技术处理眼睛的视网膜假体植入局部组织病理学分析
August 2nd, 2013
直接相邻的各个电极的视网膜刺激视网膜细胞结构可视化的技术。
该程序的总体目标是改善视网膜假体安全性的评估。这是通过首先用组织染料标记最佳固定的去核眼的表面以指示植入电极的位置来实现的。在第二步中，去除电极阵列并将眼组织解剖成条状。
接下来，将条带在琼脂中稳定，然后包埋在石蜡中。在最后一步中，将标记的感兴趣区域切片并收集在载玻片上进行染色。最终，可以通过明场和免疫荧光显微镜评估每个电极附近植入区域的健康状况。
该技术的主要优点是可以最大限度地减少与固定相关的伪影和分层，同时可以准确跟踪大样品中的电极相邻组织区域。它还可用于评估新植入物对其他眼病的安全性。通常，刚接触这种方法的人会发现它具有挑战性，因为视网膜容易分层，并且处理样本需要高水平的灵巧性。
这种方法的视觉演示很重要，因为标记和处理脆弱组织很难学习。在这项研究之前，在植入脉络膜上电极阵列后，眼睛之前使用星号所示的非最佳技术进行处理。第一张图显示了通过电极阵列腔的代表性正交截面。
请注意，视网膜与眼外组织分离。这在箭头所示的植入区域下方尤为明显。另请注意，无法确定视网膜的哪个部分与阵列的每个单独电极相邻。
在这个更高的放大倍率下，如箭头所示，视网膜层中有几个基于规则释放的伪影，以及与鱼雷层（猫眼中的反射层）的主要脱离。进一步放大后，可以观察到光感受器的外部段以及色素上皮保持完整，这表明先前观察到的分离或加工的人为副作用，而不是由体内创伤或病理引起的。因此，实施了以下技术来最大限度地减少这些与固定相关的伪影和分层。
成核和固定眼睛后，首先从乙醇中取出植入的眼球，并小心地修剪掉多余的组织，包括结膜和肌腱的囊。将视神经修剪成 2 到 3 毫米的长度。电极阵列通过半透明的巩膜可见。
然后用细尖画笔小心地将组织学染料涂抹在组织上，以使用预定义的颜色代码标记电极。注意不要弄脏染料。可以进行额外的染料标记来定义兴趣点或帮助对齐部分。
在这里，最大刺激的电极被标记为绿色。其他有源电极已标记为红色。较大直径的返回电极已涂成黄色，任何其他导向或解剖标记均已用蓝色染料标记。
风干 5 分钟后，将球体放回 70% 乙醇中以使染料脱水。然后，如刚才所示，从未种植的对照眼球中修剪多余的组织后，使用在成核和固定步骤中连接的八根尼龙缝合线将对照眼和植入的眼睛对齐为一对镜像。然后将与电极阵列尺寸相同的硅胶模板放置在对照 I 上的镜像位置上，对应于植入眼中阵列的位置。
然后按照刚刚演示的方式标记对照球，以便每个植入的电极部位在解剖学上可比的位置都有一个对照对。接下来，从眼睛中取出植入物阵列，然后去除眼睛的前部，包括角膜、虹膜和晶状体。接下来，从剩余的眼罩中取出玻璃体液。
现在将植入的眼睛解剖成多个两毫米厚的条带。每个都包含晶粒标记区域的子集。应选择条带的方向以帮助评估组织对植入物反应的各个方面，仔细记录样品上模具标记的位置以备将来参考。
接下来，将要切割的一面朝下放入浅水池中。琼脂凝固后，在样品周围切开并将其放入由泡沫插入物支撑的组织盒中。解剖和包埋对照眼后，将盒放入中性缓冲福尔曼中，并通过标准的自动化 12 小时石蜡处理技术处理过夜。
第二天，将处理过的组织包埋在石蜡中，首先要切割的一面朝下。现在，将石蜡块切成 5 微米的切片。然后将每个染色区域的切片安装到载玻片上。
为了定位 DY 区域，定期在显微镜下检查载玻片。紧邻巩膜每个染色点的区域将是与阵列中相应电极最接近的区域。最后，根据需要对切片进行染色。
高动态范围。显示了用戴维森固定剂固定后和阵列移除之前具有脉络膜上电极阵列的摘除猫眼的宏观照片。半透明的巩膜使阵列中各个电极的可视化成为可能。
如箭头所示，电极使用预定义的染料配色方案进行标记。这些染料标记与解剖标志保持规则间距，用于保持实验之间的一致性。取出电极阵列后，用手将眼睛解剖成样品条。
箭头表示巩膜上两个电极相邻部位。虚线表示通过切割上图样品获得的该代表性切片平面，样品条的大体形状被保留，差异组织伪影最小。如箭头所示，两种染料标记在巩膜上仍然可见。
尽管绿色染料比红色染料更有弹性，但染料的位置表明电极的位置。因此，可以评估相邻的视网膜组织是否受到电刺激造成的损伤（如果有），如在此放大倍率下所见，与上图中看到的绿色染料相邻的视网膜层实际上并未分离，并且视网膜形态在这里得以保留。第一张图片显示了根据当前方案处理的视网膜组织切片的代表性特殊染色和免疫组织化学。
血红素将细胞核染成蓝色，而 eoin 将细胞质、胶原蛋白和支持组织染成蓝色，各种深浅不一的粉红色 在这张图片中，luxal fast blue 将髓鞘染成蓝色。牙槽嵴紫反染剂用于识别神经节细胞，方法是对 periic 蓝色内的导弹体进行染色，并突出显示周围的卫星细胞。在这个石瓦匠的三酮蓝处理部分，BRIC 猩红酸熔融液将肌肉纤维染成红色，而林蓝将胶原蛋白染成红色。
在这种情况下，用高碘酸染色的该切片的巩膜蓝色嗅出基底膜的糖蛋白成分和结缔组织成分呈紫色，而血红素复染细胞核呈蓝色。该图所示的巩膜下切片在出血部位用珍珠普鲁士蓝处理。降解的红细胞形成含铁血黄素和铁络合物的释放产生紫色。
在此图像中，添加中性红使溶酶体染成红色，抗谷氨酰胺 Synthes 染色。这种在 Mueller 细胞中发现的绿色神经递质降解酶沿两个方向延伸，Mueller 细胞体内的细胞体位于内核层内，Mueller 细胞末端进料形成用于神经丝蛋白染色的内限制膜。这种重链细胞骨架蛋白被标记为绿色，存在于细胞胞体中，并处理神经丝蛋白与其他神经丝交联以维持神经元的结构。
神经节细胞及其轴突可以在神经节细胞和神经纤维层中观察到，而位于猫科动物视网膜内核层外缘的水平细胞的轴突呈绿色。在这张最终图像中，神经胶质纤维酸性蛋白显示这种红色的细胞骨架蛋白，在神经胶质增生期间在 Mueller 细胞和星形胶质细胞中增殖，并且可以看到神经纤维层与 Mueller 细胞形成薄的延伸，穿过视网膜内层到外层。使用蓝色 DPI 进行复染可以观察视网膜层。
在尝试此过程时，请务必记住以三维方式可视化样品工作流程，并在整个过程中定期考虑样品的方向。按照此程序，可以使用所有组织学方法在开发后回答其他与安全相关的问题。这项技术为仿生眼发育的研究人员为评估盲人患者的长期安全刺激水平铺平了道路。
看完这个视频，你应该对如何评估仿生眼植入物的安全性有了很好的了解。
概述
本文介绍了在视网膜刺激器中可视化邻近电极的视网膜细胞结构的技术。该方法旨在通过最小化固定相关的伪影来增强视网膜假体安全性的评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 生物医学工程
背景
- 视网膜假体用于恢复视力患者的视力，这些患者患有视网膜退行性疾病。
- 评估这些设备的安全性和有效性对临床应用至关重要。
- 之前的技术导致了使组织健康评估复杂化的伪影。
- 需要改进的方法来准确跟踪邻近电极的组织。
研究目的
- 开发一种能够最小化视网膜组织中固定相关伪影的技术。
- 使能够准确评估邻近植入电极的组织健康。
- 提供一种可靠的方法来评估各种眼部疾病的新型植入物。
所用方法
- 用组织染料标记固定去核眼的表面。
- 将眼组织解剖成条状以稳定和嵌入。
- 使用明视野和免疫荧光显微镜进行评估。
- 记录染料标记以准确跟踪邻近电极的组织。
主要结果
- 该技术成功地最小化了层剥和固定伪影。
- 有效评估了邻近电极的组织健康。
- 该方法的视觉演示促进了新用户的学习。
- 一致的染料标记允许可靠的解剖比较。
结论
- 开发的技术增强了视网膜假体安全性的评估。
- 它为评估其他眼部植入物提供了一个框架。
- 未来的研究可以在这种方法的基础上改进视网膜假体设计。
常见问题
Executive Industry Relevance
This technique addresses a critical gap in preclinical safety assessment for retinal prostheses by enabling precise localization of tissue response adjacent to individual electrodes. By minimizing fixation artifacts and providing spatial resolution of implant-tissue interactions, it supports mechanistic de-risking of neurostimulation therapies. The method enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding localized biological responses is essential for go/no-go decisions in bionic eye development programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking electrode-specific stimulation to localized retinal cytoarchitecture changes.
- Operational Value: Provides a dye-marking system for spatial tracking of implant-adjacent tissue, reducing ambiguity in histopathological interpretation.
- Predictive Value: Supports functional target validation by distinguishing implant-induced effects from processing artifacts through matched control comparisons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stabilized tissue strips suitable for sectioning and staining, creating reproducible samples for downstream histological analysis.
- Quantitative Output: Facilitates brightfield and immunofluorescence microscopy readouts that enable objective assessment of retinal layer integrity adjacent to electrodes.
- Platform Reuse: The sclera-translucency feature allows consistent electrode localization across experiments, supporting scalable safety screening of multiple implant designs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to preclinical models of retinal degeneration where implant safety must be evaluated prior to clinical translation.
- Translational Continuity: Uses matched control eyes to increase statistical power, aligning with rigorous preclinical validation standards for neuroprosthetic devices.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables detection of localized damage (e.g., delamination, layer disruption) that informs long-term stimulation safety thresholds for blind patients.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing histopathology-ready samples after electrode implantation, bridging surgical intervention and molecular analysis in neurotechnology development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of electrode-tissue interactions through spatially resolved tissue sampling and artifact-minimized processing.
- Screening: Produces paraffin-embedded strips with dye-marked regions, enabling standardized sectioning and staining for high-fidelity tissue evaluation.
- Analytics: Generates brightfield and immunofluorescence outputs that allow comparative analysis of retinal cytoarchitecture between implanted and control regions.
- Translational Research: Connects implant safety assessment to preclinical validity by preserving retinal morphology adjacent to stimulation sites.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histopathological workflow for iterative evaluation of retinal prosthesis designs across multiple preclinical studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in implant safety studies by minimizing fixation-related artifacts and enabling precise tissue localization.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through dye coding, agar stabilization, and automated paraffin processing, improving reproducibility across users.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing reliable data on localized retinal responses to electrical stimulation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of implant candidates through validated histopathological assessment of electrode-adjacent tissue health.
Implementation Considerations
- Requires histological expertise in tissue dye application and delicate handling of enucleated eyes to prevent retinal delamination.
- Dependent on instrumentation for paraffin embedding, sectioning at five microns, and brightfield/immunofluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of dye color codes and strip orientation documentation for consistent anatomical tracking.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different species or implant geometries beyond the suprachoroidal feline model.
- Practical limitations include the need for manual dexterity in tissue dissection and the time-intensive nature of aligned control-implant processing.
