li>
<li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

蚊虫肠道生态系统中栖息着一个复杂的微生物群落14,16,17。宏转录组测序（RNA-seq）可通过检测整个微生物转录组来揭示依赖于特定环境的功能信息4,18。从技术上讲，由于原核生物mRNA缺乏稳定的多聚（A）尾，因此无法使用寡核苷酸-d(T)介导的方法对mRNA进行富集。替代策略是采用核糖体RNA（rRNA）去除法来实现mRNA的富集。本文中，我们开发了一种基于减法的rRNA去除方案，所用rRNA探针由蚊虫肠道微生物群落自身的宏基因组DNA制备而来。rRNA的去除效率取决于rRNA PCR扩增产生的rRNA捕获探针的覆盖范围。针对保守区域设计的不同引物组合，其退火效率在不同分类群之间存在差异19。因此，我们建议在宏基因组样本上尝试多种引物组合，然后将获得的rRNA产物混合，以最大化探针覆盖范围。在本实验流程中，我们通过组合两种正向引物和两种反向引物扩增得到的rRNA PCR产物来构建捕获探针，共形成4种引物组合（表1）。此外，rRNA倾向于形成二级结构。与全长rRNA作为探针相比13，较小的rRNA片段形成二级结构...

新一代测序技术通过评估微生物群落的分类组成和遗传功能，极大地推动了宏基因组学的研究。RNA测序（RNA-Seq）1 能够绕过基于培养的方法，在不同背景下研究微生物的宏转录组 2-5。微生物RNA-seq面临的主要障碍在于信使RNA（mRNA）富集困难，因为原核生物的mRNA并不稳定地发生多聚腺苷酸化。因此，寡聚dT介导的mRNA富集方法不适用。去除高丰度的核糖体RNA（rRNA）是富集mRNA的替代策略。已有多种商用rRNA耗竭试剂盒用于去除rRNA，例如Microexpress Bacterial mRNA Enrichment kit（Ambion）、RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (Bacteria)（Life Technologies）以及mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation kit（Epicentre），这些试剂盒利用外切酶优先降解rRNA 6-8。然而，Microexpress或RiboMinus中的捕获探针仅适用于去除典型革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中已知的rRNA（参见厂商说明书），对未知微生物的rRNA兼容性较差。因此，这些方法在宏基因组样本中的去除效率可能较低 8-10。此外，使用外切酶处理时，mRNA丰度的保真性也存在疑问 11。总体而言，在宏基因组研究背景下，基于减法原理的rRNA耗竭方法在mRNA富集过程中偏倚更小、效率更高 10-13。
蚊虫肠道容纳着一个动态的微生物群落14。我们希望通过RNA-Seq技术来表征蚊虫肠道微生物组的功能。从蚊虫肠道中分离的RNA样本中，同时含有蚊虫和微生物的RNA。本文介绍了一种经过改进的实验方案，利用针对特定群落的rRNA探针，通过减法杂交高效去除蚊虫和微生物的rRNA。最终获得的mRNA富集样本适用于RNA-Seq分析。整体实验流程如图1所示。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Meta-G-Nome DNA 提取试剂盒</td><td>Epicentre</td><td>MGN0910</td><td>宏基因组DNA提取</td></tr><tr><td>TriPure </td><td>罗氏</td><td>11667165001</td><td>宏转录组RNA提取</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>体外合成RNA探针</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>无RNase工作区 </td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>罗氏</td><td>11388908910</td><td>体外RNA合成</td></tr><tr><td>Biotin-11-CTP</td><td>罗氏</td><td>4739205001</td><td>体外RNA合成</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>NEB</td><td>S1420S</td><td>rRNA 杂交体的捕获</td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>NEB</td><td>S1506S</td><td>rRNA 杂交体的捕获</td></tr><tr><td>RNeasy mini试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>纯化差减RNA</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>去除DNA污染 </td></tr><tr><td>安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>安捷伦科技公司</td><td>5067-1513</td><td>RNA电泳图谱</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Bio-Gen PRO200 匀浆器</td><td>PRO Scientific</td><td>01-01200</td><td>蚊虫肠道组织匀浆制备</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>DNA &amp;和 RNA 定量</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>安捷伦科技公司</td><td>G2940CA</td><td>RNA电泳图谱</td></tr></tbody></table>

蚊虫肠道宏基因组rna-seq中核糖体rna的去除

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

蚊虫肠道在昆虫生命周期的不同阶段均容纳着动态变化的微生物群落。对肠道微生物群落的遗传潜力和功能特性进行表征，有助于揭示肠道微生物组对蚊虫生活特征的影响。宏基因组RNA-Seq已成为分析微生物群落中多种微生物转录组的重要工具。信使RNA通常仅占总RNA的1-3%，而核糖体RNA（rRNA）约占90%。由于大多数原核生物的mRNA缺乏稳定的poly(A)尾，难以从宏基因组微生物RNA样本中富集信使RNA，这使得依赖寡核苷酸dT介导的mRNA分离方法不可行。本文描述了一种利用样本来源的rRNA捕获探针从宏基因组总RNA样本中去除rRNA的实验方案。首先，从小份宏基因组群落DNA样本中扩增蚊虫及微生物的小亚基和大亚基rRNA片段；随后，合成针对该群落特异性的生物素标记反义核糖体RNA探针。 体外 使用T7 RNA聚合酶。将生物素标记的rRNA探针与总RNA进行杂交。杂交产物通过链霉亲和素包被的磁珠捕获并从总RNA中去除。该基于减法的实验方案可高效去除总RNA样本中的蚊虫及微生物rRNA。富集mRNA后的样本进一步用于RNA扩增和RNA测序。

该方案包括三个部分：（1）制备用于rRNA PCR的宏基因组DNA模板；（2）制备样本特异性的rRNA捕获探针；（3）通过减法杂交去除总RNA中的rRNA。高质量宏基因组DNA和RNA的提取是整个流程的关键。经改进的Meta-G-Nome DNA提取方案可从蚊虫肠道中获得高质量的宏基因组DNA，如图2所示。从蚊虫肠道中提取高质量的总RNA通常具有挑战性，这可能是由于蚊虫肠道中存在多种酶，包括RNase。我们比较了Qiagen RNA提取试剂盒与Roche TriPure在总RNA提取中的表现。Agilent Bioanalyzer分析的电泳图显示，使用TriPure提取的总RNA具有清晰的rRNA峰（图3），而使用Qiagen试剂盒获得的RNA则无此特征。这可能是因为TriPure中的苯酚能有效灭活来源于蚊虫的RNase。通常，50只蚊虫肠道可获得约20 μg总RNA。当前rRNA去除流程的理想总RNA投入量约为1 μg，该用量可优化rRNA去除效率，并获得约150 ng纯化RNA。图4展示了rRNA去除前后RNA电泳图的对比。rRNA...

开发了一种核糖体RNA（rRNA）去除方案，用于富集蚊虫肠道元转录组RNA测序中的信使RNA（mRNA）。该方案利用来自蚊虫及其肠道微生物的样本特异性rRNA探针，通过扣除法去除rRNA。该方案的实施效果可实现约90-99%的rRNA去除率。

蚊虫肠道宏基因组RNA-seq中核糖体RNA的去除

蚊虫肠道在昆虫生命周期的不同阶段容纳着动态变化的微生物群落。对这些微生物群落遗传潜能的表征……

大家好。我是来自新墨西哥州立大学生物学系Xenon Zu博士实验室的Fana Kla。我们正在开展蚊子肠道生态系统宏基因组学的研究。今天我们将演示一种A流程，用于从总RNA样本中去除核糖体RNA，以富集RNA-Seq所需的信使RNA。RNA-Seq是一种广泛用于研究微生物群落功能的技术。首先，我将向您演示如何从肌肉肠道中分离总RNA和宏基因组DNA。冈比亚按蚊在昆虫饲养室中进行培养。蚊子首先饲喂糖餐，随后雌性蚊子通过小鼠吸血以产生乙酰胆碱酯酶（ACHE）。这些蚊子以糖类为食，并通过小鼠血液进行饲喂。在操作之前，所有解剖工具和载玻片均已灭菌。将蚊子置于培养皿中，用70%乙醇表面清洗三次，然后放回玻璃载玻片上使乙醇挥发干燥，再将蚊子转移至另一张玻璃载玻片，并加入一滴无菌1×PBS溶液。随后轻轻取出肠道。将分别利用蚊虫肠道组织提取宏基因组DNA和总RNA。在开始RNA相关操作前，必须采取标准预防措施，保持无RNase的环境，佩戴手套，并使用RNase清除剂清洁工作区域、移液器及所有必需的实验器材，以避免RNA降解。在实验开始前，收集50个肠道样本，并将其置于含有PU试剂的1.5毫升离心管中。为了进行总RNA分离，基因组DNA则使用宏基因组DNA提取试剂盒从另一批50个肠道样本中分离获得。RNA或DNA的浓度使用NanoDrop测定。我们采用RNA扣除法从总RNA样本中去除核糖体RNA。首先，从肠道样本中提取的基因组DNA中通过PCR扩增出特异性的RRNA片段。使用Qiagen PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。在此步骤中，使用T7 RNA聚合酶合成反义RRNA探针。使用第一步得到的PCR产物以及生物素标记的CTP和UTP进行反应，然后在37摄氏度下孵育过夜。此时，反义rRNA探针已准备好用于rRNA去除。该步骤采用生物素标记的 rRNA 探针捕获总 RNA 样本中的目标 rRNA，即目标 rRNA 与 rRNA 探针。杂交产物随后被链霉亲和素包被的磁珠捕获。在 PCR 管中配制杂交反应体系，并于 70 摄氏度的热循环仪中孵育 5 分钟。然后将温度降至25摄氏度。在反应进行的同时，为允许rRNA杂交，准备磁珠。首先，分成三份等量样品。每管使用 100 微升珠子。用 1×SSC 溶液洗涤珠子三次。然后将试管置于冰上。反应完成后，加入100 µL含20%甲酰胺的1×SSC缓冲液进行稀释。将反应液转移至含有磁珠的离心管中，充分混匀后，室温孵育10分钟。轻轻 flick 载体管数次，短暂离心后置于磁力架上。将上清液转移至收集管中。再用 100 µL 洗涤液分别洗涤磁珠两次。加入一种XSSC缓冲液溶液，充分混匀，然后将磁珠置于磁力架上重新捕获。将上清液转移至收集管中。现在，离心管中已有核糖体RNA（rRNA）耗竭的RNA样本。使用Qiagen的RN easy minikit进行纯化。根据说明书操作，现在我们正在检测耗竭效果。将RNA样品加载到Agilent RNA 6,000 PICO芯片上，并使用2100生物分析仪进行检测。在扣除之前，出现了两个核糖体RNA峰，分别为16 s和23 s。扣除后，核糖体RNA峰被有效去除。剩余RNA的片段大小范围为200个碱基对至4千碱基。现在，该RNA样本可用于构建cDNA文库以进行转录组测序。我们刚刚为您演示了如何富集用于RNA测序的信使RNA。感谢观看我们的视频。

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核糖体RNA的蚊子肠道宏基因组RNA-seq的枯竭

来源：Liu, X., et al. 使用抗生素处理蚊子的细菌口服饲喂实验。 J. Vis. Exp.

在成年蚊子中建立明确的肠道细菌群落

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一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

以囊性纤维化气道为例，该论文提出了一套综合性的实验流程，结合宏基因组学和宏转录组学方法，用于表征与动物相关的样本中的微生物和病毒群落。...

纯化不纯：从复杂的动物相关样本中测序宏基因组和宏转录组

本文提供了一种通过实时PCR定量沿海沉积物中细菌16S rRNA基因及其转录本的实验方案。该方法包括DNA和RNA的共提取、无DNA污染的RNA制备，以及通过反转录定量PCR（RT-q-PCR）对16S...

从沿海沉积物中同步提取DNA和RNA以及通过实时PCR定量16S rRNA基因与转录本

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae...

通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

通过下一代16S rRNA扩增子测序对蜱微生物组进行表征

本文介绍了一种研究单个蚊虫肠道细菌作用的实验方案，包括蚊虫中肠可培养微生物的分离与鉴定、使用抗生素清除蚊虫肠道细菌，以及重新引入一种特定的细菌物种。...

一种利用抗生素处理蚊子的细菌口服喂养实验方法

本方案从动物和人类受试者的粪便样本中分离高质量的总RNA。采用商业化的miRNA提取试剂盒，并进行了重要改进，以获得优化产量和质量的高纯度RNA。所提取的RNA适用于大多数下游RNA分析，如测序、微阵列和逆转录PCR（RT-PCR）。...

粪便（微）RNA 提取

本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。...

细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

蚊子体内的微生物群落在媒介生物防控策略中具有广阔的应用前景。大多数共生微生物无法通过培养获得，因此需要进行宏基因组分析。本文介绍一种解剖雌蚊并分离卵巢、中肠和唾液腺的方法，可有效防止交叉污染，有助于在器官水平上开展微生物组研究，并加深对微生物在蚊子生物学中作用的理解。...

蚊子卵巢、中肠和唾液腺的解剖以进行器官水平的微生物组分析

学习从蚊子肠道样本中去除核糖体RNA以富集信使RNA的宏基因组RNA-seq方法。该方案使用特异性rRNA探针实现90-99%的去除率，为微生物群落功能研究提供高质量数据。

蚊虫肠道宏基因组RNA-seq中核糖体RNA的去除

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