使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca²⁺ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

本实验的总体目标是利用荧光染料检测人类精子细胞内钙离子浓度的波动。首先通过上游法处理精子样本，必要时促进精子获能；第二步是将钙离子荧光染料加载到精子细胞内。

接下来，采用常规荧光光度法、停流荧光法、流式细胞术或单细胞成像技术进行实验，并记录钙离子检测结果。最终通过分析结果，确定由孕酮诱导或在精子获能过程中触发的细胞内钙离子浓度变化。与放射性同位素等现有方法相比，该技术的主要优势在于具有很高的灵敏度。

该方法操作安全且简便。此方法有助于解答表面等离子体共振（SPR）钙信号研究领域中的关键问题，例如高空间和时间分辨率下鉴定可诱导细胞内钙升高的化合物，以及鉴定西门子样品中不同的细胞亚群。例如，采用流式细胞术技术的意义可延伸至通过分析男性配子的生理状态来诊断生育问题。

尽管该方法可为研究人类精子钙离子动员提供见解，但也适用于其他类型的细胞，例如来自其他物种的雄性配子，或神经元、肌细胞等不同类型的细胞。通常，使用该方法的研究人员会面临困难，因为精子操作并不容易，且在整个实验过程中维持适当的条件以获得有活力且能运动的细胞至关重要。我们通过结合不同领域的策略，实现了这些技术的应用。

该方法的可视化演示非常重要，因为样品的制备与处理以及化合物的添加过程较难掌握：操作过程中精子细胞可能受损，且在化合物编辑期间可能产生反应假象。制备精子样品时，需将1 mL的Hams F-10培养基小心地叠加在每500 µL液化精液的上方。操作时使用移液枪，将枪头轻触离心管管壁，然后将培养基缓慢加入样品上方。

必须缓慢操作，以避免混匀样品层与培养基层。培养基中添加 2 mmol/L 氯化钙和 5 mg/mL BSA。为促进体外获能，小心将试管倾斜至约 30 度角。

这将增大两种液体之间的接触表面积，从而在孵育过程中促进精子细胞从样本向培养基的迁移或上浮。接下来，将倾斜的试管置于37摄氏度、5%二氧化碳和95%空气的培养箱中孵育1小时。孵育1小时后继续培养。

使用微量移液器小心地从每根试管中移除上层700 µL的Hams F-10培养基，该培养基中现已含有活动精子。将所有收集的样品汇集至一个洁净的玻璃试管中，避免产生气泡。取10 µL混合样品置于麦氏计数板底座的光学平玻璃上，然后盖上盖玻片。

务必避免计数室内产生气泡，因为气泡会导致细胞计数不准确。使用配备 20 倍物镜的复式显微镜进行观察。黄斑计数室的盖玻片上有一个大方格，由 100 个更小的方格组成。

计数任意一条由10个方格组成的区域中的细胞数量。该数值表示每毫升中细胞的浓度（单位为百万个细胞/毫升）。在另外两条由10个方格组成的区域中重复计数，并计算三次计数结果的平均值，以用于加载荧光染料的细胞。

在1.5毫升离心管中，加入所需体积的精子悬液，并加入适量的一毫摩尔Fluo-3/AM储备液，使最终浓度为二微摩尔Fluo-3/AM，在37摄氏度避光条件下孵育30分钟。以750 ×g离心五分钟。若形成云雾状沉淀而非致密沉淀，表明细胞状态良好。吸除并弃去上清液，用适当体积的人类精子培养基（HSM）重悬沉淀。开始本实验时，在平底玻璃管中加入570微升HSM和30微升先前加载了Fluo-3/AM并重悬于HSM中的精子细胞悬液，使细胞浓度达到每毫升一乘十的八次方个细胞。

将磁力搅拌子放入玻璃管中，并将玻璃管插入已预热至37摄氏度的分光光度计检测室中。在采集数据期间，样品必须持续搅拌。使用oli软件启动实验，并以0.5赫兹的频率连续采集300秒的荧光值。

在获取30秒的基础荧光信号后，使用Hamilton微量注射器在100秒时注入适当体积的待测化合物，本例中为微摩尔浓度的孕酮。在20微摩尔浓度时使用离子霉素作为阳性对照，以获得最大荧光值。本实验以高时间分辨率检测细胞内钙离子的变化。

使用与快速动力学光学系统联用的 SFM 20 停流混合器，将仪器的一个注射器中加入一毫升荧光标记的精子细胞，另一个注射器中加入一毫升待测化合物（20 微摩尔孕酮溶于 HSM 中）。

在此示例中，将液体吸入注射器时必须避免产生气泡。将两个仪器的活塞提起，直至其接触到注射器推杆的末端。为尽量减少细胞损伤，将总采样时间设置为50秒，频率设置为10毫秒，并将流速设置为能够提供可测量响应触发信号的最小值。

试剂混合后，原始荧光随时间变化的曲线将显示在计算机屏幕上。在进行流式细胞术之前，重复此步骤，分别用HSM作为阴性对照和10微摩尔离子霉素作为阳性对照替代孕酮。通过在每根流式管中加入500微升细胞悬液，按每种待测条件制备实验样品。

使用设备配套软件设置实验。首先，创建一个新的文件夹、实验样本以及试管数量。然后为 flu O 3:00 AM 选择合适的流式细胞仪设置，使用异硫氰酸荧光素和碘化丙啶滤光片。

在流式细胞仪中运行未染色的对照管一和对照管二。收集前向散射和侧向散射数据，以验证阈值设置是否合适，并创建相应的设门，用于区分碎片与细胞。运行实验管，并从每个样本中收集10,000个事件的荧光数据。

最后，将所有数据导出至可用于分析的软件中。通过在每张盖玻片的中央滴加5 µL多聚-L-赖氨酸溶液，制备本实验所需的圆形盖玻片。

使用前至少静置一小时，然后用水冲洗处理区域。这将去除多余的聚赖氨酸，使精子细胞头部能够附着在盖玻片上，同时其鞭毛仍可自由运动。将盖玻片组装到记录室中。

取10微升含荧光标记的细胞（浓度为每毫升1×10⁷个细胞），置于盖玻片中央。用200微升预热的HSM覆盖细胞。

将培养 chamber 置于预热至 37 °C 的显微镜载物台上，使用相差显微镜观察细胞。选择细胞密度适合成像的区域。细胞过多会导致信号重叠，从而增加分析难度。

细胞应通过其头部牢固地附着在盖玻片上，同时表现出鞭毛运动，以确认细胞活性。通过启动时间序列图像采集软件开始实验。通常每秒需要采集四幅图像，每幅图像的光照时间为2毫秒。

在活细胞模式下采集荧光图像。调整焦距和亮度。使用微量移液器小心地逐滴加入待测化合物（本例中为孕酮），并根据需要继续进行图像采集。

在同一反应腔内依次进行两次对照添加：加入20 µM 离子霉素以获得最大荧光信号，加入5 mM 氯化锰以获得最小荧光信号。使用IQ软件离线进行图像分析。

围绕每个细胞或细胞的某一部分绘制感兴趣区域（ROI）。此外，选择一个无细胞区域，以便软件进行自动背景扣除。随后，每个 ROI 将获得一个随时间变化的荧光强度序列，这些数据可导出至 Microsoft Excel 进行进一步分析。

黄体酮是已知的顶体反应诱导剂之一，正如预期的那样，通过常规荧光测定法测量发现，它可引发人精子细胞内钙离子浓度出现短暂升高。红色荧光曲线随时间变化显示了加入四微摩尔黄体酮后细胞内钙离子浓度的变化；作为阴性对照，加入了HSM，其并未引起细胞内钙离子浓度水平的改变，如蓝色荧光曲线所示；每条曲线均展示了加入10微摩尔离子霉素所诱导的变化。

加入该钙离子载体可导致RA细胞内钙浓度达到最大幅度的升高，且无法恢复至基础水平。该柱状图展示了在每种条件下荧光变化量（ΔF）的平均值，误差线表示标准误，N=3；星号表示与对照组相比，P值小于0.001。通过停流荧光测定法对孕酮诱导的细胞内钙浓度升高进行了更高时间分辨率的测量，此处展示的是代表性结果。

原始信号如图A所示，红色曲线代表的孕酮和蓝色曲线代表的离子霉素均引起细胞内钙离子浓度迅速升高。绿色曲线为阴性对照，其中细胞与HSM混合。图B显示了通过从相应的原始信号中减去对照信号后获得的经校正的孕酮或离子霉素诱导信号曲线。

孕酮引起细胞内钙浓度非常快速且短暂的升高，荧光强度最大值出现在加入诱导剂后2.7秒。另一方面，CIN则引起细胞内钙浓度快速且持续的升高，持续达50秒。图B插图展示了两种反应最初500毫秒的放大视图。

黄体酮诱导的细胞内钙浓度升高不存在延迟，这与先前的研究报告一致，表明黄体酮可直接激活钙通道catSper，无需中间信号转导。还使用流式细胞术测量了获能和未获能人精子的细胞内钙浓度。这些是具有代表性的前向散射和侧向散射图。

已获能的细胞显示为蓝色，未获能的细胞显示为红色。选定的门控区域由蓝线标出，仅该区域内的细胞被用于后续分析。图B显示了未染色精子在Fitzy通道中的荧光直方图，图D显示了在凌晨3:00染色的精子在FZ通道中的荧光直方图，如图D所示。代表已获能精子的蓝色曲线荧光值分布较代表未获能精子的红色曲线向更高荧光值方向偏移。

图C显示了未染色细胞在PI通道中的荧光直方图，图E显示了死细胞在PI通道中的荧光直方图。每个单个细胞的荧光值可以在下方的二维荧光点图中观察到。对于未染色细胞以及用Fluoh 3:00 AM和PI双染的细胞，各象限中记录的细胞百分比由红色数字标示。

重要的是，可以消除死细胞产生的信号。最后，通过成像这些代表性伪彩图像，测量了单个精子细胞中由孕酮诱导的胞内钙浓度变化，这些图像显示了在添加孕酮、CIN 和氯化锰前后细胞的可视化情况。添加孕酮会引起精子头部和尾部胞内钙浓度的升高，而氯化锰用于降低荧光信号。

本图展示了实验中九个单个细胞经归一化的代表性荧光衰减曲线，显示了凌晨3:00的荧光情况。与群体实验中观察到的结果一致，单细胞分析显示，黄体酮刺激引起瞬时性荧光升高，而离子霉素刺激则引起持续性荧光升高。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在三至四小时内完成。

在进行该实验操作时，务必注意验证细胞的活性，并在完成该操作后实施相应的对照实验。在该技术基础上，还可进一步开展其他方法，如电生理学实验，通过使用特定溶液和模拟方案来回答更多问题，例如鉴定参与钙离子升高的特异性离子通道。该技术为细胞生理学领域的研究人员探索活细胞中钙离子动态变化提供了途径，实现了高空间和时间分辨率的观测。

观看本视频后，您应能充分了解如何根据拟回答的具体科学问题，针对任何类型的细胞，选择最合适的荧光染料技术来检测细胞内钙离子浓度的升高。请务必注意，处理人源精液样本可能存在危害，操作时应采取相应预防措施，例如使用经证实健康状况合格的供体样本，在操作过程中佩戴乳胶手套，并对使用过的溶液和材料进行妥善处置。