Name: 可视化和分析的mRNA分子，使用荧光在原位杂交酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习使用荧光原位杂交技术在酿酒酵母单细胞中可视化mRNA分子。该方法可在单分子分辨率下检测和定量转录本，帮助研究基因表达调控和mRNA定位动态。

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本研究获得了美国国家普通医学科学研究所资助项目 GM046406（资助对象：D.B.）以及定量生物学中心（GM071508）的支持。R.S.M. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金提供的经费支持。M.N.M. 受 Lewis-Sigler 研究金支持。我们感谢 Botstein 实验室成员提供的有益讨论，以及前成员 Allegra Petti 和 Nikolai Slavov 对代谢周期项目所做出的贡献。我们感谢 Daniel Zenklusen 和 Robert Singer 指导我们开始使用 FISH 方法。

图1和图2为FISH实验流程及用于量化FISH图像的图像分析流程示意图。
1. 需配制的溶液
*以下溶液适用于Singer探针。若使用Stellaris探针，请将杂交缓冲液和洗涤缓冲液中的“40%甲酰胺”替换为“10%甲酰胺”。使用Stellaris探针时，杂交缓冲液还需进行以下调整：(1) 加入1 g硫酸葡聚糖；(2) 不添加10 mg单链DNA。
缓冲液 B
8 ml 1 M KH2PO4 
41.5 ml 1 M K2HPO4 
109.3 g 山梨醇
原生质球缓冲液
890 μl 缓冲液B 
100 μl VRC 
10 μl 25,000 U/ml 裂解酶 
2 μl β-巯基乙醇
杂交缓冲液（10 ml，终体积）
10 mg E. coli tRNA 
10 mg ssDNA* 
100 μl 200 mM VRC 储备液 
40 μl 50 mg/ml BSA 
1 ml 20X SSC 
4 ml 40% 甲酰胺* 
无核酸酶水（加至终体积 10 ml） 
1 g 硫酸葡聚糖*
*为方便起见，杂交缓冲液可分装为 0.5 ml 份量，于 -20 °C 保存。
洗涤缓冲液（50 ml，终体积）
5 ml 20X SSC 
20 ml 40% 甲酰胺* 
无核酸酶水（加至终体积 50 ml）
标记缓冲液
1.06 克碳酸钠 
100 毫升DEPC水 
pH 9
 
2. 探针标记（仅限 Singer 探针）
我们通过使用ABI寡核苷酸合成仪在本实验室进行合成来获得这些探针。通常合成4-5个长约50 bp的寡核苷酸，其序列与目的基因同源，并在相隔至少8个、最好10个以上碱基的位置上用氨基烯丙基脱氧胸苷取代多个脱氧胸苷。由于CY染料对臭氧敏感，我们在使用CY染料时均在无臭氧的实验环境中操作。
<ol>
	<li>取约5个探针，重悬于100 μl水中，用Nanodrop检测浓度。</li>
	<li>根据探针/基因的数量，每基因总共混合10 μg寡核苷酸（例如 若每个基因有 5 个探针，则每个探针需要 2 μg。</li>
	<li>使用 QIAquick 柱根据 QIAquick 核酸去除试剂盒说明书纯化探针。</li>
	<li>向合并的探针中加入10倍体积的PN缓冲液，混匀。</li>
	<li>将样品加入QIAquick柱中——如果总体积大于750 μl，则分两次上样，每次使用一半体积进行离心</li>
	<li>静置1分钟。</li>
	<li>离心1分钟，6,000 rpm。</li>
	<li>用750 μl PE缓冲液洗涤。</li>
	<li>6,000 rpm 离心 1 分钟。</li>
	<li>弃去流出液，将离心柱重新以13,000 rpm离心1分钟以干燥。</li>
	<li>将QIAquick柱置于新的微量离心管中，用50 μl H₂O洗脱DNA2O - 确保 H2O pH 介于 7.0 至 8.5 之间，并直接置于膜上。</li>
	<li>静置1分钟。</li>
	<li>在13,000 rpm下离心1分钟以洗脱DNA。</li>
	<li>在45 °C下冻干DNA。</li>
	<li>将沉淀重悬于10 μl标记缓冲液中，并加入染料管中，注意勿接触染料。</li>
	<li>用另外10 μl标记缓冲液重复操作。</li>
	<li>涡旋混合染料与DNA的离心管，然后离心。</li>
	<li>用铝箔包裹试管，室温避光孵育过夜以进行标记。</li>
	<li>重复使用 QIAquick 核酸去除试剂盒操作步骤。进行时采用以下两项改动： 
	- 向探针中加入200 μl PN缓冲液，并将标记的探针重复通过柱子2次。 
	- 用PE缓冲液洗涤3次，以洗去未结合的染料，再进行洗脱。</li>
	<li>洗脱后通过纳米分光光度计测定浓度。标记效率通常约为0.25 pmol/ng单链DNA。</li>
</ol>
3. 盖玻片准备
<ol>
	<li>将盖玻片置于载玻片上，放入Plasma-preen真空腔室中（<a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a>）（越接近中心越好）。</li>
	<li>将真空室放入微波炉中，并确保其密封。</li>
	<li>先打开泵 然后 仅在泵启动后开启真空。</li>
	<li>打开微波，等离子体出现后5秒停止。</li>
	<li>关闭真空，然后关闭泵。</li>
	<li>抽出真空室，用镊子取下盖玻片（已掉落的需重新清洗）。</li>
	<li>将盖玻片清洁面朝上放入12孔板中。</li>
</ol>
4. 固定程序
<ol>
	<li>在最低培养基中培养酵母至 OD600 约为 0.1–0.2。10 ml 细胞可满足约 10 次独立杂交实验所需。</li>
	<li>向培养基中直接加入 1/10 体积的 37% 甲醛溶液（例如 10 ml 培养液加 1 ml 37% 甲醛），静置 45 分钟。</li>
	<li>在微量离心管中用 1 ml 冰冷的缓冲液 B 洗涤两次（可于 13,000 rpm 离心 1 分钟）。</li>
	<li>加入 1 ml 原生质球制备缓冲液。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 15 分钟，每隔几分钟在显微镜下观察细胞，直至大多数细胞呈黑色（即 不再呈相位明亮状态）。</li>
	<li>用冰冷的缓冲液 B 洗涤两次，低速离心（约 3,500 rpm）。</li>
	<li>加入 1 ml 70% 乙醇，轻轻重悬后于 4 °C 过夜放置（可在 -20 °C 长期保存）。</li>
</ol>
5. 杂交实验步骤
<ol>
	<li>制备杂交溶液：向100 μl杂交缓冲液中加入1–3 μl探针，涡旋混匀后离心。Singer探针每套探针组总用量为8–10 ng即 每个基因）。我们已使用3种不同标记的探针组同时成像最多3个基因。</li>
</ol>
在打开杂交溶液前，务必将其预热至室温。
对于Stellaris探针，建议分别加入1 μl的1:10、1:20、1:50和1:100工作稀释度的探针，进行4个独立的杂交反应，以确定最佳稀释度。Stellaris探针的工作稀释液需用杂交缓冲液配制。
<ol start="2">
	<li>离心固定后的细胞（后续所有步骤均采用3,500 rpm，离心5分钟）例如 200 μl），吸出乙醇。</li>
	<li>轻轻重悬于1 ml杂交缓冲液中含有的相同甲酰胺百分比的洗涤缓冲液中，静置2-5分钟。</li>
	<li>离心样品并吸除洗涤缓冲液，然后加入杂交溶液。37 °C下避光轻柔振荡孵育过夜。</li>
</ol>
注意：以下步骤适用于在盖玻片上接种/成像细胞。如需在96孔板中洗涤/成像细胞，包括替代的活性氧清除剂溶液，请参见<a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols</a>。
<ol start="5">
	<li>第二天，或提前，清洗（见操作步骤）并用150 μl 0.01% 多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）处理盖玻片，处理5分钟。吸除液体，晾干，用dH2O洗涤3次，然后晾干。</li>
	<li>早上，向样品中加入1 ml洗涤缓冲液，轻轻重悬，离心并吸除上清，再用另1 ml洗涤缓冲液重悬，并在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>在室温下，用2X SSC + 0.1% Triton X-100在摇床上洗涤15分钟。</li>
	<li>将封片剂从冷冻箱中取出，使其升至室温后再进行封片。</li>
	<li>在室温下，用1X SSC在摇床上洗涤15分钟。</li>
	<li>将DAPI用PBS稀释至终浓度0.1 μg/ml，并将细胞重悬于150 μl该溶液中。</li>
	<li>将细胞悬液滴加到已清洗并经多聚赖氨酸处理的盖玻片上（置于12孔板中），静置至少30分钟，避免扰动。</li>
	<li>移除溶液（可将溶液转移至备用盖玻片作为备份），并用1 ml 1X PBS洗涤3次。</li>
	<li>在载玻片上滴加3 μl Prolong Gold封片剂（Invitrogen P36934）。若处理多个盖玻片，应逐个操作，以防封片剂过早干燥。</li>
	<li>向12孔板中的盖玻片上加入约0.5 ml乙醇，用镊子夹住盖玻片取出并空气干燥。</li>
	<li>将盖玻片细胞面朝下置于封片剂上，避光静置数小时或过夜，使其充分固化。</li>
	<li>用指甲油封固盖玻片边缘，随后进行成像。</li>
</ol>
6. 使用 Olympus IX-81 倒置显微镜进行细胞成像概述
<ol>
	<li>图像采集使用 Slidebook（intelligent-imaging.com）软件和 100X、1.45 NA 的 TIRFM 油镜物镜。进行连续的 GFP、DAPI、Cy3、Cy3.5 和 Cy5 成像时使用 Chroma 滤光片组（见试剂部分）。</li>
	<li>使用 DAPI 滤光片寻找并聚焦细胞。</li>
	<li>将此设为参考点。</li>
	<li>在参考点周围采集z轴层扫图像，总距离为5 μm，步长为0.2 μm（共25层）。每种染料通道均重复此操作。即 每套探针）</li>
	<li>以16位TIFF格式导出用于图像分析。</li>
</ol>
7. 图像分析概述（Singer探针）
以下我们概述了在 MATLAB 中用于分析 FISH 图像的计算方法。右侧括号中列出了所使用的相关 MATLAB 函数。当前这些算法和阈值是针对 Singer 型探针的数据进行优化的。若使用 Stellaris 型探针，则需要进行一些调整，特别是最后的过滤步骤（7.8）。
细胞鉴定15
<ol>
	<li>使用 DAPI 图像上的全局阈值 [graythresh] 将细胞与背景分离16。</li>
	<li>使用扩展极大值函数 [imextendedmax] 识别细胞核。</li>
	<li>以细胞核作为种子，利用分水岭算法 [watershed] 进行细胞分割。</li>
</ol>
在每个荧光通道中寻找斑点
<ol start="4">
	<li>执行顶帽变换以归一化背景并提高信噪比 [bwmorph]。</li>
	<li>寻找极大值，以确定每个光斑在 z 平面中的合焦层面 [imregionalmax]。</li>
	<li>使用线性拟合模型对径向梯度进行滤波，以筛选潜在光斑。</li>
</ol>
测量斑点强度并区分单探针与多探针信号
<ol start="7">
	<li>对先前确定的焦平面层中的信号点拟合二维高斯轮廓，并估算其强度17。</li>
	<li>使用基于直方图的阈值滤除弱信号点。对于Singer型探针，此步骤至关重要；而对于Stellaris探针，则重要性较低。</li>
	<li>统计每个细胞中的信号点数量。</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378(1969).</li>
<li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912(1970).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li>
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<li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li>
<li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li>
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<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
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<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li>
<li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

迄今为止，FISH 主要是一种低通量方法。使用 Cy3、Cy3.5 和 Cy5 染料将单细胞中可同时检测的基因数量限制在三个。虽然已开发出一些额外的探针（Stellaris），但可区分的探针数量最多仍仅为七个。为了克服这一限制，已采用使用多种荧光染料的组合标记策略，为不同的 mRNA 种类创建条形码19,20。最近，Lubeck 和 Cai 利用光学和光谱条形码技术，在单个酵母细胞中同时定量了 32 种不同的分子种类19。这种最新的组合方法的一个局限性在于其需要使用超分辨率显微镜。此外，用于区分条形码探针的分析过程也相当复杂。
我们发现，在FISH实验中，Cy3和Cy3.5优于Cy5。Cy5染料的一个局限性在于其对光漂白较为敏感。然而，Stellaris最近开发了据称更耐光漂白的Cy5变体，可能有助于缓解这一技术问题。还值得注意的是，FISH是一种实施成本较高的方法，Singer和Stellaris探针每套通常价格在700至1,000美元之间，尽管未来商业探针的价格有望下降。通过节省试剂和高效的标记工艺，Singer探针的成本可降至该范围的较低水平。
主要的技术挑战之一是区分单个与多个探针信号点，这需要采用复杂的信号点判定算法。针对特定实验设置，可能需要大量手动审查以优化图像分析参数。本方案第7节提供了我们计算流程的概要及相关MATLAB函数。Stellaris探针在一定程度上缓解了这一问题，因为每个探针仅带有一个标记，因此需要多个探针共定位才能观察到信号。
由于FISH需要固定细胞，因此无法实现对单个细胞随时间的追踪。此前，我们曾利用FISH的静态数据重建了单个代谢周期性酵母群体中基因表达的动态过程6。代谢周期现象出现在预饥饿的连续培养体系中，其特征是群体范围内氧气消耗的集体振荡。这些振荡与全基因组范围内的转录本振荡相关，其中约一半的酵母基因在氧气消耗的不同阶段表现出周期性表达。我们试图确定在未同步的连续培养酵母群体中是否存在代谢周期现象。如果存在该现象，则在同步群体中呈负相关的转录本在未同步的单细胞中也应呈负相关，而正相关的转录本亦应如此。
为了重建mRNA随时间变化的生成动态，必须将观察到的快照数据与基于潜在行为模型的预期结果进行比较。在何种情况下可以利用基因表达数据的这类“快照”来确定潜在的基因表达动态，以及哪些类型的模型可以被区分开来，均存在理论上的限制21。对于代谢周期数据，研究人员并未直接展示时间振荡的存在，而是采用了统计学方法，以证实确实存在一种与整体微阵列测量结果一致的细胞自主振荡程序。

使用整体测量技术无法检测单个细胞内的转录本数量或转录活性1。利用由目标启动子驱动的荧光蛋白作为基因表达报告分子可在一定程度上解决这一问题，但荧光蛋白折叠所需的时间会掩盖早期动态变化。此外，长寿命的荧光蛋白也无法反映mRNA的寿命。FISH技术可用于在单分子分辨率下检测mRNA在其完整生命周期中的变化，从细胞核内的转录起始，到后续的成熟及降解过程，均可在单个细胞中进行分析。
最初用于可视化核酸的原位实验采用放射性标记的RNA探针来探测DNA元件。这些研究包括在非洲爪蟾（Xenopus laevis 2）卵巢中可视化核糖体DNA，以及在小鼠组织中可视化卫星DNA3。首个荧光原位实验使用了带有荧光染料标记的RNA分子来探测特定的DNA序列4。荧光探针首次应用于RNA的原位可视化，是通过鸡肌肉组织培养中肌动蛋白基因表达的检测实现的5。近年来，在芽殖酵母中，FISH已被用于研究酵母代谢周期中的转录振荡6、细胞周期进程中mRNA的降解7，以及有丝分裂期间mRNA转录本的空间定位8。在酵母中的研究表明，组成型转录基因（占酵母全部基因的一半以上）中不相关的表达波动源于不相关的转录起始事件9。在非酵母物种中，FISH已被用于识别小鼠肠道中的干细胞标志物10，并证实C. elegans胚胎中细胞命运的不完全外显可由随机基因表达波动引起11。
本文所述的FISH方法通过将染料标记的单链DNA探针与mRNA分子杂交来实现检测。通过成像细胞并使用点状信号检测算法对mRNA进行计数。单链探针可通过DNA合成仪合成后进行标记（本文称为Singer探针），或直接订购商业化的预标记探针（Stellaris探针）12,13。Singer探针与Stellaris探针的主要区别在于，Singer探针较长（约50 bp），且为多标记，而Stellaris探针较短（约20 bp），每条探针仅含一个标记，如Raj et al 14所述。此外，Stellaris方法每基因使用的探针数量远多于Singer方法（分别为约30条与5条探针）。下文提供了一种适用于上述两类探针的实验方案。在第2节中，我们描述了使用选定的Cy染料对含氨基烯丙基胸苷的探针进行标记的方案。第7节概述了识别单个mRNA点状信号所需的计算步骤。

<table><tbody><tr><td>钒酸核苷复合物</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;tRNA</td><td>罗氏</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA（RNase free）</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇</td><td>Fisher</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI，二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X（无RN酶）</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>谢尔顿科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>20X 盐水-柠檬酸钠（SSC）</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺（去离子）</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>α-D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>158968</td><td>用于GLOX溶液</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl，pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>用于GLOX溶液</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C3155</td><td>用于GLOX溶液</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（0.01%）</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>华纳仪器</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 核苷酸去除试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>FISH 探针</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>为您所需的 mRNA 序列定制订单</td></tr><tr><td>玻璃底96孔板</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>替代盖玻片</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Cy3、Cy3.5、Cy5 染料</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>单功能NHS酯</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Plasma-Preen I 清洁仪</td><td>Terra Universal</td><td>9505-00</td><td>控制器（货号 #9505-17，可选）</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td><td>用于操作 Plasma-Preen</td></tr><tr><td>宽场荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>IX81</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>100倍物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>1-UB617R</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>X-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>染色</td><td>&lt;em&gt;U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR, U-NSP104V2-SPR&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>冷却CCD或EMCCD相机</td><td>滨松</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

mrna分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH）技术能够在天然的细胞环境中检测核酸。本文提供了一种利用FISH在单个酵母细胞中定量mRNA数量的实验方案。细胞可在任何感兴趣的条件下培养，随后进行固定和通透处理。接着，使用多个与荧光染料偶联的单链脱氧寡核苷酸来标记并可视化mRNA。通过斑点检测算法对单个mRNA分子产生的衍射受限荧光信号进行量化，以识别并计数每个细胞中的mRNA数量。虽然传统的定量方法（如Northern印迹、RT-PCR和基因表达微阵列）仅能提供群体细胞中mRNA的平均信息，而FISH则能够在单分子分辨率下实现对单个细胞中mRNA的定量与定位分析。

图3展示了由FISH图像计算得到的典型直方图，用于确定单个细胞中mRNA的数量。基于显微镜的RNA定量一个重要优势在于可以获得转录本定位的信息。例如，我们利用FISH在具有可诱导CBF1等位基因的单细胞中鉴定mRNA（图4）。由于在转录位点存在大量mRNA分子，我们能够识别出细胞核内转录位点的存在及其位置。
通过使用不同的染料标记不同基因的mRNA，可以在同一细胞中定量多种mRNA种类。为演示此方法，将酵母细胞在α因子和山梨醇存在下进行孵育。FUS1转录（Quasar670染料，红色）由α因子诱导，STL1转录（Quasar 570染料，绿色）则由细胞外渗透压升高诱导（图5）。图4是使用Singer探针进行FISH的一个示例。图5是使用Stellaris探针进行FISH的一个示例。
<img alt="细胞固定与杂交过程示意图；显微镜观察及DAPI DNA染色。" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. FISH实验流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="细胞分割与斑点分析流程；图像处理流程图：分水岭、径向梯度、高斯拟合。" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 图像分析流程示意图。最终的斑点由最右侧图像确定。
<img alt="点强度直方图；强度分布比例 vs. 强度；mRNA 分析；细胞内 vs. 细胞外数据。" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 使用 Singer 探针检测特定基因的点强度直方图。探针信号强度在细胞内（红色）和细胞外（蓝色）均进行计算。低强度信号点可能是背景噪声或单个探针。真正的 mRNA 分子会被多个探针标记。当使用 Stellaris 探针时，单个探针的信号较难检测，因此需要相应调整阈值和过滤条件。
<img alt="CBF1 mRNA 的可视化；荧光显微镜图像，mRNA 定位，细胞分析。" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. Singer FISH 实验的代表性结果。在本实验中，CBF1 转录通过可诱导启动子激活18。细胞核用 DAPI 染成蓝色。CBF1 mRNA 使用 Cy3 标记的探针进行标记。白色箭头指示细胞核内 CBF1 转录位点的存在。细胞质中可见单个 mRNA 转录本。
<img alt="显示细胞核中DNA定位和细胞结构分析的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. Stellaris FISH 实验的代表性结果。MATa 酵母细胞同时暴露于 30 ng/ml α因子和 0.75 M 山梨醇中处理 10 分钟，并同时检测 FUS1（Quasar 670，红色）和 STL1（Quasar 570，绿色）转录本。在高亮框中，可见一个细胞仅对信息素产生响应（FUS1 起始位点，红色），而另一个细胞主要对山梨醇产生响应（STL1 起始位点，绿色）。

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位 单分子分辨率下通过荧光原位杂交（FISH）对单细胞中的mRNA进行计数

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

荧光原位杂交（FISH）方法可用于在天然细胞环境中检测核酸。本文提供了一种……的实验方案。

以下实验的总体目标是在单个酵母细胞中以单分子特异性检测 mRNA 分子的存在。首先，使用含有裂解酶的缓冲液固定酵母细胞和甲醛。对细胞进行透化处理，直至大多数细胞不再呈现明亮的相位对比图像。接下来，将通透处理的细胞与荧光标记的单链DNA分子共同孵育，然后将细胞置于经等离子体清洗的盖玻片上。最终，通过荧光显微镜获得的结果可以详细揭示单个细胞中mRNA分子的存在及其定位情况。该技术相较于现有方法（如基因表达分析、微阵列和Northern印迹）的主要优势在于，能够在单个细胞中直接观察单个mRNA分子。该方法有助于回答转录领域中的关键问题，包括量化细胞群体中每个细胞内的臂RNA数量，从而为启动子水平的调控模型提供依据。此外，该方法还可用于确定转录本在细胞周期中的定位及其半衰期。在等离子预处理真空腔室内，将盖玻片放置在载玻片上。然后将真空腔室放入微波炉中，并确保其密封。启动泵后，打开泵的开关。现在打开真空泵，然后启动微波，待等离子体可见后五秒停止。随后关闭真空泵，再关闭抽气泵。拉出真空腔室。然后将清洗后的盖玻片正面朝上转移至12孔板中，将酵母在最低培养基中培养至A600约为0.1至0.2。10 mL细胞可获得约10次杂交所需的量。向培养基中直接加入十分之一体积的37%甲醛，室温孵育45分钟。将细胞在3000 ×g离心5分钟。用1毫升缓冲液B重悬沉淀，并转移至微量离心管中。在微量离心管中用一毫升冰预冷的缓冲液B洗涤两次。在13,000 RPM下离心一分钟。接着，加入一毫升sphero包被缓冲液，在37摄氏度孵育15分钟。每隔几分钟在显微镜下观察细胞，直至大多数细胞变为黑色。然后用预冷缓冲液洗涤两次。B. 以3,500 RPM的低速离心。加入1 mL 70%乙醇重悬。轻轻悬浮沉淀，并在4°C下过夜孵育，或在-20°C下长期保存。为配制杂交溶液，将1至3 µL探针加入100 µL杂交缓冲液中。然后涡旋并离心。我们已使用三组不同的探针同时成像了三个不同的基因。现在离心固定的酵母样品，并吸去洗涤缓冲液。加入杂交溶液，于37摄氏度下避光、轻轻振荡孵育过夜，次日进行后续操作。将洁净的盖玻片用150微升0.01%多聚赖氨酸处理5分钟，然后吸除液体并空气干燥。将载玻片用双蒸水洗涤三次，其中一次使用1×SSC重悬，随后空气干燥。将细胞悬浮于150微升浓度为0.1微克/毫升的溶液中。新鲜配制DAPI染液，取部分细胞悬液滴加至经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，孵育30分钟。接着，将ProLong Gold封片剂缓慢解冻至室温。取三微升样品置于载玻片上。然后向盖玻片加入约0.5毫升乙醇。在12孔板中，用镊子夹住盖玻片，取下后使其自然风干。将盖玻片细胞面朝下置于封片剂上，于暗处静置数小时或过夜使其固化。用指甲油密封边缘，随后进行成像。在参考点周围采集一系列图像，总距离为5 μm，步长为0.2 μm。对每种探针组对应的染料通道重复成像，然后按照随附文本中的详细步骤进行操作。通过分水岭分割法识别细胞时，使用径向梯度识别信号点，并通过高斯拟合对信号点进行测量。通常，通过鱼类图像计算直方图，用于确定单个细胞中mRNA的数量。基于显微镜的RNA定量一个重要优势在于可以获得转录本定位信息。例如，该方法利用单个探针在具有可诱导CCB CBF单等位基因的单细胞中识别mRNA。由于许多 mRNA 分子存在于转录位点，因此很容易识别细胞核内转录位点的存在与位置。利用不同的染料标记不同基因的 mRNA，可在同一细胞中实现多种 mRNA 物种的定量分析。在本实验中，酵母细胞在存在 α 因子和山梨醇的条件下孵育。使用 Stelara 探针进行 FISH 检测，结果显示一个细胞仅对信息素产生响应，表现为一个红色的 FUS1 起始位点。与此同时，另一个细胞主要对山梨醇产生响应，其中 S TL 一个起始位点被标记为绿色。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何在酵母中对单个 mRNA 分子进行标记和可视化。一旦掌握，该技术可在两天内正确完成。请确保细胞浓度足够高。样本稀释会导致需要成像和存储的视野增多。

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Biology

生物学

可视化和分析的mRNA分子，使用荧光<em&gt;在原位</em&gt;杂交<em&gt;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）</em

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