从人眼高效、一致地生成视网膜色素上皮/脉络膜平面安装，用于组织学分析

这种方法有助于了解RP细胞在整个人类视网膜上的表型差异。Davide Ortolan开发的解剖技术在RP和视网膜之间产生分离方面具有高度可重复性。REShAPE软件在分析RP平面安装座的大图像方面非常可观。

Davide开发的方法可用于研究不同类型视网膜退行性疾病患者的RP表型的区域差异。首先，将 50 毫升锥形管切得略低于 5 毫升标记。使用热胶将管尖连接到称量舟的底部。

然后以 10:1 的比例混合有机硅弹性体套件的两种成分，避免滞留空气。将混合物倒入装有圆底管球形片的称量舟中。将硅胶在室温下固化过夜。

从固化的硅胶模具中取出称量舟和圆底管。首先，用 1700 毫摩尔的 D-甘露醇溶液填充 1 毫升注射器，并将其连接到 21 号针头上。将针头插入扁平部以避免刺穿眼睛的前房，并将400微升溶液注入玻璃体。

将眼睛在室温下放置 45 分钟。使用一把细剪刀和镊子，在扁平部水平处切开前房。用含有钙和镁的DPBS填充后眼室。

在体视显微镜下，定位视网膜上可见为黄色斑点的黄斑。将眼睛切成象限，即鼻、颞、上和下，同时确保保留黄斑区域。如果针头挡住了，请取下针头。

将蝴蝶转移到眼睛的后房中，放入含有含有DPBS和钙和镁的100毫米培养皿中。在移除视网膜之前，通过在睫状边缘做一个V形切口来标记包含黄斑的花瓣。抬起并切开视网膜上的所有玻璃体。

从所有花瓣的睫状边缘切开视网膜，确保不会划伤 RPE。将组织置于4%PFA中并孵育一小时。用含有钙和镁的DPBS洗涤三次。

将组织转移到装有相同缓冲液的容器中，并将其储存在4摄氏度。接下来，将样品转移到含有DPBS和钙和镁的100毫米培养皿中。用 1.5 毫米活检打孔打出视神经头。

收集视网膜并将其储存在4摄氏度的同一缓冲液中。要从 RPE 脉络膜上去除巩膜，请从外围轻轻抬起 RPE 脉络膜层。然后用一把Vannas弹簧剪刀，剪断巩膜和RPE之间的脉络膜血管和结缔组织。

与巩膜完全分离后，收集RPE脉络膜层。将组织转移到装有含有钙和镁的DPBS的容器中，并将其储存在4摄氏度。将RPE脉络膜转移到六孔板的一个孔中。

在室温下将样品封闭并透化一小时。将样品在室温下与与647荧光团偶联的鬼笔环肽在透化缓冲液中以1至250稀释度孵育一小时。在含有钙和镁的DPBS中洗涤三次。

将RPE脉络膜样品转移到50 x 75毫米的载玻片上并展平。将每个花瓣切成两半，使样品更平坦。用疏水笔绘制平面支架的轮廓。

为了淬灭脂褐素自发荧光，加入500微升自体荧光淬灭剂溶液，并在室温下孵育两分钟。在含有钙和镁的DPBS中彻底清洗。取下 DPBS 并添加安装介质。

将盖玻片放在平面支架上，并用指甲油密封。打开软件。在目录选项卡中，选择输入和输出文件夹。

在输出目录中，让软件自动更改输入目录或进程的路径。或者，手动更改输出目录。要生成热图，请从创建彩色图像选项卡的下拉菜单中选择全部。

选中"使用手动限制"功能中的"否"框，让软件使用在每个图像中检测到的最小值和最大值。选中"是"框以手动调整每个形状指标热图的值范围。然后单击设置限制按钮并在文本框中插入值以选择各个参数的范围。

更改感兴趣的值后，单击保存。单击低默认值以重置所有限制。要在较低的像元大小中选择像元大小阈值，请插入要包含在分析中的最小像元的大小。

在"单元格大小上限"中，插入要包含的最大单元格的大小。在"将像素转换为实数单位"中，选中"否"以像素单位运行分析，选中"是"以微米为单位运行分析。在比例尺像素长度中，在文本框中输入像素值。

在比例尺微米的长度中，输入相应的距离（以微米为单位）。要开始分析，请按 go 键。该协议产生平面安装的单平面图像，其中细胞位置由 REShAPE 生成的 RPE 细胞边界分割来识别。

此外，还为每个正确识别的 RPE 细胞测量 30 个形状指标，包括单个 RPE 细胞的细胞面积。由残留的视网膜或其他明亮物体产生的黑色瓷砖可以通过选择RT滤镜下拉菜单中可用的过滤选项之一来去除。使用 RBG 图像进行整形分析将生成完全黑色的二进制图像。

如果发生这种情况，将 RGB 图像转换为灰度将生成正确分割的二进制图像。如果染色不是最佳的，或者样品被划痕损坏，那么大团块的细胞可以被识别为一个非常大的细胞。在这种情况下，可以通过更改像元大小阈值从分析中排除大型对象。

为了获得扁平的组织，即使这些步骤可能需要很长时间，也需要将RP和脉络膜与巩膜分开。在 RP 平面安装生成后，可以对其他 RPE 标记进行染色，以便您可以研究 RP 单层的不同区域。使用这种方法，我们发现了五种不同的RP群体，它们对不同的视网膜退行性疾病具有不同的敏感性。