一种用于清醒小鼠肾小球滤过率高通量测定的方法

本实验的总体目标是向其他研究人员展示如何测定清醒小鼠的肾功能。首先，将荧光素异硫氰酸盐（FSE标记的菊粉）透析24小时，并测定其注射浓度。第二步是称量小鼠体重，准备精确体积的FSE菊粉用于眶后注射，并对小鼠进行麻醉。

接下来，进行眼后注射 Retrobulbar Fitzy 菊粉，并在 75 分钟内采集八份血液样本。最后一步是使用微量荧光分光光度计测量 Fitz Nulin，并通过双相指数衰减模型计算肾功能。最终，将 Fiti Nulin 单次团注法的高灵敏度与荧光分光光度计的微量检测能力相结合，可检测由小鼠基因修饰、饮食变化或药物应用引起的肾功能差异。

与现有方法（如持续输注、麻醉条件下植入渗透压微型泵以及使用放射性菊粉）相比，该技术的主要优势在于无需手术，且实验并非终点式；无需收集尿液，每天最多可进行24次测量。

我将与来自我实验室的研究助理 Maria Azimo 一起演示该实验步骤。为制备 Fitzy Nulin 注射液，称取足量的 ZI 菊粉，用于配制 2 毫升浓度为 5% 的溶液；将标记的菊粉溶于 0.85% 氯化钠溶液中，加热至 90 摄氏度，直至完全溶解。取一段 20 厘米长的透析膜，置于双蒸水中浸泡 30 分钟，以去除膜中残留的亚硫酸钠；之后用液体冲洗透析膜数次，将溶解的 Fitzy 菊粉溶液注入透析膜内，用夹子妥善封口，然后称量整个透析膜的重量。

将溶解的fitzy菊粉置于1升0.85%氯化钠溶液中透析，在室温下避光缓慢搅拌24小时。透析结束后，再次称量整个透析膜，并计算新的浓度。由于渗透作用，水会进入膜内，而未结合的FSI会移出膜外，因此FSI菊粉的浓度将显著降低。

使用以下公式计算新的拟合E型菊粉浓度，其中C为新浓度，N为初始拟合E型菊粉的量，V为新体积，即透析前后透析管重量之差加上初始拟合E型菊粉溶液的体积。接下来，通过0.22微米注射器滤器过滤，对透析后的溶液进行灭菌。

实验前请始终将Fitzy标记的菊粉避光保存，以避免光漂白。用4%至5%异氟烷短暂麻醉小鼠后，称量其体重。通过趾反射检查麻醉深度，使用100微升Hamilton注射器（配半英寸长、26号针头）吸取每克体重2微升的透析后Fitzy标记菊粉，并排除气泡，然后换用半英寸长、30号针头进行注射。

将透析后的 fitzy 菊粉注入小鼠眶后静脉丛。将小鼠放回原有饲养笼中，使其自然恢复。用剪刀一次性剪取小鼠尾尖约一毫米，并在注射后多个时间点使用含钠肝素的微量毛细管采集血液。

采血后用 Cha 密封剂密封毛细管，并将样本避光保存。将密封后的微型毛细管放入血细胞比容毛细管中，离心 5 分钟。使用金刚石切割器将微型毛细管折断，然后用移液器将全部血浆转移至 0.2 毫升离心管中。

在新的0.2毫升离心管中，用2微升血浆和18微升0.5摩尔/升的HEPES溶液配制1比10的稀释液。接下来，使用NanoDrop 3300对稀释后的样品取2微升进行双份测量，以实现每批六只小鼠的高通量检测。请按照文本方案中提供的流程图操作，通过单次团注法测量全肾肾小球滤过率（GFR），即在FSE菊粉注射后3、5、7、10、15、35、56和75分钟分别采集八次血液样本。

在此流程图中，数字表示采样时间点，括号内的数字表示样本编号，位于垂直红色竖线左侧的数字表示注射时间点。每只小鼠用不同颜色标记。请沿箭头方向进行连续的血液采集。

灰色框表示需根据本方案在注射前准备下一只小鼠接受异氟烷麻醉的时间点。对不同小鼠进行两次血液采集之间的最短间隔时间为一分钟。将稀释后的菊粉注射液与稀释的小鼠血浆混合，以获得文本方案中列出的标准品稀释系列。标准品的浓度将取决于透析情况，每次制备FSI菊粉时其浓度均会有所不同。

因此，每次均需输入标准曲线的浓度。使用适当的软件，按照文本方案中详细描述的双相指数衰减函数分析数据，以计算肾小球滤过率（GFR），用于在清醒小鼠中测定GFR。通过单次静脉注射给予ZI菊粉后其在血浆中的药代动力学，采用二室模型计算GFR，在该二室模型中进行相关计算。

初始的快速衰减阶段代表 fitzy 菊粉从血管内腔室重新分布到细胞外液的过程。随后较慢的衰减阶段主要反映 fitzy 菊粉从血浆中的系统性清除。1 型糖尿病通过腹腔注射链脲佐菌素诱导产生。

在诱导糖尿病之前以及诱导后五周测定GFR，糖尿病1型动物明显表现出肾小球高滤过。观看本视频后，您应充分理解如何通过单次团注技术并结合双相指数DK模型，在大鼠中测定GFR。