高效且一致地从人眼生成用于组织学分析的视网膜色素上皮/脉络膜平铺标本
2022年10月28日
我们介绍一种高效分离人眼视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的方法，并制备完整的RPE/脉络膜铺片，用于对RPE进行组织学和形态计量学分析。
该方法有助于理解视网膜色素上皮（RP）细胞在整个视网膜中的表型差异。Davide Ortolan 开发的解剖技术在实现视网膜色素上皮与视网膜分离方面具有高度可重复性。此外，REShAPE 软件在分析视网膜色素上皮平铺样本的大尺寸图像时表现出显著优势。
Davide 开发的方法可用于研究不同类型视网膜变性疾病患者中视网膜色素变性（RP）表型的区域性差异。首先，在50毫升锥形管上略低于5毫升刻度处进行切割。使用热熔胶将管尖端固定在称量舟的底部。
然后按10:1的比例混合硅胶弹性体试剂盒的两种组分，避免混入气泡。将混合物倒入含有该圆底管球形部分的称量舟中。在室温下静置过夜，使硅胶固化。
从固化的硅胶模具中取出称量舟和圆底管。首先，用1毫升注射器吸取1700毫摩尔的D-甘露醇溶液，并连接至21号针头。将针头经由睫状体平坦部插入，以避免刺穿眼球前房，然后向玻璃体内注射400微升该溶液。
将眼球置于室温下静置 45 分钟。使用精细剪刀和镊子，在平坦部水平切开前房。用含有钙和镁的 DPBS 填充眼球后房。
在体视显微镜下，将视网膜上呈现为黄色斑点的黄斑定位。将眼球切成四个象限，即鼻侧、颞侧、上方和下方，同时确保保留黄斑区域。如果针妨碍操作，将其移除。
将蝶形组织转移至含有钙和镁的DPBS的100毫米培养皿中，置于眼球后房。在移除视网膜之前，通过在睫状体边缘做V形切口，标记包含黄斑的花瓣部分。提起并剪除覆盖在视网膜上的所有玻璃体。
从所有花瓣状边缘的睫状体边界处切割视网膜，注意不要刮伤视网膜色素上皮（RPE）。将组织置于4% PFA中，孵育1小时。用含钙和镁的DPBS洗涤三次。
将组织转移至装有相同缓冲液的容器中，并在 4 摄氏度下保存。接着，将样品转移至含有钙和镁的 DPBS 的 100 毫米培养皿中。使用 1.5 毫米活检打孔器切下视神经头。
收集视网膜并将其保存在相同的缓冲液中，4摄氏度保存。为去除RPE脉络膜上的巩膜，轻轻从周边部位提起RPE脉络膜层。然后使用Vannas弹簧剪刀剪除位于巩膜与RPE之间的脉络膜血管和结缔组织。
完全分离巩膜后，收集视网膜色素上皮（RPE）脉络膜层。将组织转移至含有钙和镁的DPBS溶液容器中，并于4摄氏度保存。将RPE脉络膜转移至六孔板中的一个孔内。
在室温下封闭并透化样本1小时。将样本与鬼笔环肽-647荧光染料按1:250比例溶于透化缓冲液中，在室温下孵育1小时。用含有钙和镁的DPBS洗涤三次。
将RPE脉络膜样本转移至50 × 75毫米的玻璃载片上并展平。将每一片花瓣状组织切成两半，以使样本更平整。使用疏水性笔描绘平铺样本的轮廓。
为了淬灭脂褐素自发荧光，加入 500 微升自发荧光淬灭液，并在室温下孵育两分钟。用含有钙和镁的 DPBS 充分洗涤。移除 DPBS，然后加入封片介质。
将盖玻片置于平铺样本上，并用指甲油封固。打开软件。在目录选项卡中，选择输入和输出文件夹。
在输出目录中，让软件自动更改输入目录或进程的路径。或者，可手动更改输出目录。要生成热图，请在“创建彩色图像”选项卡的下拉菜单中选择全部。
在“使用手册限制”功能中，勾选“否”选项，以允许软件使用每幅图像中检测到的最小值和最大值。勾选“是”选项，可手动调整每个形态学参数热图的数值范围。然后点击“设置限制”按钮，并在文本框中输入数值，以设定各个参数的范围。
更改感兴趣参数后，点击保存。点击“低默认值”可重置所有限值。若要选择较小细胞尺寸的阈值，请输入拟纳入分析的最小细胞尺寸。
在“较大细胞尺寸”中，输入要包含的最大细胞的尺寸。在“将像素转换为实际单位”中，选择“否”表示以像素为单位进行分析，选择“是”表示以微米为单位进行分析。在“比例尺像素长度”中，在文本框内输入像素值。
在比例尺长度处输入对应的微米数值。要开始分析，请点击“开始”。该方案可获得平铺标本的单平面图像，其中视网膜色素上皮细胞的位置由 REShAPE 生成的细胞边界分割结果确定。
此外，对于每一个正确识别的RPE细胞，将测量包括单个RPE细胞面积在内的30种形态学参数。可通过选择RT滤镜下拉菜单中的任一过滤选项，去除因残留的视网膜碎片或其他明亮物体导致的黑色区域。若使用RGB图像进行重塑分析，将生成完全黑色的二值图像。
如果出现这种情况，将 RGB 图像转换为灰度图像将生成正确分割的二值图像。如果染色效果不理想，或样品因划痕而受损，则大量细胞团块可能被识别为单个非常大的细胞。此时，可通过调整细胞大小阈值，在分析中排除这些较大的对象。
为了获得平整的组织，即使这些步骤可能耗时较长，也需要将视网膜色素上皮（RP）和脉络膜从巩膜上分离。在制备出RP平铺片后，可对其他RPE标志物进行染色，以便研究RP单层的不同区域。利用该方法，我们已发现五种不同的RP细胞群，它们对不同的视网膜变性疾病具有差异性敏感性。
概述
该研究提出了一种高效分离人视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的新方法，能够制备完整的RPE/脉络膜平铺标本。该方法有助于进行组织学和形态计量学分析，从而加深对人视网膜不同区域RPE细胞表型差异的理解。
关键研究组成部分
研究领域
- 视网膜研究
- 组织学分析
- 形态计量学研究
背景
- 视网膜变性疾病表现出多种表型特征。
- 理解视网膜色素上皮（RPE）细胞的差异对于推进治疗策略至关重要。
- 分离技术的高度可重复性对于获得一致的结果至关重要。
使用的方法
- 用于分离视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的解剖技术
- 以人视网膜作为生物系统
- 使用RESHape软件分析RPE平铺标本
主要结果
- 采用可重复的方法成功实现了视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的分离。
- 通过软件增强分析，实现了对形态测量学参数的详细评估。
- 促进了与不同视网膜疾病相关的RPE表型区域差异的研究。
结论
- 该研究为视网膜色素上皮细胞的提取提供了可靠方法，对视网膜健康研究具有重要意义。
- 研究结果加深了对视网膜疾病机制的理解。
常见问题
行业重要性概述
从人眼组织中稳定制备视网膜色素上皮/脉络膜平铺标本，可实现高保真的表型分析，这对于视网膜疾病研究中的早期发现和靶点验证至关重要。通过将可重复的组织分离技术与定量形态测量分析相结合，可提高疾病建模和生物标志物鉴定的预测可信度。该工作流程加强了视网膜治疗药物研发从发现到临床前评估的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够探究与疾病机制相关的区域性视网膜色素上皮（RPE）表型。
- 通过维持RPE细胞形态和细胞间连接，支持功能靶点的验证。
- 利用跨上皮细胞的定量形态学指标，促进机制层面的风险评估。
- 提高优先筛选视网膜疾病靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游细胞实验提供标准化、可重复的平铺制片。
- 通过基于人工智能的分割和形态计量分析提供定量结果。
- 支持样本的规模化制备，适用于高内涵筛选平台。
- 支持对化合物对视网膜色素上皮（RPE）形态影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过分析对退变敏感的视网膜色素上皮（RPE）群体，与疾病相关系统相一致。
- 保持从人类组织发现到临床前模型验证的连续性。
- 基于可靠的表型数据，促进经风险调整的推进决策。
- 通过区域特异性分析，支持转化生物标志物的鉴定。
流程与工作流整合
该方法位于早期发现与临床前研究的交汇点，能够实现从假设验证到视网膜疾病项目中先导化合物鉴定的无缝衔接。
- 发现生物学：通过实现特定区域的视网膜色素上皮（RPE）分析，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的、可重复的视网膜平铺样本，并输出定量形态测量结果。
- 分析：每细胞提供30项形态学指标，支持不同实验条件下稳健的统计学比较。
- 转化研究：将人类组织研究结果与临床前模型验证相连接，实现生物标志物的一致性比对。
- 企业级复用：提供标准化、可扩展的工作流程，可适配于其他物种及疾病模型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高视网膜靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强组织制备与分析的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现稳健的表型筛选，优化“推进/终止”决策并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的视网膜疾病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备人眼组织解剖与处理的专业技术。
- 需要具备荧光成像及基于人工智能的形态测量分析软件的使用条件。
- 要求跨团队在样本制备与分析流程上实现标准化，以确保可重复性。
- 经方案优化后，可适用于其他动物模型。
- 样本完整性及染色质量对于准确的分割与定量至关重要。
