基因表达谱分析人视网膜手术标本杂志
August 14th, 2013
我们使用了视网膜从retinectomy样本为转录组分析视网膜脱离。我们开发了一种程序，允许RNA保护手术块和实验室之间。我们的标准化的协议通过氯化铯超速离心法，以保证纯化的RNA是适合于微阵列分析中纯化RNA。
该程序的总体目标是从人视网膜手术标本中纯化 RNA，用于视网膜脱离中的转录组分析。使用 journal 来做到这一点，在实验室准备采集手术标本所需的试剂和材料并送到医院。在手术过程中，标本被收集并送回实验室。
然后使用标准化的氯化铯梯度程序纯化 RNA，并评估纯化 RNA 的质量。最终。mRNA 表达分析表明，炎症和光感受器变性都与视网膜脱离有关，这由关键基因表达的变化表明。在这些通过转录组学分析鉴定的过程中，与现有的 orna 纯化（例如从提取中去除的 GTIN chlor，也称为 ole）相比，journal 的主要优点是 orna 没有被 DNA 污染。
该技术的应用扩展到视网膜脱离的治疗，因为它为开发新的辅助疗法提供了技术手段。对于每个要收集的样品，使用不含 RNA 的移液器将 2.4 毫升不含 RNA 的 6 摩尔 RNA 的氯化几烯溶液填充到 5 毫升无菌聚乙烯圆底管中。使用氩气填充管的顶部。
然后快速将盖子压紧，确保其密封。这将防止氯甲烷在手术柜中存放数年后氧化。接下来，将 5 毫升试管分别放入 50 毫升无菌聚丙烯锥形底管中。
加入纸巾并拧上盖子后，将 50 毫升试管放入聚苯乙烯架中。然后将架子和准备好的信封连同准备好的运输表格放入医院的纸板箱中。将纸板箱从手术柜带到手术室。
在手术过程中，将视网膜标本放入装满定量和氯化物溶液的试管中。拧紧管子。短暂混合试管。
然后将管子放在采血管摇杆上 10 分钟。在随附的样本表格中填写患者识别、手术日期和任何其他备注。然后将识别号写在相应的编号 50 毫升试管上。
然后将装有手术标本的 5 毫升试管放入 50 毫升试管中。更换纸巾并盖上试管。然后将 50 mL 试管和样品摄入表放入适当的带衬垫信封中并密封。
实验室收到样品后，用 poly tron TM 匀浆器将样品在其 5 毫升试管中以最大设置匀浆一分钟，同时上下移动试管。样品均质化后，要提取多糖，加入 270 微升 2 摩尔乙酸钾，并将试管水平放在摇床上。剧烈摇晃 10 分钟，然后在 20 摄氏度下以 6， 500 G 离心 10 分钟。
旋转后，使用移液管小心吸出可溶性部分，而不会干扰沉淀。将上清液转移至 14 mL 无菌 RNA free 试管中。在上清液旁边，加入 5.3 毫升 1% 和 100 毫摩尔三和3.2 克氯化铯中的月桂树肌氨酸。
肌氨酸会溶解膜，氯化铯用于产生梯度。涡旋 1 分钟，混匀试管。将 1.8 毫升氯化铯 EDTA 添加到无菌 11 毫升聚合物离心管中。
然后用 10 毫升无菌牧师移液器，将 RNA 溶液分层到氯化铯 EDTA 溶液上，使其沿着试管的内表面流下。将试管放入离心机中。如有必要，使用第二根含有不含视网膜缓冲液的试管作为平衡，并在 20 摄氏度下以 225， 000 G 旋转 24 小时。
第二天。旋转后，将在管的顶部形成脂质层。DNA 将位于中间，RNA 将在试管底部沉淀。
使用无菌粘贴移液器小心地去除并丢弃第二根无菌粘贴移液器的上层脂质层。逐渐去除溶液，直到吸出粘性 DNA。丢弃溶液和 DNA。
然后使用第三个无菌牧师移液器，取出并丢弃剩余的溶液。注意不要打扰 RNA 沉淀。现在使用火焰消毒的手术刀，如图所示切割试管并丢弃上部。
将剩余部分倒置在无菌纱布上。倒置试管，用移液管用 160 微升氯甲烷轻轻冲洗。让颗粒干燥 10 分钟。
沉淀干燥后，重悬于 150 微升 tris 中，E-D-T-A-S-D-S。接下来，加入 150 微升 tris、EDTA 和 30 微升三摩尔乙酸钠，然后涡旋沉淀 RNA。加入 900 微升冰冷的 100% 乙醇。
涡旋试管并将其放在融化的冰上 30 分钟。然后在 4 摄氏度下以 18， 000 G 离心管 30 分钟。旋转后，可能可见也可能不可见的白色颗粒。
无论是否可以看到沉淀，请巧妙地吸出上清液并丢弃。然后除去多余的盐，加入 500 微升室温、70% 乙醇并涡旋，试管离心，试管在 4 摄氏度下以 18， 000 G 离心 20 分钟。重复 70% 乙醇洗涤和离心后，使用 P 200 移液器去除任何残留的乙醇。
让沉淀风干 10 分钟。将沉淀重悬于 50 μL dey 处理过的水中，涡旋 2 分钟，剧烈混合。然后将样品置于 45 摄氏度的水浴中 15 分钟。
完全重悬 RNA。最后，通过 260 纳米的吸光度测定 RNA 的浓度，并根据方案通过凝胶电泳分析 RNA。在随附的文件中，为了检查视网膜脱离的转录组，使用期刊程序恢复和分析 18 名视网膜脱离患者和 18 名使用死后视网膜制备的年龄匹配的对照的视网膜 RNA。
随后使用凝胶电泳和 rettino 碱基纯化和分析 RNA，如本报告所述，此处显示的是代表单核细胞趋化性 M CP one 基因 CCL two 表达的雷达图。图中标记为 RD 的右侧部分对应于来自视网膜脱离患者的 RNA，而标记为 N 的左侧部分是来自对照的 RNA，如图所示。视网膜脱离导致 CCL 2 上调，如与左侧对照相比，右侧大多数 RD 标本的高 C 值所示。
这种增加表明视网膜脱离患者有炎症，如图所示。杆状光感受器转导基因 GNAT 1 的表达与 CCL 2 相反降低，右侧 RD 标本的值较低，短波视锥视蛋白 O PN 1 SW 的表达降低，并且还观察到同源基因 CRX，表明视网膜脱离患者视杆细胞和视锥细胞的光感受器变性通过这种方法可以深入了解视网膜脱离后的基因表达变化。它也可以应用于动物模型中的其他视网膜病理学，例如遗传性视网膜变性。
刚接触这种方法的人可能会很困难，因为它需要核酸知识。Cy.这种方法的视觉演示作为修井至关重要，认证后的 RNA 很棘手。
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概览
本研究聚焦于从人类视网膜手术标本中纯化RNA，以分析视网膜脱离案例中的转录组。采用标准化的氯化铯梯度程序以确保RNA质量以便进行进一步分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜生物学
- 转录组学
背景
- 视网膜脱离可能导致严重的视力损失。
- 了解基因表达的变化对于开发治疗策略至关重要。
- RNA质量对于准确的转录组分析至关重要。
- 现有的RNA纯化方法可能导致污染。
研究目的
- 开发一种从视网膜样本中可靠的RNA纯化方法。
- 分析与视网膜脱离相关的mRNA表达。
- 评估炎症和光感受器退化的参与。
使用的方法
- 在视网膜切除术中收集视网膜样本。
- 准备RNA提取的试剂和材料。
- 用于RNA纯化的标准化氯化铯梯度程序。
- 对微阵列分析进行RNA质量评估。
主要结果
- 识别与视网膜脱离相关的关键基因表达变化。
- 转录组分析中发现炎症和光感受器退化的证据。
- 证明新方法防止了DNA污染。
- 改进了适合于微阵列分析的RNA质量。
结论
- 开发的RNA纯化方法对视网膜样本有效。
- 转录组分析为视网膜脱离的机制提供了见解。
- 未来的研究可以利用这种方法进行视网膜疾病的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
