一种新型的体外
May 24th, 2013
在鼠标发展研究的胚胎在妊娠期间的交通不便阻碍了。为了促进长期培养的胚胎心脏在妊娠后期，我们开发了一种半固体，稀基底膜培养协议，其中切除心脏。
该程序的总体目标是切除胚胎心脏以进行离体培养。这是通过首先从怀孕的雌性小鼠身上取回子宫角来实现的。接下来，取出胚胎并准备解剖。
然后打开胚胎胸壁以观察心脏。最后，切除心脏并置于含有稀基质胶的培养孔中。最终，通过在明场显微镜下观察，可以获得显示健康活心脏的结果。
与其他方法（如摇动培养）相比，该技术的主要优点是可以用局部试剂（如与珠子偶联的蛋白质）或整体试剂（例如向基质胶中添加小分子）处理心脏。这项技术的含义延伸到心血管疾病的治疗，因为它允许在整个完整器官的背景下检查心脏特定部分内的事件。在所需的胚胎日对定时怀孕的小鼠实施安乐死后，使用贵研究所批准的技术，在打开腹腔并取出和切除子宫角之前，用 70% 乙醇大量喷洒雌性。
将子宫角放入含有冷 XPBS 的培养皿中并冲洗干净。将培养皿放在冰上，直到准备好解剖。然后通过中线切开子宫角，露出附着的胚胎袋。
切开一个胚胎袋，将胚胎放入装有冷 PBS 的第二个培养皿中。将带有子宫角的培养皿放在冰上。将胚胎斩首后，将胚胎仰卧并切割。
打开胸壁以观察心脏和肺部。根据舞台的不同，胸壁可能是透明的。如果要进行基因分型，请保存胚胎的尾巴。
使用镊子小心地提起心脏并切开下面的血管。然后切开大血管，释放心脏。如有必要，去除外来组织。
将心脏放入装满冷 PBS 的 24 孔培养皿的一个孔中，并置于冰上。重复解剖以分离所有胚胎心脏。在层流罩中，将冷基质凝胶和所需的培养基以一比一的比例混合，同时将稀释的基质凝胶保持在冰上。
将 500 至 1000 微升溶液移液到 24 孔培养物的孔中。把它放在冰上。小心地挑选切出的心脏并将其放入含有基质胶的培养皿的各个孔中。
如果嵌入心脏的方向至关重要，请使用 70% 乙醇大量喷涂倒置显微镜和周围空间。然后在引擎盖中工作后，将心脏放入冰上的垫凝胶孔中。将板放在显微镜载物台上，并在垫状凝胶开始凝固时快速定位心脏。
将培养皿置于加湿的 37 摄氏度培养箱中，让基质凝胶凝固约 30 分钟。向每个含有心脏的孔中加入 1 毫升预热的培养基。心脏可以在培养物中保留至少四天。
如果需要，添加荧光活细胞模具，例如 cyto 16。为了可视化实时心脏，摄影将仅限于根据心脏嵌入位置可见的一侧。如果要进行全镶嵌成像或切片，请去除培养基。
用 4% 的冷甲醛代替，将盘子放在冰上 30 分钟。基质胶溶解后，用新鲜甲醛替换固定剂和基质胶，并在 4 摄氏度下固定心脏过夜。用 PBS 或 Triss 清洗心脏并储存在 4 摄氏度直至进一步分析。
当离体培养 24 小时时，冠状动脉脉管系统看起来类似于从维持在子宫内的相当老化的胚胎中切除的心脏，如图所示。在 E 16.5 处切除并离体培养 4 天的心脏的 Hemat、toin 和 eoin 分析表明，尽管缺乏循环，但整体形态，包括大动脉壁以及心脏的心室和室间隔心肌仍然完好无损。如箭头所示，冠状动脉骨很明显。
然而，用箭头指示的 DNA 片段化以及用 h 和 d 观察到的 DNA 片段化，在致密的心肌和大血管周围很明显。此外，与在子宫内发育的 E 18.5 胚胎的心脏相比，心肌的密度较低，即使离体培养的心脏仍在跳动。因此，这些心脏可以维持的时间长度或阶段是有限的。
这种培养技术也可用于荧光标记心脏，而在与内皮特异性荧光染料孵育后的培养中，心脏培养 48 小时。在这种情况下，根据心脏的方向和组织的混浊，可视化受到限制。随后通过心室心肌的组织学切片证实，细胞 16 可以穿透细胞外层以标记心室内的心外膜下血管，并与选择素共定位，如此处所示体外培养 30 小时后，从 E 14.5 胚胎中切除的心脏在心房和心室之间显示出一致的收缩和起搏。
执行此技术时，切除心脏时要轻柔小心。看完这个视频，你应该对如何切除和培养胚胎小鼠心脏有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种从晚期小鼠胚胎中切除并培养胚胎心脏的协议。心脏被培养在半固态的稀释Matrigel中，以便于长期观察和研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 心血管研究
- 小鼠模型
背景
- 在妊娠期间获取胚胎结构具有挑战性。
- 体外培养技术可以增强胚胎发育的研究。
- Matrigel为培养的组织提供了支持性环境。
- 了解心脏发育对于洞察先天性心脏缺陷至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的培养胚胎心脏的方法。
- 实现对心脏发育的长期观察。
- 促进心脏功能和发育的研究。
使用的方法
- 从孕鼠中取出子宫角。
- 解剖以接触胚胎心脏。
- 切除心脏并将其置于稀释Matrigel中。
- 在明视野显微镜下观察培养的心脏。
主要结果
- 该协议成功允许切除胚胎心脏。
- 心脏保持活力并可以在培养中观察。
- 结果显示培养环境中的心脏功能健康。
- 这种方法可用于进一步的发育研究。
结论
- 开发的协议对长期培养胚胎心脏有效。
- 这种方法可以增强对心脏发育的研究。
- 未来的研究可以利用这种方法来探索与心脏相关的现象。
常见问题
Executive Industry Relevance
This ex vivo culture method enables sustained observation of embryonic mouse heart development, supporting target validation in cardiovascular research by maintaining organ-level physiology outside the uterus. The approach provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of therapeutic candidates affecting cardiac morphogenesis and function. It bridges early discovery with preclinical assessment by preserving three-dimensional structure and contractility for up to four days post-dissection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in an intact organ context without confounding maternal circulation.
- Operational Value: Supports functional target validation by preserving coronary plexus development and myocardial structure.
- Predictive Value: Facilitates assessment of compound effects on heart morphology and contractility over multiple days.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized platform for quantitative imaging of vascular and myocardial parameters.
- Reproducibility: Dilute Matrigel matrix supports consistent tissue embedding and orientation across replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well format for parallel compound testing and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models late-gestation heart development (E14.5-E16.5) for studying congenital defect mechanisms.
- Translational Continuity: Allows progression from organ culture to histological analysis (e.g., cyto16 labeling, fixation) for target engagement verification.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of vascular and myocardial integrity under experimental perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, supporting iterative design-make-test-analyze cycles in cardiovascular drug discovery.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling live imaging of heart development and response to pharmacological agents.
- Screening: Delivers quantitative outputs via bright-field and fluorescence microscopy for assessing structural and functional endpoints.
- Analytics: Generates measurable data on coronary plexus formation, myocardial density, and contraction patterns for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through fixation, sectioning, and biomarker co-localization (e.g., cyto16 with selectin).
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable organ culture platform applicable across multiple study designs and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac development studies by maintaining intact organ architecture.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized Matrigel preparation and culture conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional readouts on heart viability and structure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on developmental toxicity and target engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling.
- Dependent on access to laminar flow hoods, incubators, and microscopy systems.
- Necessitates standardization of Matrigel dilution and temperature control for consistent gelation.
- Limited to embryonic stages up to E16.5 for viable four-day culture, per source data.
- Orientation sensitivity requires careful embedding when regional analysis is critical.
