Name: 一个渐变产生的微流体装置，细胞生物学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习制作梯度生成微流体装置的方法，用于细胞生物学研究。该装置采用SU-50光刻和PDMS键合技术，可精确控制微环境，适用于研究细胞定向迁移、胚胎发育及癌症转移等生物过程。

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A. 生成浓度梯度的微流控装置的微加工
<ol>
<li>将硅片在反应性氧等离子体中处理（30 W，5 分钟，Harrick Scientific，纽约）。</li>
<li>在硅片上以 1000 rpm 的转速旋涂负性光刻胶（SU-8 50，Microchem，马萨诸塞州），持续 1 分钟。</li>
<li>将硅片在热板上于 65°C 预烘 10 分钟，随后在 95°C 继续烘烤 30 分钟。</li>
<li>通过最小特征尺寸为 30 µm 的透明掩膜，用紫外光（200 W）照射硅片 3 分钟。</li>
<li>硅片在 65°C 后烘 1 分钟，随后在 95°C 后烘 10 分钟。</li>
<li>使用 SU-8 光刻胶显影液对带有 100 µm 厚通道的硅主模具进行显影。</li>
<li>将含有微通道的硅片放入培养皿中。</li>
<li>通过将硅弹性体与固化剂按 10:1 的比例混合，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Sylgard 184）模具。</li>
<li>将 PDMS 混合物浇注到硅主模具上。</li>
<li>将硅主模具置于真空干燥器中，去除气泡，持续 10 分钟。</li>
<li>在 70°C 下固化 PDMS 1~2 小时。</li>
<li>将 PDMS 模具从硅主模具上剥离下来。</li>
</ol>
B. 实验装置
<ol>
<li>使用锋利的打孔器对基于 PDMS 的微流控装置的细胞入口、出口和灌注入口进行打孔。</li>
<li>通过反应性氧等离子体处理（30W，5 分钟，Harrick Scientific，纽约）将装置与一块玻璃载片（2×3 英寸）不可逆键合。</li>
<li>将聚乙烯导管（PE 20，Becton Dickinson，马里兰州）插入微流控装置的灌注入口，并随后连接至注射泵。</li>
<li>将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（分子量=10 kD，10 µM，Sigma）和缓冲液（PBS，Invitrogen，加利福尼亚州）注入微流控装置，以确认装置内形成稳定的浓度梯度。</li>
<li>在孵育箱（37°C）中，将细胞外基质（ECM）（如纤连蛋白）包被于微流控装置内部，孵育 1 小时。</li>
<li>用胰蛋白酶处理 NIH 3T3 成纤维细胞并使其解离。</li>
<li>将解离后的细胞以 2×106 个细胞/ml 的密度加载到微流控装置（宽 800 µm）中。</li>
<li>使用注射泵（0.05 µl/min）向微流控装置中注入 2 ml 培养基和 50 ng/ml 表皮生长因子（EGF），以生成可溶性浓度梯度。</li>
<li>利用倒置显微镜（Nikon TE 2000）每 5 分钟对细胞进行一次实时监测。</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

在微流控装置中，暴露于稳定浓度梯度表皮生长因子（EGF）的细胞向较高浓度方向迁移。通过细胞示踪分析，研究了细胞迁移的方向性取向、趋化指数以及迁移细胞的运动性。因此，这种可生成浓度梯度的微流控平台可用于研究癌症转移、胚胎发生以及轴突导向。

<table><tbody><tr><td>葡聚糖-FITC</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（10 kD）</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>人重组表皮生长因子</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS），Dow Corning Sylgard 184（8.6 lb）</td></tr><tr><td>负性光刻胶</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td></td><td></td><td></td><td>硅基晶圆，4 英寸</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>细胞系</td><td></td><td></td><td>成纤维细胞</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于细胞生物学的梯度生成微流控装置

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

用于研究细胞行为的浓度梯度生成微流控装置的制备与操作方法

本文描述了一种用于研究细胞行为的浓度梯度生成微流控装置的制备与操作方法。微流控平台是一种具有强大功能的实验工具，因其能够精确操控流体流动、实现高通量实验，并生成稳定的可溶性浓度梯度。与传统的梯度生成方法相比，基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置能够生成具有明确轮廓的稳定生长因子浓度梯度。在此，我们开发了一种具有三个独立进样口的简单梯度生成微流控装置。三条微通道汇入一条主微通道，从而形成浓度梯度。通过使用分子量与表皮生长因子（EGF）相似的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran），验证了生长因子梯度的稳定性与分布形态。利用该微流控装置，我们证明了成纤维细胞在EGF浓度梯度作用下会向高浓度区域迁移。通过细胞追踪分析，定量评估了细胞迁移的方向性取向及迁移细胞的运动能力。因此，该浓度梯度生成微流控装置可能在研究和分析迁移细胞行为方面具有重要应用价值。

关键词：微流控装置，浓度梯度，细胞迁移，表皮生长因子（EGF），聚二甲基硅氧烷（PDMS），异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran），细胞追踪分析

我们描述了一种用于微加工梯度生成微流控装置的方案，该装置可在定义明确的微环境中产生成分的空间和时间梯度。通过该方法，梯度生成微流控装置可用于研究细胞定向迁移、胚胎发育、伤口愈合以及癌症转移。

描述了一种用于研究细胞行为的梯度生成功能微流控装置的制备与操作方法。微流控平台是一种……

我叫Jiang。我是哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术系的博士后研究员。我叫Amir Manchi，是哈佛大学麻省理工学院健康科学与技术部SANE实验室的本科生。此幻灯片展示了制作该器件的流程示意图：首先在硅烷蒸气层上进行 SUA 50 旋涂，然后将掩膜版置于硅烷蒸气层上方，接着进行紫外曝光并显影。最终可在此硅烷蒸气层上形成电极阵列。之后，浇铸 PDMS，进行脱模和烘烤，再用打孔器打孔，最后通过氧等离子体处理实现 PDMS 器件与玻璃片之间的键合。好的，我们现在位于实验室内的微加工室内，首先将制作一些PDMS层。我所说的PDMS，其正式的科学名称为聚二甲基硅氧烷，是一种有机聚合物，也是应用最广泛的硅基有机聚合物。实际上，这是两种不同物质的混合物，即硅胶弹性体基础剂与硅胶弹性体固化剂的混合物。两者的比例为基础剂10份，固化剂1份。我们需要约10克基础剂，相应地就需要约1克弹性体固化剂，接下来我将尝试将基础剂和固化剂充分混合均匀。我将使用移液器。现在混合物已经准备好，我将把它滴加到硅片表面。这些硅片的表面具有一些特定的图案。它们实际上有助于使这种PDMS聚合物形成所需图案，我们利用这些图案在聚合物上制备出通道、凹槽或任何其他所需的结构。下一步是，由于该混合物内部存在大量气泡，我们将尝试将其放入真空环境中，以消除聚合物内部的气泡。我会将PDMS凝胶放置在真空腔内的硅晶圆上。我将关闭腔室，然后打开真空。待气泡消失后，大约几分钟，将其放入烘箱中过夜，温度约为70摄氏度，这将使样品固化。我需要您注意的图案是这三个不同的储液区域，用于形成浓度梯度，使得一侧浓度为零，另一侧具有特定浓度，并沿此方向均匀过渡。我们还将在另一端制作一个小孔，作为本实验中的出口。下一步是裁剪其中一个图案，并将其转移至培养皿中，使图案面朝上。希望您能够看到我之前向您解释过的该图案上的三个入口和一个出口。我们将使用小冲孔器制作入口，以便能够使用聚乙烯管；而出口将使用较大的冲孔器，以留出足够的空间。首先，我们将从第一个入口开始。我会打一个孔，第二个入口同样处理，第三个入口则打一个较小的孔。最后一步是在出口处打一个较大的孔。因此，完成之后，我们将得到 A-P-D-M-S 层，这是顶层，而我将在底部使用另一层玻璃。这些显微载玻片将作为微叶酸器件的底层。现在我们位于微加工实验室，我有一块玻璃和一层 PDMS，需要将它们彼此粘合在一起。我们现在将使用一种称为等离子清洗机的设备。在腔室内会发生的过程是：等离子体有助于破坏表面的弱结合层，并将其替换为高反应性的化学基团，同时表面也会变得亲水。接下来的操作是，我将取出之前制备的PDMS模具（即顶层，内部含有微通道），并撕去先前为防止灰尘附着而贴上的胶带。我将把它放入腔室内。接下来，我有一块玻璃层，即显微镜载玻片，这将作为装置内部的底层。因此，我也要将这块玻璃放入腔室内。关闭腔室后，先关闭电源，再关闭泵，然后我们需要在大约五分钟内返回这台设备。接下来，我需要关闭设备：先关闭泵，再关闭电源，然后打开腔室。这种声音实际上是由于在腔室内进行操作时施加了负压所致。接下来，我将取出不同的层，并将它们粘合在一起。由于玻璃是底层，我将用左手固定住玻璃层，然后取PDMS层，将其放置在玻璃层的上方。但由于目前这些图案实际上是朝上的，我需要将PDMS层翻转一下。在将它们压合之后，我会将其放置在玻璃上。它们能够非常容易地粘附，而这种等离子体处理工艺的优势之一就在于其粘附强度和永久性。最终效果就是这样。再次说明，这些是我们的进样口，这是我的出样口，接下来我们就可以进入下一步了。将装置内的纤维进行孵育，放入培养箱中孵育一小时，一小时后从培养箱中取出一个SIM样本，然后加入鱼类培养食物，接着配制溶液。为了配制EGF溶液，我们只需将两毫升培养基加入Azure中，并加入15纳克/毫升的EGF和10微摩尔的50D，以充分混匀该溶液，便于在通道中清晰观察EGF浓度梯度。然后，我们再取两毫升培养基，即虚拟培养基，加入此处，再加入另外两毫升培养基。这两个位置仅用于常规培养，即正常的培养灌注，置于装置中。因此，我先去除气泡，再次连接，此时又有一个M型移动气泡流下。然后，我仅使用15纳克的EGF、10微摩尔的荧光素标记的葡聚糖以及2毫升从取出物中获得的培养基样本，将其装入注射器，注意避免产生气泡。接着进行溶液切换，再切换回原状态。将溶液吸入气体型注射器中，反复推动SH数次以排除气泡。所有切换注射器的溶液先在此处汇集，然后切换三通阀，使溶液经三通阀、接头及管路流出。待混合后的溶液流出后，即可将管路插入My Predict设备中。此时所有三种溶液已完全一致，可轻柔地连接输注通道的入口端。因此，最终两种为正常培养基，一种为含表皮生长因子（EGF）的培养基，用于确认EGF的浓度梯度分布。此为网络中的细胞，网络中的细胞。这将是细胞的出口，因此通过三个枢纽通道生成梯度，然后在细胞区域内部建立梯度。通常情况下，我们首先进行细胞接种，将细胞悬液加入出口处，然后轻轻抽吸使液体流入，细胞随之流经细胞区域并自动附着沉降，覆盖于包被表面，随后确保细胞完全铺展。在确认细胞已完全铺展后，即可开始灌注，利用梯度生成装置研究细胞迁移。

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一个渐变产生的微流体装置，细胞生物学

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

本文介绍了一种简单的方法，可在含细胞的同心水凝胶上施加非连续梯度静态应变，以调控组织工程中的细胞取向。...

用于刺激载细胞水凝胶中细胞行为的梯度应变芯片

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

一种可定制的细胞迁移测量装置

化学梯度和氧气梯度的控制对于细胞培养至关重要。本文报道了一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯（PDMS-PC）微流控装置，能够稳定地生成用于细胞迁移研究的化学梯度与氧气梯度组合，且可在无需复杂仪器的生物实验室中实际应用。...

用于在垂直化学和氧气梯度下研究细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置

我们介绍了一种微流控芯片上的癌症模型，即"进化加速器"技术，该技术可在明确定义的环境条件下，在单细胞水平上对癌症动态进行长期、实时、定量的可控研究。该技术有望作为基础研究或临床前药物开发的体外模型。...

在微流控进化加速器上生成跨越癌细胞群体的异质性药物梯度以实现实时观察

在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

本方案详细介绍了适用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。通过结合微加工技术、自动流体控制和计算建模技术，构建了一个灵活的系统，特别适用于细胞骨架的力学特性探究。 体外.

基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

学习制作梯度生成微流体装置的方法，用于细胞生物学研究。该装置采用SU-50光刻和PDMS键合技术，可精确控制微环境，适用于研究细胞定向迁移、胚胎发育及癌症转移等生物过程。

一种用于细胞生物学的梯度生成微流控装置

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