高通量清醒小鼠肾小球滤过率的测定方法

该程序的总体目标是向其他研究人员展示如何确定清醒小鼠的肾功能。这是通过首先将异硫氰酸荧光素或 FSE 菊粉透析 24 小时并确定其注射浓度来完成的。第二步是称量小鼠，准备准确体积的 fitzy 菊粉用于球后注射，并麻醉小鼠。

接下来，进行 Fallbar Fitzy 菊粉注射，并在 75 分钟内采集 8 份血样。最后一步是使用超微量荧光光谱仪测量 Fitz Nulin，并通过采用两相指数衰减模型来计算肾功能。最终，将 Fiti Nulin 单次推注注射法的灵敏度与荧光光谱仪的微量能力相结合，可以检测由小鼠基因改造、饮食变化或药物应用引起的肾功能差异。

与现有方法（如连续输注和麻醉条件）相比，该技术的主要优点是无需手术，即使用放射性菊粉植入渗透微型泵。这不是一个最终的实验。无需收集尿液，每天最多可测量 24 M。

我将与我实验室的研究助理 Maria Azimo 一起演示这个程序，以准备 Fitzy Nulin 注射液。称取足够 2 毫升 5% 溶液的 ZI 菊粉，加热至 90 摄氏度，将标记的菊粉溶解在 0.85% 氯化钠溶液中，直至完全溶解。将一块 20 厘米的透析膜放入双蒸水中 30 分钟，以去除膜上残留的钠酸，然后冲洗膜几次，用溶解的 Fitzy 菊粉密封剂正确填充透析膜，然后称量整个膜。

让溶解的 fitzy 菊粉在一升 0.85% 氯化钠溶液中透析，透析后在室温下避光缓慢搅拌 24 小时，再次称量整个透析膜并计算新浓度。水将渗透进入膜，未结合的 FSI 将从膜中移出。因此，FSI 菊粉的浓度将大幅降低。

使用此公式计算新的拟合 e 菊粉浓度，其中 C 是新的浓度。N 是初始拟合 E 菊粉量，V 是新体积，即透析前后透析管的重量差加上初始 Fitzy 菊粉溶液的体积。接下来，通过 0.22 微米注射器过滤器过滤对透析溶液进行消毒。

请记住，在实验前始终将 fitzy 菊粉避光保存，以避免光漂白。用 4% 至 5% ISO 氟短暂麻醉小鼠后，测量小鼠的体重。通过毒樵反射检查麻醉深度，使用 100 微升 Hamilton 注射器和半英寸长的 26 号针头抽吸每克体重 2 微升透析的 fitzy nulin 以去除气泡，然后切换到半英寸长的 30 号针头进行注射。

继续将透析的 fitzy 菊粉注射到眶后丛中。让小鼠在它们的家笼中自发恢复。用剪刀将小鼠尾巴用一毫米的杯子杯住一次，并在注射到肝素钠小毛细血管中的多个时间点收集血液。

采血后用 cha seal 密封小毛细管，并保持样品避光。将密封的微型毛细管放入血细胞比容毛细管内，离心后离心 5 分钟。使用金刚石切割机打破微型毛细管，并通过移液到 0.2 mL 试管中转移整个血浆。

新的 0.2 毫升试管中使用 2 微升血浆和 18 微升 0.5 摩尔/升堆，进行 1 到 10 的稀释。接下来，用 NanoDrop 3， 300 测量 2 微升稀释样品，一式两份，以实现 6 只小鼠的高通量。请按照文本方案中提供的流程图方案通过单次推注注射法测量全肾 GFR，必须在 FSE nulin 注射后 3、5、7、10、15、35、56 和 75 分钟收集 8 份血样。

在此流程图中，数字表示收集时间点，而括号中的数字表示样品编号、垂直红线左侧的时间点表示进样时间点。每个鼠标都标有不同的颜色。要获得连续的血液采集，请按照箭头作。

灰色框表示何时必须在使用此方案注射前为下一只小鼠准备进行 isof 氟麻醉。从不同小鼠采集两次血液之间的最短时间是用稀释的小鼠血浆稀释 Fitzy Nulin 注射液 1 分钟，以获得文本方案中列出的标准稀释度。标准品的浓度取决于透析，并且每种 FSI nulin 的制备浓度总是不同的。

因此，每次都需要为标准曲线输入浓度。通过使用文本协议中详细描述的两相指数衰减函数，分析数据以使用适当的软件计算肾小球滤过率或 GFR，以测量清醒小鼠的 GFR。单剂量静脉注射后 ZI 菊粉的血浆动力学用于计算 GFRA，在两室模型中采用两室模型。

最初的快速衰变阶段代表 fitzy 菊粉从血管内隔室到细胞外液的重新分布。后期菊粉浓度衰减较慢，主要反映血浆的全身清除率。1 型糖尿病是由腹膜内应用链脲佐菌素诱导的。

在诱导 1 型糖尿病之前和后 5 周测定 GFR 糖尿病动物明显显示肾小球高滤过。看完这个视频后，你应该对如何使用单次推注技术和采用两阶段指数 DK 模型来测量大小鼠的 GFR 有了很好的了解。