Name: 利用微流体装置进行机械刺激和高分辨率成像的研究C.线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解利用微流体芯片和压力执行器对秀丽隐杆线虫进行机械刺激并测量其神经元反应的方法。该技术可实现高分辨率成像，为机械生物学和感觉生物学研究提供重要工具。

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感谢Sandra N. Manosalvas-Kjono、Purim Ladpli、Farah Memon、Divya Gopisetty和Veronica Sanchez在装置设计及突变动物制备方面提供的支持。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01EB006745（资助对象：BLP）、R01NS092099（资助对象：MBG）、K99NS089942（资助对象：MK）、F31NS100318（资助对象：ALN）的支持，并获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下提供的资助（资助协议编号：715243，资助对象：MK）。

1. 器件制备
<ol>
	<li>下载附带的掩膜文件（补充文件 1），并通过商业服务或内部设施制备铬掩膜。由于器件最小尺寸为 10 µm（驱动器膜厚度），需确保掩膜具有足够高的分辨率（± 0.25 µm 以内），以可靠地生成相应结构。</li>
	<li>采用标准 SU-8 光刻方法（例如，参考文献24,25,26）制备用于后续 PDMS 器件生产的模具；以下列出步骤概要。 
	注意：SU-8 是一种光敏材料，在紫外光照射下发生交联（最大吸收波长约 365 nm）。以制造商提供的说明为起点，确定软烘、曝光（UV）和后烘的工艺参数。
	<ol>
		<li>将 SU-8 2002 涂覆于硅片上，并旋涂至约 2 µm 的厚度，以增强微小结构的附着力。在热板上 95 °C 软烘 1 分钟，对整个表面进行轻微过量曝光（UV，约 100 mJ/cm2），然后在热板上 95 °C 后烘 2 分钟。</li>
		<li>旋涂一层 47 µm 厚的 SU-8 2050，用于定义器件特征结构。先以 500 rpm 转速旋涂 15 秒（加速度 130 rpm/s），再以 2,000 rpm 转速旋涂 90 秒（加速度 260 rpm/s）。如有必要，可重复并调整旋涂速度以获得合适的光刻胶厚度。</li>
		<li>在热板上 65 °C 软烘 2 分钟，随后在 95 °C 软烘 7 分钟。使用铬掩膜和长通滤光片，按照制造商说明对光刻胶进行曝光（约 160 mJ/cm2），以确保侧壁垂直。</li>
		<li>取出硅片，在热板上先于 65 °C 后烘 1 分钟，再于 95 °C 后烘 7 分钟。</li>
		<li>用显影液溶解未曝光的 SU-8，并用 2-丙醇清洗。</li>
		<li>将硅片在 180 °C 热板上烘烤 30 分钟（硬烘），以稳定光刻胶结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准复制模塑方法27，从 SU-8 模具制备 PDMS 复制品。
	<ol>
		<li>用三氯甲基硅烷（TCMS）蒸气处理 SU-8 模具，以降低 PDMS 的粘附性（硅烷化）。 
		注意：TCMS 具有毒性且与水反应。
		<ol>
			<li>将带有图案的硅片置于通风橱内的钟罩式真空干燥器中的晶片架上，确保环境中无水或水溶性试剂。</li>
			<li>在通风橱内，使用滴管将 1 滴 TCMS 滴加至玻璃皿中，并放入干燥器内。</li>
			<li>关闭干燥器盖子，使 TCMS 蒸气至少覆盖硅片 20 分钟。</li>
			<li>释放真空后打开干燥器，揭开钟罩盖，用塑料镊子取出硅片，放入培养皿或铝箔小舟中，用于 PDMS 复制模塑。将接触过 TCMS 的材料按危险废物妥善处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按 10:1 的比例混合 PDMS，取 40 g 基体聚合物与 4 g PDMS 固化剂。</li>
		<li>将混合物倾倒至 SU-8 模具上，并在真空腔中脱气至少 30 分钟。</li>
		<li>在烘箱中 70 °C 下固化至少 6 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将硅片水平放置于平整表面，小心剥离 PDMS，将其从硅片上取下。此步骤中切勿向上弯曲硅片，以免损坏模具。 
	注意：SU-8 与硅片附着不完全或硅烷化不充分，可能导致此步骤中 SU-8 结构被破坏。</li>
	<li>沿各器件周围切割 PDMS，形成独立芯片，使器件可适配于 24 mm × 60 mm 的盖玻片。</li>
	<li>使用 1 mm 活检打孔器，在入口、两个出口及六个驱动器位置打孔。对准器件边缘附近直径为 2 mm 的圆形标记进行打孔。</li>
	<li>将 PDMS 芯片键合至玻璃盖玻片。
	<ol>
		<li>对两个表面施加 80 W 氧等离子体处理（30 秒）。</li>
		<li>将经等离子体处理的 PDMS 表面轻柔地贴合至经处理的盖玻片表面，实现共形密封。</li>
		<li>在热板上退火处理（100 °C，10 分钟）。 
		注意：键合不充分可能导致器件因泄漏而失效。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微镜的准备
注：转基因动物：表达钙指示剂，例如 GCaMP6s28 或在感兴趣神经元中表达的其他遗传编码活性探针（例如，TRN）；共表达一种不受活动影响的荧光蛋白，该蛋白发射波长与活动探针不同，用于校正因机械刺激引起的微小侧向及离焦运动伪影。自动化分析软件可追踪并校正由运动引起的活动探针荧光强度变化。线虫品系 GN69223 （或 AQ323629) 在 mec-7 启动子调控下表达 GCaMP6s（或 GCaMP6m）和钙离子非依赖性标签 tagRFP。此外，GN692 含有突变 lite-1(ce314)，这可以防止因蓝光传感器导致的TRNs激活 lite-130 激发 GCaMP6s 荧光期间23.
<ol>
	<li>建立一个显微镜系统，用于同时激发 GCaMP 和 RFP。
	<ol>
		<li>使用连续光源和双波段激发滤光片，该滤光片仅透射青色和黄色光；或者使用仅发射特定波长范围的光源，例如同时发射青色（0.77 mW）和黄色（1.21 mW）的LED激发光源，分别用于同时激发钙依赖性和钙非依赖性荧光。</li>
		<li>使用数码相机记录显微镜图像。 
		注意：大多数相机都配有用于图像采集的软件。此外，也可使用免费的软件来控制相机，甚至可能控制显微镜系统的其他部分。</li>
		<li>根据荧光强度调节激发光强度，以避免相机饱和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据激发光源的选择，使用需配备激发滤光片的荧光滤块。 
	注意：此处使用了488 nm的GFP和580 nm的mCherry激发滤光片。
	<ol>
		<li>在立方体中添加一个分光镜，用于反射青色和黄色光，透射绿色和红色光。</li>
		<li>为显微镜配备10倍物镜和高倍物镜（例如，63倍/1.32 数值孔径油镜）将激发光聚焦到样品上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在相机前方安装一个分光镜，以同时记录GCaMP信号和钙离子无关信号。确保该分光镜配备有二向色镜（长通，截止波长570 nm），并通过一个用于绿光的发射滤光片（通带中心波长525 nm，带宽50 nm）和一个用于红光的发射滤光片（通带中心波长632 nm，带宽60 nm）来分离绿光和红光。</li>
	<li>将绿色和红色荧光分别投射到相机芯片的上半部分（绿色）和下半部分（红色）（参见 图3）。这种取向是所提供的分析软件所要求的前提条件。</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
	<li>制备年龄同步化的年轻成虫或成虫第1天 秀丽隐杆线虫，如 Porta-de-la-Riva 之前所述 等31</li>
	<li>制备微流控芯片。
	<ol>
		<li>将重力流储液罐（约 60 cm 高于芯片水平）连接，其中含有经滤膜（0.2-µm 聚醚砜注射器滤器）M9 缓冲液连接至芯片的一个出口。将另一个出口连接至双出口废液容器的一个出口。 即，一个抽滤瓶。将废液容器的另一个出口连接至蠕动泵。 
		注意：所有连接均使用聚乙烯（PE）管，并使用金属管接头将PE管连接至芯片。通过这种方式，所有废液将被完全冲洗出芯片并收集至废液容器中。出口通道中的流动会产生轻微的负压，可在后续的捕获过程中使线虫保持紧贴。</li>
		<li>制备由50 mm长PE管（外径0.9652 mm，内径0.5842 mm）和两端金属管（规格23TW，外径0.635 mm）组成的连接管。将这些连接管压入六个驱动指和蠕动泵入口中（参见 图1）。将这些连接器保留在芯片中，因为反复拆卸会导致PDMS孔磨损。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将芯片置于显微镜下。挑选2–5条线虫放入一滴经滤膜过滤（0.2-µm 注射器滤器）M9 缓冲液，并使用 1 mL 注射器通过轻轻拉动活塞，将样品吸入连接至该注射器的聚乙烯管（外径 0.9652 mm，内径 0.5842 mm）中。保持动物在聚乙烯管内，而非注射器中。 
	注意：芯片中线虫过多或溶液未过滤可能导致堵塞。</li>
	<li>将注射器的PE管连接到蠕动泵入口处的连接接口（图1 和 图2打开阀门以启动重力流，并启动蠕动泵。在10倍明场显微镜下观察捕获通道的同时，轻轻按压注射器的活塞，将动物推入捕获通道中。 
	注意：偶尔出现的气泡不会造成问题，通常会自动移至出口。多个动物可依次停放在等待室中并顺序使用。
	<ol>
		<li>将动物载入捕获通道后（另请参见 图2），通过轻轻推动或拉动注射器的推杆来调整其位置，使动物的头部位于通道前端的锥形区域内。</li>
		<li>确保线虫（成虫第1天）的尺寸适合被芯片捕获。
		<ol>
			<li>如果线虫未从头部到身体末端（不包括尾尖）完全填充通道的整个横截面，或线虫沿通道轴向移动时未推动注射器活塞，则按下注射器活塞，将线虫推出捕获通道直至其消失，并更换新的线虫（参见步骤3.8）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>切换至显微镜的荧光模式，并使用更高倍数的物镜（40倍或更高），检查目标神经元的神经突是否横跨在某个驱动器的隔膜上。若未对准，可通过推拉活塞调节动物的位置。若仍无法调整到位，则移除线虫并更换新的样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚焦于目标神经元的胞体，使用PE管将位于胞体前侧最接近该神经元的驱动器接口连接至可编程压力泵。
	<ol>
		<li>如果实验需要测量驱动器与神经元之间的距离，移动视野使两者均位于视野内，并使通道壁与图像的上下边缘平行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用可编程压力泵定义压力程序。 
	注意：本实验方案可根据所需实验进行调整。
	<ol>
		<li>以 0 kPa 的恒定压力开始，持续时间至少对应图像序列中的 50 帧图像（归一化所必需）。若成像速率为 10 Hz，则对应 5 秒。随后施加所需的刺激波形和压力，并在第二步中定义刺激的持续时间。 
		注意：为刺激 TRNs，采用正弦波形（即，75 kPa，10 Hz）叠加一个阶跃即建议使用275 kPa的压力，因其可引发较强的神经元反应。</li>
		<li>如果实验需要施加额外的刺激，则在各次刺激之间应包含至少10 s、0 kPa恒定压力的间隔。在开启压力泵之前，须确保仪器压力处于0 kPa恒定状态，以避免在正式实验开始前意外刺激线虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行成像和压力实验方案。
	<ol>
		<li>在相机的图像采集软件中，设置图像序列的采集频率为 10 Hz，曝光时间为 100 ms，并持续整个压力刺激实验过程。调节激发光强度，使荧光信号的最大增幅不会导致相机信号饱和。在首次刺激前至少保存 50 帧图像，并以 *.tif 格式存储，用于后续归一化处理。</li>
		<li>在图像采集软件中启动成像程序，同时在可编程泵的软件中启动压力程序。记录过程中，观察目标神经元是否为10×10像素区域内最亮的点，连续图像中移动不超过10像素，并在整个记录期间保持在视野范围内。 
		注意：如果不执行此操作，分析软件将无法运行。神经元周围出现的亮斑（即自发荧光）会使神经元信号的清晰记录变得困难。为解决此问题，需将线虫从捕获结构中移除，并向芯片中加载新的线虫。如果线虫运动过多，可尝试对同一条线虫重新进行一次记录，并观察其运动情况。若问题仍然存在，则可能是线虫体型过小而无法被有效捕获。此时应移除该线虫，并将一条稍大的线虫装入捕获结构中。</li>
		<li>必要时，只要视野内各神经元在整个记录过程中相距至少10个像素，即可同时记录多个神经元的信号。</li>
		<li>为研究习惯化，需在同一只动物上重复进行该实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将线虫从捕获通道中移除。
	<ol>
		<li>如果需要将线虫保留用于后续研究，应断开芯片通往重力流和废液容器的出口。轻轻推动注射器的推杆，直至整条线虫被推过捕获通道进入流道。</li>
		<li>继续推动注射器活塞，直至动物出现在芯片外的液滴中。将注射器连同PE管从线虫入口处断开，用其吸取液滴中的线虫，并转移至琼脂平板上。</li>
		<li>若无需保留线虫，可通过推动注射器活塞，将线虫完全推入捕获通道并进入流道；重力流动及蠕动泵的吸力会将线虫带出芯片并进入废液容器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析
<ol>
	<li>下载并安装最新版本的 Fiji32.</li>
	<li>下载并安装最新版本的 Java SDK。 
	注意：如有必要，可删除或重命名 Fiji 文件夹内的 java 文件夹，以使 Fiji 使用新安装的 java 编译器。</li>
	<li>打开 Fiji 软件。
	<ol>
		<li>通过打开“插件| 实用程序| ImageJ| 属性”检查软件是否正在运行新安装的 java 编译器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载 pokinganalyzer*.java 文件（https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer，参见 补充文件 2).</li>
	<li>将 .java 文件拖放到软件窗口中，作为插件打开。</li>
	<li>在 Fiji 中按下 Ctrl+R 键编译并运行 pokinganalyzer*.java 文件；将打开一个图形用户界面（Poking Analyzer）图3).
	<ol>
		<li>单击“帮助”选项卡，了解软件的要求以及如何执行分析。开始时，选择“打开视频”选项卡。为分析器指定视频文件位置：单击“打开视频”按钮，浏览至视频所在位置并打开该文件。 
		注意：软件启动时默认打开此选项卡。若开始新分析时该选项卡未打开，请点击“打开视频”选项卡。如果视频为 .tif 格式，程序将自动加载视频，并在界面下方显示第一帧图像。若显示的图像并非需要分析的视频内容，请点击“打开视频”按钮以加载其他视频。</li>
		<li>继续操作，请点击“定义感兴趣区域”选项卡。在此选项卡中，定义丘脑网状核（TRN）的位置。请注意，打开的视频的第一帧图像会显示在此选项卡的下方区域。点击“定义TRN”按钮，然后在上方显示的图像中点击应显示GCaMP荧光的神经元。</li>
		<li>可选：如果驱动器在图像上半部分可见，可根据需要让程序自动追踪神经元与驱动器之间的距离。为此，请勾选“定义驱动器？”复选框，点击“定义驱动器”按钮，然后点击图像上半部分中的驱动器。</li>
		<li>单击“分析”选项卡。定义图像采集速率。可在字段中输入数值，或单击向上或向下按钮以增加或减少数值。如果在上一个选项卡中勾选了“定义执行器？”复选框，则需定义相机像元尺寸、放大倍数和二乘二合并因子，以便程序计算距离。</li>
		<li>点击“开始分析”按钮。 
		注意：程序现在将通过图像序列上半部分（依赖钙）和下半部分（不依赖钙）中的荧光来追踪神经元。为校正神经元在记录平面内的运动，程序将在前一幅图像中神经元位置周围的 10 × 10 像素区域内进行搜索，以确定神经元在下一幅图像中的位置。程序将通过校正背景荧光，分别计算两个区域的荧光强度Fbg）除以最初50张图像中的荧光强度（F0): 
		<img alt="荧光猝灭公式 (F-Fbq)/(F0-Fbq)；光谱学研究中的示意图" src="/files/ftp_upload/56530/56530eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> 
		绿色、活动依赖性通道中的荧光变化（FCa2+）由神经元在记录平面外移动引起的位移将通过红色、与活动无关的荧光通道进行校正（Fcorr) 以及钙依赖性（sdCa2+）以及独立的荧光（sdcorr) 作者： 
		<img alt="化学平衡公式，Fc(a)2+ 与校正因子（Fcorr）的方程表达式。" src="/files/ftp_upload/56530/56530eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>程序将在界面底部的状态栏中显示其进度；当状态栏达到100%时，点击“结果”选项卡。如果状态栏在未达到100%时停止，程序将显示错误信息，说明无法分析视频的原因。
		<ol>
			<li>如果信噪比过低，程序将无法识别神经元；请在后续记录中调整成像参数。</li>
			<li>如果神经元在记录过程中移出视野范围，程序将无法继续追踪并会停止。后续记录时，应在记录开始时将神经元置于视野中央。</li>
			<li>如果视野中某些区域过饱和，自动分析将产生无效结果。后续记录时，应确保荧光信号不会使相机传感器饱和。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在“结果”选项卡中，结果会显示在上方区域。点击“保存结果表格”以保存制表符分隔的 *.txt 文件。 
		注：此表格包含以秒为单位的时间以及钙依赖性荧光强度（经钙非依赖性荧光校正后的归一化值）。若先前已定义，则还包含TRN与驱动器之间的总距离 µm 以及TRN与执行器在垂直于通道壁方向上的距离 µm刺激后荧光强度增加的代表性结果与细胞体到最近驱动器的距离之间的关系如图所示 图 4.</li>
		<li>如果一次记录中包含多个神经元（相距超过10个像素），请再次点击“定义感兴趣区域”标签，并对第二个神经元返回步骤4.6.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/15/5/005">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li>
<li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+Pressure%3A+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了一种对被困在微流控芯片中的线虫皮肤施加精确机械刺激的方法。该方法旨在促进物理刺激在解答生物学问题中的整合应用，并推动生物实验室中力生物学研究的标准化。该方法拓展了以往用于评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）机械感受神经元功能的实验手段。以往的定量和半定量技术可测量作用力1,34和行为反应35，但难以与神经元活动的高分辨率成像相结合。因此，我们认为该芯片的使用扩展了现有应用范围，且其性能已优化，适用于轻触觉相关神经元的刺激。我们优化了驱动器的偏转幅度，使其达到5 µm，这一刺激强度足以引发接近最大幅度的神经元反应。通过稍作调整，我们认为该设计也可用于刺激强触觉感受器，例如支配体表的PVD伤害性感受器36。
修改与故障排除 
如果无法获得洁净室进行SU-8光刻，可使用台式洁净箱或配备紫外灯、程序控温...

触觉为动物提供了有关其生存环境的关键信息。根据所施加力的大小，触觉可被感知为无害、愉悦或疼痛。触觉过程中组织的形变由皮肤中嵌入的特化机械感受器细胞检测，这些细胞表达受体蛋白，最常见的是离子通道。然而，力感知与触觉及疼痛过程中离子通道激活之间的步骤尚未完全阐明。关于皮肤组织如何过滤机械形变，以及机械感受器检测的是应变还是应力的变化，目前所知更少1,2,3。这一认知空白部分源于缺乏合适的工具，能够在观察活体动物细胞水平反应的同时，对其皮肤表面施加精确的机械刺激。尽管原子力显微镜已被广泛用于在分离细胞中施加和测量力4,5，并用于激活活细胞中的Piezo1受体6，但将类似实验应用于活体动物，尤其是 C. elegans，由于实验对象本身具有内在运动性，一直极具挑战性。传统上，这一难题通过使用兽用或外科级氰基丙烯酸酯胶水将单个动物固定在琼脂垫上来规避1,7,8,9。该方法虽已取得成效，但仍存在局限性，包括胶合固定所需的技术熟练度以及软琼脂表面在机械顺应性方面的限制。微流控策略是一种互补的替代方法，可避免与胶合相关的某些复杂问题。
线虫 C. elegans 是一种遗传学模式生物，其神经系统已实现全图谱解析，且由于该动物体型微小，非常适合应用于微流控技术。基于微流控的装置具有优势，可将原本活动性极强的动物固定，从而实现高分辨率成像以及施加相关的神经调节刺激。借助微流控技术，可在不损伤活体动物的前提下将其固定10,11，实现对行为活动的全生命周期监测12,13，以及对神经元活动的高分辨率成像14,15,16,17。此外，许多介导触觉和痛觉的机械感受器神经元可在生理学1,8、力学4,18,19和分子水平上得到表征20,21,22。
秀丽隐杆线虫 利用六条触觉感受神经元（TRNs）感知作用于体壁的轻微机械刺激，其中三条支配动物的前部（ALML/R 和 AVM），另外三条支配后部（PLML/R 和 PVM）。在这些TRNs中，将施加的机械力转化为生化信号所需的离子通道分子已被广泛研究。8本文介绍了一种微流控平台23 能够使研究人员对固定状态下的皮肤施加精确的机械力 秀丽隐杆线虫 线虫，同时通过光学成像读取其内部组织的形变。除了提供明确的机械刺激外，还可以亚细胞分辨率记录机械感受神经元中的钙瞬变，并将其与形态学和解剖学特征相关联。该装置包含一个中央捕获通道，用于固定单个动物，并将其皮肤置于六个气动驱动通道附近（图1 和 图2）。这六个通道沿捕获通道布置，用于向线虫的六个触觉感受神经元（TRNs）传递机械刺激。这些通道通过薄的聚二甲基硅氧烷（PDMS）隔膜与捕获腔隔开，隔膜可由外部气压源驱动。图1）。我们针对压力对偏转进行了校准，并在本文中提供了相关测量结果。每个执行器均可独立寻址，可用于刺激特定的机械感受器。压力通过压电驱动的压力泵输送，但也可使用其他替代设备。我们证明了该压力方案可用于激活TRN 体内 并演示适用于向成年个体传递机械刺激的操作装置 秀丽隐杆线虫，将成年动物装入装置，进行钙成像实验并分析结果。装置制备主要包括两个步骤：1）光刻法使用SU-8制作模具；2）用PDMS注模制备装置。为简洁明了起见，读者可参考此前已发表的文章和实验方案24,25 有关如何制作模具和设备的说明。

<table><tbody><tr><td>铬掩模</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5英寸，使用 AutoCAD (Autodesk, Inc.) 设计</td></tr><tr><td>铬掩模</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5英寸，使用 AutoCAD (Autodesk, Inc.) 设计</td></tr><tr><td>铬掩模</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td><td>5英寸，使用 AutoCAD (Autodesk, Inc.) 设计</td></tr><tr><td>4英寸硅片（B型测试）</td><td>斯坦福纳米制造设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>曝光定时器</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>照明控制器</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>费希尔科技公司</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>费希尔科技公司</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>三氯甲基硅烷（TCMS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>注意：TCMS具有毒性且与水反应</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>道康宁公司</td><td></td><td>PDMS预聚物</td></tr><tr><td>活检打孔器，1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子体灰化仪</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型金属管（外径0.635 mm，内径0.4318 mm，长12.7 mm）；规格23TW</td><td>新英格兰小型管材公司</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 注射器滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>725-2520</td><td>用于过滤所有溶液，防止微小颗粒堵塞芯片</td></tr><tr><td>聚乙烯管；外径0.9652 mm，内径0.5842 mm</td><td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>注射器，1 ml</td><td>BD 科学公司</td><td>309628</td><td>用于线虫捕获与释放</td></tr><tr><td>注射器，20 ml</td><td>BD 科学公司</td><td>309661</td><td>用于重力驱动流动</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3 蠕动泵</td><td>Gilson</td><td></td><td>用于将溶液和线虫从芯片中抽出</td></tr><tr><td>微流控流量控制器，配备0&amp;ndash;800 kPa 压力通道</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>用于压力输送</td></tr><tr><td>耐水透明聚氨酯管，内径4 mm，外径6 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>连接实验室气源至压力泵</td></tr><tr><td>耐水透明聚氨酯管，内径2.6 mm，外径4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>连接压力泵至小型管材</td></tr><tr><td>推入式空气管接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>公制-英制转换接头</td></tr><tr><td>直通接头，适用于6 mm &amp;times; 1/4&amp;Prime; 管外径</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B 显微成像系统</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&amp;times;/1.32 NA HCX PL APO 油镜物镜</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT 数字CMOS相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td></td><td>配备青色及绿色/黄色光源</td></tr><tr><td>激发光分束器</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>安装于显微镜内</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini 图像分光光学器件</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>用于分离绿色和红色发射光，并将其投射到相机芯片的不同区域</td></tr><tr><td>发射光分束器</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>安装于图像分光器内</td></tr><tr><td>GCaMP6s发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>安装于图像分光器内</td></tr><tr><td>mCherry发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>安装于图像分光器内</td></tr></tbody></table>

使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

机械生物学的一个核心目标是理解机械应力对蛋白质和细胞的双向影响。尽管这一领域至关重要，但机械应力对细胞功能的影响至今仍知之甚少。部分原因在于，目前缺乏能够同时实现组织和细胞形变、在活体动物中成像细胞活动，并有效限制原本高度活跃的模式生物（如线虫Caenorhabditis elegans）运动能力的工具。由于C. elegans体型微小，非常适合用于基于微流控技术的研究装置，已有研究利用微流控设备实现其固定。尽管这些装置支持高分辨率成像，但线虫被完全封闭在聚二甲基硅氧烷（PDMS）和玻璃之间，限制了施加机械力或进行电生理记录时的物理接触。最近，我们开发了一种集成了气动执行器的捕获装置，该装置兼容高分辨率荧光显微镜观察。执行通道与线虫捕获通道之间由一层薄PDMS隔膜分隔。通过外部施加压力，该隔膜可向线虫侧面发生偏转，从而施加机械刺激。该装置可靶向单个机械敏感性神经元，并利用基因编码的钙指示剂以高分辨率成像这些神经元的激活情况。本文以在触觉感受神经元（TRNs）中表达钙敏感性活性指示剂（GCaMP6s）的C. elegans品系为例，介绍该通用方法。然而，该方法不仅限于TRNs或钙指示剂作为探针，还可拓展至其他机械敏感性细胞或传感器。

SU-8 光刻与芯片键合 
光刻工艺及 PDMS 模塑遵循标准操作流程。详细步骤可参见其他文献23,24,25,26。PDMS 在固化后应能顺利从晶圆上剥离。若在剥离 PDMS 时 SU-8 结构被撕下，说明 SU-8 的粘附层或硅烷化处理不充分。若玻璃盖玻片与 PDMS 芯片的等离子活化不充分，可能导致键合强度不足，从而引起捕获通道或气动执行器发生泄漏，造成性能下降或无法实现刺激。若观察到明显的液体泄漏，该芯片即不可用。
驱动器性能 
所有 PDMS 驱动器以及连接芯片与气源的管路必须密封良好，以确保隔膜能够正常进行气...

为了理解机械应力如何激活生化通路并引发生物学反应，机械生物学研究需要新的工具。本文展示了一种新方法，利用微流控捕获装置对固定化的动物进行选择性机械刺激，从而实现对细胞反应的高分辨率成像。

机械生物学的一个核心目标是理解机械应力对蛋白质和细胞的双向影响。尽管这一领域具有重要意义，但……

该技术的总体目标是利用带有压力驱动装置的微流控芯片系统，测量线虫及其神经元对外部机械刺激的响应。该方法可解答机械生物学和感觉生物学领域的一些关键问题，例如细胞、组织和动物如何响应机械刺激。该技术的主要优势在于，它能以非侵入性的方式有效限制线虫的活动能力，从而实现高分辨率成像，同时仍可对线虫的角质层施加机械刺激。该方法还可用于研究机械信号对发育的影响，甚至可应用于其他类似体系，例如离体器官暴露实验或与秀丽隐杆线虫（C. Elegans）体型相似的其他动物。建立显微镜系统，以同时激发 GCaMP 和 RFP。一种选择是使用仅透射青色和黄色光的隐蔽光源。观察时，使用10倍物镜和高倍物镜。同时，通过数字相机将图像传输至计算机。接下来，安装一个荧光立方体，如有需要，再添加一个激发滤光片。在立方体内加入一个二向色镜，可反射青色和黄色光，并透射绿色和红色光。设置一个光束分光器，配备截止波长为570纳米的长通二向色镜。同时，提供一个中心波长为525纳米、带宽为50纳米的绿色光带通发射滤光片，以及一个中心波长为632纳米、带宽为60纳米的红色光带通发射滤光片。将两束光均投射到相机的视场内。确保绿色部分投射到屏幕的上半部分，红色部分投射到下半部分。务必使用出厂时间少于一个月的微流控芯片。实验装置设置时，首先将过滤后的 M9 培养基加入重力流储液槽中。将储液槽置于芯片上方约 60 厘米处，并将其连接至芯片的一个出口。接着，将另一个出口通过一个具有两个入口的废液容器连接，再将该废液容器的第二个入口连接至蠕动泵。使用聚乙烯管完成所有连接。接着，组装互连件，即两端带有金属管接头的50毫米管段。将这些互连件压入并连接到六个驱动指中的每一个，以及蠕动泵入口。现在，将芯片置于光学器件下方。务必保持芯片上的互连结构连接，因为PDMS在反复操作下会迅速磨损。确保PDMS驱动器以及连接芯片与气源的管路密封良好，这对于实现隔膜良好的色度驱动至关重要。在装载动物之前，检查微流控芯片是否存在压力损失。在目标压力下执行多次驱动循环，测量隔膜的偏转程度。然后将定量测量值与理论预测值进行比较。如果测量值与预期不符，请检查管路或管路连接处是否存在泄漏。PDMS 的弹性也可能因基础聚合物与固化剂的比例不同而发生变化，或者 PDMS 材料可能因存放过久而过度交联。请按照 Porta-de-la-Riva 及其同事在 2012 年 JoVE 出版物中所述的方法，准备与年轻成虫或成虫第一天年龄同步的 C.elegans。现在，选取2至5只年轻成虫或孵化一天的雌雄同体线虫。选择正确大小的线虫至关重要：体型过小的线虫无法被通道截留，而体型过大的线虫则难以取出，并可能导致装置堵塞。用一滴过滤的M9缓冲液将挑选的线虫转移，然后使用1毫升注射器将线虫吸入一段导管中，注意不要将线虫吸入注射器本体内。接着，将导管连接至芯片线虫入口处的连接接口。随后，打开通向储液池的阀门并启动泵，以开启重力驱动流动。现在，在四倍放大倍数下观察捕获通道，并轻轻推动动物进入装置。将动物加载到等待室后，使用柱塞轻柔地推动其中一只动物至捕获通道前端，使其头部进入通道的锥形区域。如果线虫未能从头部到接近身体末端完全填满通道的整个横截面，则移除该线虫。许多情况下，体型过小的线虫会直接穿过芯片而不会被捕获。如果需要移除卡在捕获通道中的线虫，只需推动注射器活塞，直到线虫从通道中消失，然后加载新的线虫。一旦线虫被正确加载，切换至荧光模式并增加放大倍数。为防止信号饱和，务必根据荧光强度调整激发光强度。检查目标神经元的神经突是否跨越某个驱动器的光阑。该驱动器必须位于神经元胞体的前方。如果不行，可通过拉动或推动柱塞来调整动物的位置。如果仍无法解决，移除线虫并更换新的线虫。此外，如果神经元周围存在自发荧光，也应更换线虫。当线虫正确装载后，将焦点对准目标神经元的胞体，然后确定芯片上位于其前侧的驱动器，并使用相应的互连装置将该驱动器连接到可编程压力泵。如果实验需要测量驱动器与神经元之间的距离，应调整视野使两者均位于视场内，并使微通道壁与图像上下边缘平行。接下来，使用可编程压力泵设定压力程序。始终先在零千帕下采集至少50幅图像，以确定基线。然后，设定刺激波形和压力参数。接着，运行成像和压力程序。记录过程中，目标神经元必须是10像素见方区域中最亮的点。在连续两幅图像中，其移动不得超过10像素，且必须保持在视野范围内。记录期间，当压力和驱动器发生变化时，您可能会观察到荧光强度的变化。这表明神经元刺激成功。在两次刺激之间，需在零千帕的恒定压力下维持10秒。只要在整段记录过程中，视野中的多个神经元彼此间隔至少10个像素，便可同时记录它们的信号。为了保存线虫以供后续研究，断开芯片朝向重力流和废液容器的出口。然后轻轻按压推杆，直至整条线虫被推过捕获通道进入流动通道，并继续按压推杆，直到线虫出现在芯片外的液滴中。此时，取下连接的注射器及管路，将芯片外液滴中的线虫吸出并转移至琼脂平板上。要从通道中移除并处死线虫，请按压柱塞，直至整条线虫被推过捕获通道并进入流动通道。随后，线虫将随液体流出芯片，进入废液容器。在微流控芯片组装完成后，对隔膜的偏转性能进行了测试。测量值具有可重复性，在450千帕压力下变化极小，不超过一微米。将线虫插入芯片入口后，捕获通道内单个动物的皮肤即暴露于六个致动器之下。在此设计下，PLM神经元通常无法被完全固定，因此可自由地进行横向和纵向移动。尽管成功激活 PLM 神经元是可行的，但由于尾部运动，记录其钙瞬变信号较为困难。将动物固定后，使用六个致动器中的一个对六种触觉感受神经元（TRN）中的每一种施加机械刺激。共呈现三种不同的持续两秒的刺激。 保持在275千帕的压力、从0升至275千帕的压力斜升，或由75千帕10赫兹正弦波叠加275千帕阶跃组成的振动刺激。各刺激之间以10秒无压力间隔分开。仅当压力达到400千帕以上时，压力斜升和压力阶跃才能激活触觉感受神经元（TRN），而振动刺激则能强烈激活所有TRN。一旦掌握，该技术可在每条线虫上五分钟内完成。需要注意的是，芯片与盖玻片之间或芯片与连接器之间的密封不良会导致装置泄漏并失败。在完成此操作后，可进一步采用其他方法，如电压成像或向不同神经元靶向递送机械刺激，以表征伤害感受器的机械反应特性。此外，由于动物在该操作后可以恢复，该技术可用于筛选对机械刺激反应缺陷的突变体。请勿忘记，操作压缩气体和化学品可能具有极高危险性。必要时应采取预防措施，例如穿戴个人防护装备并在通风橱中操作，以避免这些危险。

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