使用jouRNAl对人视网膜手术标本进行转录组学分析

本实验的总体目标是从人视网膜手术标本中纯化RNA，用于视网膜脱离的转录组分析。为此，需在实验室中预先准备好手术标本采集所需的试剂和材料，并送至医院。在手术过程中采集标本后，将其运回实验室。

然后使用标准化的氯化铯梯度法纯化RNA，并评估纯化后RNA的质量。最终，mRNA表达分析显示，视网膜脱离过程中涉及炎症反应和光感受器变性，这由关键基因表达水平的变化所指示。在转录组分析所鉴定的这些过程中，与现有ORN A纯化方法（如GTIN氯提取法，也称为ole）相比，该期刊所述方法的主要优势在于所获得的ORN A不含DNA污染。

该技术的应用可拓展至视网膜脱离的治疗，因为它为开发新型辅助疗法提供了技术手段。每采集一个样本，使用无RNA酶的移液枪，将2.4毫升6摩尔无RNA酶的盐酸胍溶液加入5毫升无菌聚乙烯圆底管中。用氩气填充试管上部空间。

然后迅速盖上盖子并用力压紧，确保密封。这可以防止氯化亚锡在手术柜中存放数年期间发生氧化。接下来，将每支五毫升试管放入一个50毫升无菌聚丙烯锥底管中。

加入组织样本并拧紧管盖后，将50毫升离心管放入聚苯乙烯试管架中。然后将试管架、已准备好的信封以及填写完毕的运输单据一同放入医院内的纸板箱中。将该纸板箱从手术储物柜运送至手术室。

手术过程中，将视网膜样本放入装有定量氯化物溶液的试管中。 tightly 封闭试管。短暂混匀试管。

然后将试管置于血液试管摇床上，持续10分钟。在随附的样本表中填写患者身份识别信息、手术日期以及任何其他备注。随后将识别编号写在对应的编号为50毫升的试管上。

然后将装有手术标本的5 mL离心管放入50 mL离心管中。更换纸巾并盖紧管盖。接着将50 mL离心管及样本接收单放入相应的衬垫信封中并封口。

样本收到后，在实验室中将标本放入其5 mL离心管中，使用Polytron TM匀浆器在最高转速下匀浆1分钟，同时上下移动离心管。匀浆完成后，为提取多糖，加入270 µL的2 mol/L醋酸钾溶液，并将离心管水平放置于摇床上。剧烈振荡10分钟，然后在20 °C条件下以6,500 ×g离心10分钟。

离心后，使用移液器小心吸取上清液，避免扰动沉淀。将上清液转移至一个14毫升无RNA酶的无菌管中。在上清液中加入5.3毫升1%十二烷基肌氨酸钠（Laurel Sarcosine）溶液（溶于100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷缓冲液）和3.2克氯化铯。

肌氨酸可溶解膜，氯化铯用于形成梯度。将试管涡旋混匀一分钟。向一个无菌的11毫升聚合物离心管中加入1.8毫升氯化铯EDTA溶液。

然后使用一支10毫升无菌巴斯德吸管，将RNA溶液沿离心管内壁缓缓加入氯化铯-EDTA溶液上层。将离心管放入离心机中。必要时使用另一支含有不含视网膜组织的缓冲液的离心管作为平衡，于20摄氏度下以225,000 G离心24小时。

第二天。离心后，脂质层将形成于管子的顶部，DNA 位于中间，而 RNA 则沉淀在管底。

使用无菌巴斯德吸管小心移除上层脂质层，并用另一支无菌巴斯德吸管将其弃去。逐渐吸取溶液，直至黏稠的DNA被吸出。将溶液和DNA一并弃去。

然后使用第三支无菌巴斯德移液管，移除并弃去剩余溶液，注意不要扰动RNA沉淀。现在使用火焰灭菌的解剖刀，按图中所示将离心管切割，并弃去上半部分。

将剩余部分倒置放在无菌纱布上。将离心管颠倒，用移液器吸取160 µL氯化胍溶液轻轻冲洗。让沉淀物干燥10分钟。

离心沉淀物干燥后，加入150 µL的Tris、EDTA、SDS溶液重悬。随后加入150 µL Tris、EDTA和30 µL 3 M醋酸钠溶液，涡旋混匀以沉淀RNA。再加入900 µL预冷的100%乙醇。

将试管涡旋振荡，并置于融冰上30分钟。然后在4°C条件下以18,000 G离心30分钟。离心后，可能可见也可能不可见微小的白色沉淀。

无论是否可见沉淀，均需小心吸除上清液并弃去。随后为去除过量盐分，加入500 µL室温的70%乙醇，涡旋混匀，将离心管在4°C、18,000 ×g条件下离心20分钟。重复一次70%乙醇洗涤和离心步骤后，使用P200移液器吸除残留的乙醇。

将沉淀在空气中干燥10分钟。用50 µL经脱酶处理的水重悬沉淀，涡旋剧烈振荡2分钟。然后将样品置于45 °C水浴中15分钟。

充分重悬RNA。最后通过260纳米处的吸光度测定RNA浓度，并根据方案通过凝胶电泳分析RNA。在随附的文件中，为研究视网膜脱离的转录组，采用期刊方案从18例视网膜脱离患者和18例年龄匹配的对照个体中回收并分析视网膜RNA，对照样本使用死后视网膜制备。

随后使用凝胶电泳和rettino碱基纯化并分析RNA，本报告中所示为表示单核细胞趋化因子MCP-1基因CCL2表达情况的雷达图。图中右侧标为RD的部分对应于视网膜脱离患者的RNA，而左侧标为N的部分为对照组的RNA，如图所示。视网膜脱离导致CCL2上调，这由右侧大多数RD样本中较高的C值表明，相较于左侧对照组样本。

这种升高表明，如图所示，视网膜脱离患者存在炎症反应。视杆光感受器转导基因 GNAT1 的表达下降，与 CCL2 相反，右侧视网膜脱离（RD）样本的数值较低；短波视锥视蛋白 OPN1SW 的表达也下降，同时观察到同源盒基因 CRX 的表达降低，提示视网膜脱离患者的视杆细胞和视锥细胞均出现光感受器变性。该方法可为视网膜脱离后基因表达变化提供深入见解，也可应用于动物模型中的其他视网膜病变，如遗传性视网膜变性。

刚接触该方法的人员可能会遇到困难，因为该方法需要掌握核酸相关知识。由于 RNA 在认证后处理起来较为复杂，因此对该方法进行直观的演示至关重要。