可视化和分析的mRNA分子，使用荧光在原位杂交酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
June 14th, 2013
本协议描述的实验过程进行荧光杂交（FISH）技术在单细胞单分子分辨率计数的mRNA。
以下实验的总体目标是检测单个酵母细胞中是否存在具有单分子特异性的 mRNA 分子。首先，使用含有裂解酶的缓冲液固定酵母细胞和甲醛。可渗透细胞，直到大多数细胞没有相位变亮。
接下来，用荧光标记的单链 DNA 分子孵育通透细胞，然后将细胞安装在等离子清洁的盖玻片上。最终，通过荧光显微镜获得的结果可以详细说明 mRNA 分子在单细胞中的存在和定位。与现有方法（如基因表达、微阵列和 Northern 印迹）相比，该技术的主要优势在于可以在单个细胞中可视化单个 mRNA。
此方法可以帮助回答转录字段中的关键问题。这包括量化群体中每个细胞的手臂 RNA 数量，这可以为启动子水平的模型提供调控信息。它还可用于确定细胞周期中转录本的定位和半衰期。
在等离子体 preen 真空室中，盖板滑到载玻片上。然后将真空室放入微波炉中，确保其密封。泵启动后打开泵。
立即打开真空吸尘器，打开微波炉电源，并在等离子体可见后 5 秒停止。然后关闭真空，然后关闭泵。拉出真空室。
然后将清洁后的盖玻片向上转移到 12 中。孔板将酵母生长至约 0.1 至 0.2 的 A 600。在极简培养基中，10 密耳的细胞产量足以进行约 10 次杂交。
将 10 倍体积的 37% 甲醛直接添加到生长培养基中，并在室温下孵育 45 分钟。将细胞以 3000 Gs 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 1 mL 缓冲液 B 中，并转移到微量离心管中。
在微量离心管中用 1 毫升冰冷缓冲液 B 洗涤两次。以 13， 000 RPM 离心 1 分钟。接下来，加入 1 毫升球形板、缓冲液并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。
每隔几分钟在显微镜下监测细胞，直到大多数细胞变黑。然后用冰冷的缓冲液洗涤两次。B.以 3， 500 RPM 的低速旋转。
添加 1 毫升 70% 乙醇复苏剂。轻轻悬浮沉淀，在 4 摄氏度下放置过夜或在零下 20 摄氏度下无限期储存。要制备杂交溶液，请将 1 至 3 μL 探针添加到 100 μL 杂交缓冲液中。
然后涡旋并离心。我们使用三种不同的探针集同时对三种不同的基因进行成像。现在离心，固定的酵母样品并吸出洗涤缓冲液。
加入杂交溶液，第二天在 37 摄氏度下在黑暗中轻轻摇动孵育过夜。用 150 微升 0.01% 聚赖氨酸处理干净的遮盖嘴唇 5 分钟。然后 aspir 并风干。
玻片用蒸馏水洗涤 3 次，用 1 次 XSSC Resus 洗涤 1 次后风干，将细胞悬浮在 150 微升 0.1 微克/毫升中。新鲜制备的 dappy 染色剂，将细胞悬液等分到经聚赖氨酸处理的盖玻片上，孵育 30 分钟。接下来，将延长的镀金封片剂解冻至室温。
将 3 微升样品放在载玻片上。然后将约 0.5 毫升乙醇加入盖玻片中。在 12 孔板中，取下盖玻片并用镊子固定时风干。
将盖玻片槽的一面朝下放在封固剂上，让它硬化数小时或在黑暗中过夜。用指甲油密封边缘并继续成像。在总距离为 5 微米、尺寸为 0.2 微米的参考点周围拍摄 Zack 图像。
对对应于每个探针组的每个染料通道重复成像。然后按照随附文本中的详细说明进行作。要通过分水岭分割来识别像元，请使用径向梯度识别点，并使用高斯拟合测量点。
通常，直方图是根据鱼类图像计算的，用于确定单个细胞中存在的 mRNA 数量。基于显微镜的 RNA 定量的一个重要优点是可以获取有关转录本定位的信息。例如，这条鱼使用单个探针来识别具有可诱导型 CCB CBF 一个等位基因的单个细胞中的 mRNA。
由于许多 mRNA 分子存在于转录位点，因此很容易识别细胞核内转录位点的存在和位置。利用不同的染料标记不同基因的 mRNA，有助于定量同一细胞中的多种 mRNA。在该实验中，酵母细胞在 α 因子和山梨醇存在下孵育 使用带有 Stelara 探针的鱼，数据显示一个细胞仅对红色 FUS 单起始位点指示的信息素做出反应。
同时，另一个细胞主要对山梨醇有反应，其中 S TL 一个起始位点被标记为绿色。看完这个视频后，你应该对如何标记和可视化酵母中的单个 mRNA 分子有一个很好的了解一旦掌握了。这项技术可以在两天内正确执行。
请记住要有足够密集的细胞浓度。稀释的样品需要更多的字段进行成像和存储。
概览
本协议描述了一种实验程序，用于执行荧光原位杂交（FISH）以在单分子分辨率下计数单细胞中的mRNA。该方法允许可视化酵母细胞中的单个mRNA分子，为转录调控和转录本定位提供了洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 基因表达
背景
- 荧光原位杂交（FISH）能够以单分子分辨率检测mRNA。
- 该技术通过可视化单个mRNA超越了传统方法，如微阵列和northern blots。
- 理解mRNA定位和定量对于研究转录动力学至关重要。
- 酵母细胞作为这些实验的模型生物。
研究目的
- 检测和定量单个酵母细胞中的mRNA分子。
- 研究细胞周期期间转录本的定位和半衰期。
- 增强对启动子水平转录调控的理解。
所用方法
- 使用甲醛和裂解缓冲液固定酵母细胞。
- 使细胞通透化以便探针进入。
- 使用荧光标记的DNA探针进行杂交。
- 显微镜成像以可视化和定量mRNA定位。
主要结果
- 成功可视化酵母细胞中的单个mRNA分子。
- 定量响应于不同刺激的mRNA种类。
- 识别核内的转录位点。
- 展示该技术同时分析多种mRNA种类的能力。
结论
- FISH为研究单细胞中的mRNA动力学提供了强大的工具。
- 使用适当技术，该方法可以在两天内完成。
- 理解mRNA定位和数量可以为基因调控模型提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule mRNA visualization enables precise quantification and spatial mapping of transcript dynamics, addressing limitations of bulk population assays in target validation. This approach supports mechanistic de-risking by revealing heterogeneity in gene expression that informs predictive confidence in early discovery. Application in yeast models provides a scalable, genetically tractable system for assay development and pathway interrogation prior to mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional heterogeneity and promoter-level regulation in single cells.
- Operational Value: Provides direct visualization of mRNA molecules to clarify functional target engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking transcript localization to cellular phenotype and pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved mRNA counts per cell for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates multiplexed detection of multiple mRNA species using distinct fluorescent probes.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects mRNA localization and half-life measurements to transcript stability and cell cycle regulation.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation via conserved transcriptional mechanisms.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking single-cell transcript dynamics to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within early discovery to support hypothesis testing and pathway clarification before lead identification, leveraging yeast as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of transcriptional regulation and pathway clarification at single-molecule resolution.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides spot-detection and Gaussian fit measurements to quantify and compare mRNA abundance across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved mRNA localization and half-life principles in eukaryotic systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplexed transcript analysis across diverse experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of mRNA dynamics and reduction of mechanistic ambiguity in gene regulation models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell permeabilization and standardized probe hybridization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by linking single-cell transcript counts to phenotypic responses in screening campaigns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved mRNA data from isogenic yeast populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, fixation protocols, and nucleic acid hybridization.
- Depends on confocal or widefield imaging systems with spot-detection algorithms for single-molecule quantification.
- Necessitates cross-team standardization of probe design, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different yeast strains, growth conditions, and target mRNA abundance levels.
- Includes practical limitations related to transcript accessibility, probe penetration efficiency, and background signal in fixed cells.
