Name: 一种新型的体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习从晚期小鼠胚胎中分离和培养心脏的方法，使用稀释Matrigel进行长期体外观察。该技术有助于研究心脏发育和功能，为先天性心脏病研究提供重要工具。

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我们感谢Andrea Portbury对稿件的审阅，以及美国国立卫生研究院（NIH）（资助号：R01HL061656）提供的资金支持。

1. 胚胎心脏的切除
<ol>
	<li>使用经批准的安乐死方法，在所需胚胎发育天数处死一只定时妊娠小鼠。所有实验均经北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会批准。</li>
	<li>解剖前用70%乙醇充分喷洒雌鼠。打开雌鼠腹腔，取出并切除子宫角。</li>
	<li>将子宫角置于含有冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，根据需要进行冲洗。沿中线切开子宫角，暴露附着的胚胎囊。</li>
	<li>切开一个胚胎囊并取出胚胎。将胚胎放入另一个盛有冷PBS的培养皿中。将装有子宫角的培养皿放回冰上。</li>
	<li>切除胚胎头部以更好地暴露胸壁。如需基因分型，将尾部剪下并保存在置于冰上的EP管中。</li>
	<li>将胚胎仰卧放置，切开胸壁以观察心脏和肺。根据发育阶段不同，胸壁可能呈透明状。</li>
	<li>用镊子小心提起心脏，剪断下方血管，再剪断大血管上方组织以游离心脏。如有必要，去除多余组织。</li>
	<li>将心脏放入24孔板的一个孔中，孔内预先加入冷PBS，并将培养板置于冰上。</li>
	<li>重复上述步骤，直至从所有胚胎中取出心脏。</li>
</ol>
2. 培养体系的建立
<ol>
	<li>在超净工作台中，将冷的 Matrigel 与所需培养基混合（例如 以1:1的比例将10%胎牛血清（FBS）加入杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。请勿预先加热培养基。</li>
	<li>将稀释的Matrigel保持在冰上，用移液器吸取500–1,000 μl稀释液，加入同样置于冰上的24孔培养板的一个孔中。</li>
	<li>在通风橱内，小心拿起切除的心脏，并将其放入含有 Matrigel 的培养皿的孔中，同时保持培养皿置于冰上。</li>
	<li>如果包埋心脏的方向至关重要：将倒置显微镜及周围空间充分喷洒70%乙醇。在超净台内，将离体心脏置于含有Matrigel的培养板孔中，操作时仍需保持冰上。随后将培养板置于显微镜下，趁Matrigel开始凝固前迅速调整离体心脏的方向。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中2）并让 Matrigel 凝固约 30 分钟。</li>
	<li>向每个含有心脏的孔中加入1 ml预热的培养基。</li>
	<li>心脏可在培养条件下维持至少四天。建议每两天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 固定与可视化
<ol>
	<li>如需观察活体心脏，可加入荧光活细胞染料（e.g. Syto-16）。成像仅限于根据心脏包埋位置所可见的一侧。</li>
	<li>若需进行培养后分析（e.g. 整体成像或切片），请移除培养基并替换为冷的4%多聚甲醛。将培养皿置于冰上固定30分钟。</li>
	<li>待冷多聚甲醛与冰促使Matrigel溶解后，弃去固定液（及Matrigel），更换新鲜多聚甲醛，并于4 °C过夜固定心脏。</li>
	<li>用缓冲液（e.g. PBS或Tris）洗涤心脏，并于4 °C保存，待后续分析使用。</li>
</ol>

<ol><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF-BMP+signaling+axis+regulates+outflow+tract+valve+primordium+formation+by+promoting+cushion+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation.</a> Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5, 62-66 (2009).</li>
<li>Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+contractile+characteristics+of+human+myocardium+in+multi-day+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).</li>
<li>Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+and+Fgf10+play+opposing+roles+during+lung+bud+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis.</a> Development. , 127-2695 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+ML+%22Cardiac+Development%22">Cardiac Development</a>. , Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Arima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

目前的培养体系对小鼠胚胎心脏研究具有显著优势。该培养体系能够维持心肌收缩功能和冠状血管丛，即使在体外培养四天后，也仅有有限的坏死迹象。此外，半固体基质为发育中心脏的三维形态提供了足够的支撑，同时允许心脏灵活收缩，并在培养过程中固定包被微珠的位置。尽管具有上述支撑作用，该基质仍可渗透荧光染料（如Syto 16），从而实现对活体心脏的荧光分析。
 切片培养方法将含有冠状血管丛部分的心脏切片置于多孔膜上，通过毛细作用在气液界面维持供氧7。相比之下，以往的全心脏培养方法依赖于摇动培养，且研究仅限于功能性冠状血管系统尚未形成的胚胎时期2,3,5。然而，采用当前技术，可在冠状血管丛形成后轻松进行心脏培养，而无需额外构建气液界面的复杂条件。
 尽管我们担心晚期胚胎心脏（例如 E16.5）在体外培养较长时间后会发生坏死，但在培养四天后（即 相当于出生后第1天的心脏）仅观察到有限的坏死现象。原始方案在使用胚胎肺芽时10未报告出现坏死，但其所用肺...

近年来，转基因小鼠一直是研究心脏发育缺陷的主要模型系统。然而，其他模式生物（如斑马鱼）已被证明在某些方面具有显著优于小鼠的优势。斑马鱼的三大优势包括：体外产卵，便于获取胚胎；胚胎具有光学透明性，可方便地观察心脏发育过程；以及易于施加小分子处理以调控胚胎发育1。因此，开发一种能够在体外支持胚胎器官培养的技术，将至少部分克服当前研究转基因小鼠发育过程的科研人员所面临的局限性。
	离体心脏培养系统已在鸡和小鼠胚胎中建立，可用于小分子处理，并分析心脏不同区域之间如何进行通讯2-6。对于完整小鼠心脏的培养，可将胚胎发育至妊娠第（E）12.5天及更早期的心脏取出，置于培养基中进行培养，培养方式可选择静置或振荡2,3,5。利用该技术，胚胎心脏已成功培养至相当于E13.5的发育阶段，而采用振荡培养的条件可使心脏（从E10.5开始）维持培养长达三天3。然而，尚无研究报道对更晚期胚胎心脏的成功培养。同样，挽救实验也仅限于将治疗剂全局性地添加至培养基中2。
	一种切片培养系统已被用于较年轻的心脏，例如 E12.5 小鼠心脏和汉密尔顿-哈密尔顿分期 36 阶段（约相当于小鼠 E16）的鸡心脏，该系统通过切除心脏、包埋并使用振动切片机进行切片。2,4,6以及较年长的心脏，例如出生后和成年小鼠心脏及成年人大心脏7,8虽然胚胎分析通常采用150 μm厚的切片2,4切片厚度可达500 μm，且无缺氧迹象8这些切片培养物已成功维持长达两个月，且大部分切片在此期间始终保持收缩功能。9与分离的心肌细胞研究相比，这些心脏切片培养物能够实现心肌细胞与其邻近细胞类型的共培养，为研究提供了有效的方法。 离体 分析。然而，这些培养体系的建立比单纯将心脏置于培养基中更为复杂例如 将活体心脏包埋以用于振动切片机切片，并且任何分析显然仅限于切片内心脏的局部区域。
	鉴于上述小鼠胚胎心脏培养存在的局限性以及可供研究的大量转基因小鼠资源，我们开发了一种 离体 类似于Weaver开发的离体肺培养系统的小鼠心脏培养系统 等10 我们的培养系统可实现对完整小鼠胚胎心脏内冠状动脉循环重建过程的长期培养与可视化观察。此外，通过使用Matrigel，可将微珠固定在心脏附近，从而实现对局部区域施加治疗剂。这些实验可在不同的发育时间点进行，以比较特定处理对冠状动脉形成等发育过程的影响。由于小分子能够穿透Matrigel，该培养系统还可用于将心脏的不同解剖区域并置培养，以确定特定的细胞间接触是否为某些发育过程所必需，或一个区域向另一个区域的旁分泌信号是否必要。
	该培养系统相对简单，与组织切片培养系统不同，它使用的是大多数实验室中常见的基础培养试剂和装置。简而言之，将分离的胚胎心脏置于稀释的Matrigel中进行培养，Matrigel可提供一种半固体支撑。这种支撑足以维持心脏的三维形态，同时允许心脏进行收缩。利用该系统，可将较晚期小鼠胚胎（E14.5–E16.5）的完整心脏在体外培养长达四天。整个冠状血管丛均得以保留，而在切片培养中则无法实现，因此心脏不同区域之间发生的各种信号传导线索仍可存在。此外，活细胞荧光染料能够穿透Matrigel，从而实现对活体心脏的可视化观察；同时，可将蛋白偶联微珠放置于心脏附近，以提供局部的信号刺激源。上述优势使该技术成为研究小鼠胚胎心脏发育过程的理想方法。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>妊娠期小鼠</td><td></td><td></td><td>在感兴趣的胚胎阶段进行解剖</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>按13中的说明使用</td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型方法 离体 小鼠胚胎心脏培养方法

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

小鼠的发育研究因胚胎在妊娠期间难以接触而受到限制。因此，分离并培养特定器官的实验方案对于观察发育过程中的变化以及探索新的治疗策略至关重要。为了促进妊娠晚期胚胎心脏的长期培养，我们建立了一种将离体心脏置于半固体、稀释Matrigel中进行培养的方案。该基质能够提供足够的支撑以维持心脏的三维结构，同时又具有足够的弹性以允许心脏持续收缩。简言之，将胚胎心脏取出后，置于冰冷的Matrigel与生长培养基按1:1比例混合的溶液中。待稀释的Matrigel凝固后，向培养皿中加入生长培养基。即使在胚胎发育第16.5天取出的心脏，也可在离体后存活四天。对冠状血管丛的分析表明，该方法不会干扰冠状血管的正常发育。因此，我们提出了一种适用于胚胎心脏长期培养的新方法。

使用该技术后，心脏可保持其三维形态并维持活性，表现为持续的收缩活动（视频 1）。这些收缩在心房中的表现始终比在心室中更为明显。培养后的心脏可进行固定，并用于免疫组织化学或组织学处理，以检测特定标志物的表达或观察组织结构。 图1A 显示经24小时培养、固定并进行免疫组织化学处理以标记内皮细胞的胚胎小鼠心脏心室基底部及大动脉。这些共聚焦显微图像表明，冠状血管的形态与从同龄胚胎中取出并维持的心脏相似 在子宫内 (图1B）。然而，培养的心脏中的冠状血管 离体 确实比在子宫内维持的心脏更小。在两个心脏中，均切除了心室的尖端，以使抗体更好地进入组织。
 苏木精和伊红（H&amp;E）对E16.5期取出并培养的心脏进行分析 离体 培养4天后显示，整体形态结构保持良好，包括大动脉的管壁图2A) 以及心室和室间隔的心肌组织图2B心脏的结构保持完整。尽管缺乏血液循环，冠状动脉开口仍...

小鼠的发育研究因胚胎在妊娠期间难以接触而受到限制。为了促进妊娠晚期胚胎心脏的长期培养，我们建立了一种将离体心脏在半固体、稀释的Matrigel中进行培养的方案。

小鼠的发育研究因胚胎在妊娠期间难以获取而受到限制。因此，需要建立分离并培养单个胚胎的实验方案。

本实验的总体目标是切除胚胎心脏以进行离体培养。首先从怀孕雌性小鼠体内取出子宫角，随后获取胚胎并进行解剖前准备。然后打开胚胎胸壁以暴露心脏。最后，将心脏切除并置于含有稀释基质胶的培养孔中。最终，可通过明场显微镜观察获得显示健康活体心脏的结果。与摇动培养等其他方法相比，该技术的主要优势在于，既可以通过局部作用因子（如与微珠偶联的蛋白质）处理心脏，也可以通过全局作用因子（如向基质胶中添加小分子）进行处理。该技术的应用意义在于为心血管疾病的治疗提供了可能，因为它能够在完整器官的背景下，研究心脏特定节段内的生物学事件。在选定的胚胎发育阶段，对定时妊娠的小鼠实施安乐死后，采用贵机构批准的技术，先用70%乙醇充分喷洒雌鼠体表，然后打开腹腔，取出并切除子宫角。将子宫角置于含有冷的一倍浓度 PBS 的培养皿中并冲洗。将培养皿放在冰上，待解剖时取出。然后沿中线切开子宫角，暴露附着的胚胎囊。切开胚胎囊，将胚胎放入含有冷PBS的第二个培养皿中。将带有子宫角的培养皿置于冰上。切除胚胎头部后，将胚胎背侧朝上放置并进行切割。打开胸壁以观察心脏和肺。根据发育阶段的不同，胸壁可能是透明的。如果需要进行基因分型，请保存胚胎的尾部。用镊子小心提起心脏，剪断下方的血管，然后在大血管上方剪断以分离心脏。如有必要，去除多余的组织。将心脏置于盛有冷 PBS 并置于冰上的 24 孔板的一个孔中。重复解剖操作以分离所有胚胎心脏。在超净工作台中，将冷的基质胶与所需的培养基按 1:1 的比例混合，同时将稀释的基质胶保持在冰上。将500至1000微升溶液用移液器加入24孔培养板的各孔中，培养板置于冰上。小心挑取切除的心脏组织，放入含有Matrigel的培养板各孔中。如果嵌入的心脏方向至关重要，可使用70%乙醇充分喷洒倒置显微镜及其周围空间。随后在超净台内操作，将心脏放置于冰上基质胶的孔中。将培养板置于显微镜载物台上，并在基质胶开始凝固前迅速调整心脏的方向。将培养皿置于加湿的37摄氏度培养箱中，使基质胶凝固约30分钟。向每个含有心脏的孔中加入1毫升预热的培养基。心脏在培养条件下可存活至少四天。如有需要，可添加荧光活细胞染料，例如 cyto 16。由于心脏在包埋时的位置限制，活体心脏成像将仅限于可见的一侧。若需进行整体封片成像或切片，则应去除培养基。用冰冷的4%甲醛替换，并将培养皿置于冰上30分钟。Matrigel溶解后，更换固定液和Matrigel，加入新鲜甲醛，在4°C下固定心脏过夜。用PBS或Triss洗涤心脏，并在4°C下保存，直至进一步分析。在体外培养24小时后，冠状血管的形态与在子宫内发育至相同胎龄后取出的心脏相似，如图所示。在胚胎发育第16.5天（E16.5）取出心脏并在体外培养四天后，经苏木精-伊红染色分析显示，尽管缺乏血液循环，心脏的整体形态仍保持完整，包括大动脉壁以及心室和室间隔心肌。冠状血管清晰

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科研

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生物学

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