基于微流控的电趋性用于按需定量分析 秀丽隐杆线虫运动

本实验的总体目标是，在化学物质暴露或基因操作后，识别秀丽隐杆线虫（C. elegans）模式生物中神经元及神经肌肉信号传导的异常。该目标首先通过设计并蚀刻微通道图案至硅晶圆上实现。在第二步中，利用硅模具从聚二甲基硅氧烷（PDMS）中复制出一个或多个微通道。

然后将辅助组件连接到PDMS模具上。接下来，使用安装在显微镜上的相机记录线虫在刺激下游过微通道时的行为。最终，通过电微流控技术检测由于化学或遗传操作引起的线虫神经系统和肌肉系统的变化，以运动行为作为读出指标。

因此，与现有技术（尤其是基于培养板的行为检测方法）相比，该技术的主要优势在于能够精确控制线虫的运动方向，从而实现对运动行为（如身体弯曲频率、旋转时间以及游泳速度）的精确定量分析。该技术的应用前景可延伸至帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗领域，因为它可用于筛选具有神经保护特性的化学因子和遗传因子。我们最初产生这一技术构想，是源于意识到目前尚缺乏一种能够以定量方式分析线虫运动行为的方法。

运动是自主且随机的，难以表征。因此，我们希望建立一种简单易学的方法，让每个人都能掌握。首先，将一片三英寸的硅片分别浸入丙酮和甲醇中各30秒，然后用去离子水冲洗5分钟，以制备主模具。

接下来，使用氮气吹干枪吹干晶圆表面，然后将晶圆置于加热板上，在120摄氏度下加热两分钟后，以50瓦功率对硅晶圆表面进行一分钟的等离子体氧化处理。现在取3毫升SU-8 100光刻胶，在晶圆表面以1,750 RPM的转速旋涂40秒，随后将涂覆好的晶圆置于加热板上，在65摄氏度下进行预烘。10分钟后，用两分钟时间将温度升至95摄氏度，并继续烘烤一小时。

从热板上取下晶圆后，将所需设计的光刻掩模覆盖在晶圆上。用紫外光照射光刻胶 95 秒。然后将晶圆放在热板上进行后烘，后烘的温度梯度与前烘所用的相同。

将晶圆浸入SU-8光刻胶中。显影10至15分钟。用异丙醇冲洗晶圆，以确认图形显影已完成。

然后用去离子水冲洗 30 秒。最后用氮气枪吹干晶圆，并在 120 摄氏度下短暂烘烤。现在，将制备好的母模和一片空白硅胶晶圆分别放入两个铺有铝箔的培养皿中。

将20毫升PDMS预聚物倒入主模具盘中，15毫升倒入空白晶圆盘中。接着，用一次性木质涂布棒轻轻按压晶圆，以消除晶圆下方可能存在的气泡，然后盖上两个培养皿，静置一天使其固化。晶圆固化后，移去锡箔，剥离PDMS。

然后使用2.5毫米Harris打孔器，在PDMS微通道两端（来自母模）打孔以形成流体通路。将两片PDMS圆片切成尺寸相近的条状。随后在洁净室中，将微通道、空白PDMS条带和一片玻璃载片放入等离子氧化仪中进行处理。

将材料置于40瓦功率的氧气等离子体中处理40秒。随后将通道片和玻璃载玻片分别粘附到空白条的两侧，并将材料放置一旁以完成键合。两小时后，在120摄氏度的加热板上使用PDMS预聚物将两段至少六英寸长的塑料管连接到打孔后的储液孔上。

继续操作前，让PDMS充分固化。然后将一个流体塑料接头粘附在其中一根管子上，以便连接注射器。接着，将长约3英寸的22号绝缘铜导线插入每个储液池中位于进样管与微通道之间的位置，并用更多的PDMS预聚物固定导线。

将刚组装好的微通道置于显微镜的XY可移动载物台上，显微镜需配备连接至显示器的摄像头，并将电源连接至微通道的电极。确认微通道的电阻约为0.6兆欧后，将微通道的出口管连接至一次性注射器。随后，将入口管的管口浸入含有悬浮在M9生理缓冲液中的线虫的溶液中。

在注射器内施加负压，以将液体吸入通道中。当进样管和出样管均充满液体后，断开注射器并保持静水压。通过调节进样管和出样管的相对高度来控制流速，使线虫位于通道中央。

然后将两根管子平放至相同高度，以维持微通道内无流动状态。在趋电性实验中更换线虫样品时，当进样管已调节至同一水平高度后，若仍存在流动，可微调两根管子之间的相对高度。若对流动是否真正为零存在疑问，可通过改变电场极性使线虫运动方向发生反转，随后评估其转向时的线性速度，以判断流动状态。

现在将电源调至适当的电压。启动电信号，并给予线虫一分钟的预暴露时间以适应电场，此时线虫应开始向阴极移动。一分钟后，开始记录。

实验结束后，将通道中的所有液体和线虫移除。用去离子水冲洗小室，并将装置置于125摄氏度的加热板上烘干。在此代表性视频中，展示了野生型年轻成虫线虫的电轴以及来自线虫追踪软件的位置和速度输出结果。

视频开始时，阴极位于右侧。玻璃移液管的外观表明即将发生方向反转，随后移液管信号的消失标志着反转时刻的到来。在此时刻，显示了自定义线虫追踪程序输出的线虫位置随时间变化以及瞬时速度随时间变化的数据。视频中展示了该程序如何从位置-时间曲线计算出速度曲线。

该箱线图展示了来自一组野生型和转基因动物的电泳速度数据。T 型转基因动物在 UNC-54 肌球蛋白重链基因启动子的调控下，在体壁肌肉中表达人源 α-突触核蛋白基因，导致蛋白质聚集，并表现为比野生型动物更慢的趋电反应。若正确进行趋电实验，熟练后每小时可检测 20 多只线虫。

在进行该实验操作时，需要牢记：只有影响运动能力或电感应的突变和化学物质，才会在电趋性实验中产生可检测的表型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对硅胶进行图案化处理、如何组装微流控通道，以及如何利用轴向趋性实验分析线虫（C. elegans）的运动行为。