测量细胞内Ca +
May 24th, 2013
细胞内Ca +动力学是非常重要的，在精子生理学和Ca +敏感的荧光染料构成一个多功能的工具来研究它们。人口实验（荧光和停流荧光）和单细胞实验（流式细胞仪和单细胞成像）是用来跟踪时空的[Ca +]在人类精子细胞中的变化。
该程序的总体目标是用荧光染料测量人类精子中的细胞内钙波动。这是通过首先通过游动法制备精子样本，并在需要时促进获能来实现的。第二步是用钙荧光染料加载精子。
接下来，使用常规荧光法停止流式荧光法、流式细胞术或单细胞成像，进行实验并记录钙测量值。最终，分析结果以确定由黄体酮触发或在获能过程中触发的细胞内钙浓度的变化。与涉及放射性的现有方法相比，这种技术的主要优点是这是一个非常敏感的过程。
它安全且易于执行。该方法可以帮助回答 SPR 钙信号传导领域中的关键问题，例如鉴定诱导细胞内钙的化合物，随着高空间和时间分辨率的增加而增加，以及鉴定西门子样品中不同的细胞亚群。例如，使用流式细胞术技术的影响延伸到通过分析男性色域的生理状态来诊断生育问题。
尽管这种方法可以为人类精子钙动员的研究提供见解，但它也可以应用于其他类型的细胞，例如来自其他物种的雄性细胞或不同类型的细胞，例如神经元或肌肉细胞。通常，使用这种方法的人会很挣扎，因为精子处理并不容易，重要的是要保持适当的条件以通过实验获得活细胞和运动细胞。我们通过组合使用不同领域的策略来实现这些技术的使用。
这种方法的视觉演示很重要，因为样品的制备和处理以及化合物的添加很难学习，因为精子细胞在过程中可能会受损，并且在化合物的编辑过程中可能会获得反应中的伪影。为了制备精子样本，必须将 1 毫升 hams F 10 培养基小心地分层在每 500 微升液化精液的顶部。Eloqua，用微量移液管的尖端接触管壁，然后轻轻分配样品上方的培养基。
缓慢进行以避免混合样品层和培养基层至关重要。该培养基补充有 2 毫摩尔氯化钙和每毫升 5 毫克 BSA。为了在体外促进获能，请小心地将试管倾斜至约 30 度角。
这将增加两种液体之间的表面积，从而增强孵育过程中精子细胞从样品到培养基的位移或游动。接下来，将瘦试管放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。95% 空气 1 小时后 1 小时。
使用微量移液管小心地从每根管中取出上部 700 微升的 hams F 10 培养基，该培养基现在含有 motil 精子。将所有收集的样品汇集到一个干净的玻璃管中，避免形成气泡。将 10 微升混合样品放在黄斑计数室底座的光学平板玻璃上，然后放置盖玻片。
确保避免在腔室内形成气泡，因为这会导致细胞计数不准确。在配备 20 x 物镜的复合显微镜下观察。黄斑计数室的盖玻片有一个由 100 个小方块组成的大方块。
对任意 10 个方格的单元格进行计数。该数字表示细胞浓度（以每毫升数百万个细胞为单位）。在另外两个 10 个方形条带中重复计数，并计算三个计数的平均值，以用荧光染料加载细胞。
将所需体积的精子悬液与足够的 1 毫摩尔流感 oh 3：00 AM 储备溶液混合，以获得最终浓度为 2 微摩尔流感 oh 3：00 AM 在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，并在避光下将试管以 750 G 离心 5 分钟。云而不是颗粒的形成表明细胞状况良好，吸出并丢弃上清液，并将沉淀重悬于适当体积的人精子培养基或 HSM 中。要开始该实验，请在平底玻璃管中混合 570 微升 HSM 和 30 微升精子细胞悬液，这些精子细胞悬液先前在凌晨 3：00 加载了流感，并重悬于 HSM 中，以获得每毫升 10 倍至第 8 个细胞。
将磁力搅拌棒放入玻璃管内，并将磁力搅拌棒插入预热至 37 摄氏度的光谱仪读数室中。在整个采集过程中必须搅拌样品。使用 oli 软件开始实验，并在 300 秒内以 0.5 赫兹的频率获取荧光值。
获得基础荧光 30 秒后，使用 Hamilton Micro 注射器在 100 秒时注射适当体积的测试化合物，在本例中为微摩尔黄体酮。在 20 微摩尔离子 mycin 作为阳性对照以获得最大荧光值。在该实验中，以高时间分辨率测量细胞内钙变化。
使用与狂热动力学光学系统耦合的 SFM 20 停流混合器，在其中一个仪器注射器中填充 1 毫升 flu。凌晨 3：00 加载精子细胞，第二个注射器中加入 1 毫升待测化合物。20 微摩尔黄体酮溶于 HSM。
在此示例中，在将液体吸入注射器时避免形成气泡至关重要。抬起两个器械活塞，直到它们接触到注射器柱塞的尖端。在这种情况下，将总采样时间设置为 50 秒，将频率设置为 10 毫秒，以尽量减少细胞损伤，将流速设置为将提供可测量响应触发器的最小值。
试剂的混合、原始荧光与百里香的痕迹将显示在计算机屏幕上。重复此过程，在流式细胞术之前，用 HSM 作为阴性对照和 10 微摩尔离子霉素作为阳性对照替换黄体酮。在每种待测条件下，每个细胞仪试管放置 500 μL 细胞悬液来制备实验样品。
使用设备软件设置实验。首先，创建一个新文件夹、实验样品和试管数量。然后为流感 O 选择合适的细胞仪设置凌晨 3：00。使用异硫氰酸荧光素和碘化丙啶过滤器。
在细胞仪中运行未染色的对照管 1 和 2。收集前向和侧向散射数据，以验证阈值设置是否合适，并创建相应的门，以便区分细胞中的碎片。运行实验管并从每个样品的 10， 000 个事件中收集荧光数据。
在最后。将所有数据导出到可用于分析的软件。通过将 5 微升聚 L 赖氨酸溶液滴在每个盖玻片的中心，准备此过程所需的圆形盖玻片。
使用前至少放置一小时，用水冲洗处理过的区域。这将去除多余的聚赖氨酸，并允许精子细胞粘附在头部的盖玻片上，而它们的鞭毛仍然可以移动。在记录室内组装盖玻片。
放置 10 微升流感 oh 3：00 AM 加载的细胞，浓度为每毫升 10 倍至第七个细胞。在盖玻片的中央。用 200 微升预热 HSM 覆盖细胞。
将腔室放在显微镜的载物台上，预热至 37 摄氏度，并使用相差观察细胞。选择细胞密度适合成像的区域。由于信号重叠，细胞过多会使分析变得困难。
细胞应通过其头部牢固地附着在盖玻片上，但表现出鞭毛运动，这证实了活力。通过激活时间序列图像采集软件开始实验。通常，每秒需要 4 张图像，每张图像的照明时间为 2 毫秒。
在实时模式下采集荧光图像。调整焦距和亮度。在这种情况下，使用微量移液器小心地滴加测试化合物黄体酮，并根据需要继续图像采集。
在同一腔室中进行两次连续对照添加。20 微摩尔离子霉素以获得最大荧光，5 毫摩尔氯化锰以获得最小荧光。使用 IQ 软件离线执行图像分析。
在每个单元格或单元格的一部分周围绘制感兴趣的区域或 ROI。此外，选择一个无单元格区域，以便软件自动扣除背景。然后获得每个 ROI 的时间荧光强度序列，这些数据可以导出到 Microsoft Excel 以供进一步分析。
黄体酮是已知的顶体反应诱导剂之一，正如预期的那样，通过常规荧光法测量的人精子中细胞内钙浓度短暂增加。红色荧光迹线与时间的关系显示，添加 4 微摩尔黄体酮作为阴性对照 HSM 引起的细胞内钙浓度变化，这不会引起细胞内钙浓度水平的任何变化，如蓝色荧光迹线作为阳性对照所示。显示了每条迹线由 10 微摩尔离子 mycin 诱导的变化。
添加这种钙离子载体会导致 RA 细胞钙浓度增加，而不会恢复到基础水平。该条形图显示了每种条件下荧光 delta F 的平均变化，正负标准误差，其中 N 等于 3，星号表示与对照相比 P 值小于 0.001。通过停流荧光法以更高的时间分辨率测量孕激素诱导的细胞内钙浓度增加，代表性结果如下所示。
原始痕量显示在图 A 中，红线表示的孕酮和蓝线表示的离子霉素都导致细胞内钙浓度快速增加。绿色迹线是细胞与 HSM 混合的阴性对照。图 B 显示了黄体酮或离子霉素诱导的信号的校正迹线，该信号是通过从相应的原始信号中减去控制信号获得的
。黄体酮导致细胞内钙浓度非常快速和短暂地增加，在添加电感器后 2.7 秒出现最大荧光值。另一方面，CIN 导致细胞内钙浓度在 50 秒内快速和持续增加。面板 B 中的插图显示了每个响应的前 500 毫秒的展开视图。
黄体酮诱导的细胞内钙浓度增加没有延迟与先前的报道一致，表明黄体酮直接激活钙通道 cat 刺，而没有中间信号。还使用流式细胞术测量了有能力和无能力的人精子中的细胞内钙浓度。在这些代表性的前向和侧向散点图中。
有容量的细胞为蓝色，非有容量的细胞为红色。所选门用蓝线表示，并且仅使用该区域内的细胞进行进一步分析。图 B 显示了来自未染色精子的 Fitzy 通道中的荧光直方图，图 D 显示了在图 D 中观察到的来自流感 oh 3：00 AM 染色精子的 FZ 通道中的荧光直方图。
图 C 显示了未染色细胞的 PI 通道中的荧光直方图，图 E 显示了死细胞的 PI 通道中的荧光直方图。每个细胞的荧光值可以在此处显示的二维荧光点图中观察到。对于未染色的细胞和用 flu oh 3：00 AM 和 pi 双重染色的细胞，每个象限中记录的细胞百分比由红色数字表示。
重要的是，可以消除死细胞产生的信号。最后，通过成像这些代表性伪彩色图像显示细胞在添加黄体酮、CIN 和氯化锰开始时和之后可视化的细胞，在单个精子细胞中测量黄体酮诱导的细胞内钙浓度变化。添加黄体酮会导致细胞内钙浓度增加，在精子头部和 lum 氯化锰中都用于降低流感。
OH 3：00 AM 荧光通过淬灭实验中 9 个单个细胞的代表性归一化荧光迹线显示在此图中。正如在群体实验中观察到的那样，单细胞分析显示孕酮和离子霉素分别短暂和持续增加。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。
在尝试此过程时，重要的是要记住验证细胞的活力并按照此程序执行适当的控制。可以执行其他方法，如电生理学，以回答其他问题，例如通过使用 proppe 溶液和模拟方案来识别参与钙增加的特定离子通道 在其开发后。这项技术为细胞生理学领域的研究人员以高空间和时间分辨率探索活细胞中的钙动力学铺平了道路。
观看本视频后，您应该很好地了解如何选择最合适的技术，根据您想要回答的具体问题，在任何类型的细胞中使用荧光染料测量细胞内钙的增加。不要忘记，处理人类西门子样品可能很危险，需要采取预防措施，例如使用经证实健康的供体。在执行此过程时，应始终在手术过程中使用乳胶球并适当处理溶液和材料。
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概述
本研究重点在于使用荧光染料测量人类精子细胞内钙的波动。该方法允许追踪钙浓度的时空变化，这对于精子生理学至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 细胞内Ca2+动态对精子功能至关重要。
- 钙敏感荧光染料是研究这些动态的有效工具。
- 了解钙的波动可以提供有关精子获能和受精的见解。
- 现有方法可能在灵敏度方面不如荧光技术。
研究目的
- 测量人类精子细胞内的钙水平。
- 分析孕激素和获能对钙浓度的影响。
- 为涉及放射性的传统方法提供一种灵敏的替代方案。
使用的方法
- 使用游动上升法准备精子样本。
- 用钙荧光染料加载精子。
- 利用荧光光度法、停流荧光光度法、流式细胞术和单细胞成像。
- 在实验过程中记录和分析钙的测量。
主要结果
- 成功追踪精子细胞内钙的波动。
- 识别获能过程中钙浓度的变化。
- 展示了荧光染料技术的灵敏度。
- 对钙在精子生理学中的作用提供见解。
结论
- 荧光染料技术对于研究精子钙动态是有效的。
- 钙的波动对于理解精子功能至关重要。
- 该方法为传统方法提供了一种灵敏的替代方案。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring intracellular calcium dynamics in human sperm provides critical insights into reproductive biology and enables the identification of compounds that modulate sperm function. This capability supports target validation in reproductive health research by linking calcium signaling to key physiological processes such as motility, capacitation, and the acrosome reaction. The method’s sensitivity and multi-scale resolution—spanning population to single-cell levels—enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on fertility therapeutics and diagnostic biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of calcium-mediated signaling pathways involved in sperm activation and fertilization.
- Operational Value: Supports functional validation of targets by linking compound exposure to real-time intracellular calcium changes.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing transient versus sustained calcium responses indicative of different modes of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-responsive calcium readouts suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables standardization across fluorometry, flow cytometry, and imaging platforms for reproducible flux measurements.
- Scalability: Flow cytometry allows analysis of 10,000 events per sample, supporting population-level screening and subpopulation discrimination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro calcium responses to physiological outcomes such as capacitation and acrosome reaction induction.
- Biomarker Alignment: Fluorescence shifts in capacitated versus non-capacitated sperm provide a quantifiable readout for maturation state.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables stratification of sperm subpopulations based on dye uptake and viability, improving sample consistency in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional readouts that bridge compound screening with phenotypic outcomes in reproductive cell systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of GPCR and ion channel modulators via real-time calcium flux measurements triggered by progesterone or ionophores.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs enabling comparison of compound potency and kinetics across techniques.
- Analytics: Generates temporal resolution data (e.g., 2.7-second peak response to progesterone) and population distributions for hit validation and mechanism classification.
- Translational Research: Links calcium changes to functional sperm states, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation of fertility-related targets.
- Enterprise Reuse: The calcium-dye loading protocol is adaptable across cell types (e.g., neurons, muscle), enabling platform reuse beyond reproductive biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating compound exposure with defined calcium signatures (transient, sustained, or absent).
- Operational Value: Standardized dye loading and instrument setup improve reproducibility across laboratories and sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds that elicit physiologically relevant calcium responses in human gametes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on calcium response profiles linked to fertility outcomes.
Implementation Considerations
- Expertise in sperm handling and viability assessment is required to maintain motile cells throughout experimentation.
- Instrumentation includes spectrofluorometers, stopped-flow mixers, flow cytometers, and fluorescence microscopes with environmental control at 37°C.
- Standardization across teams requires consistent gating strategies (e.g., forward/side scatter) and ROI selection for imaging-based analysis.
- Adaptation to other cell types necessitates optimization of dye loading, incubation time, and quenching controls.
- Practical limitations include sperm fragility, potential for procedural artifacts, and the need for careful compound addition to avoid mixing-induced variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:38
Sperm Sample Preparation by the Swim-up Method
4:52
Fluorescent Dye Loading for Ca2+ Measurements
5:41
Conventional Fluorometry
6:59
Stopped Flow Fluorometry
8:30
Flow Cytometry
9:40
Single Cell Imaging
12:11
Results: Progesterone Induces Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm Detected by Fluorometric Techniques
17:59
Conclusion
