微阵列分析FOR酿酒酵母

该程序的总体目标是通过检查经历氧化应激的酵母中的表达差异，向理科本科生介绍微阵列技术。这是通过首先从用过氧化氢处理的酵母培养物和未处理的对照中分离总 RNA 来实现的。该程序的第二步是从这些 RNA 样品中生成和纯化 CDNA。

然后使用 CDNA 通过体外转录制备生物素标记的 CRNA。该程序的最后一步是将生物素标记的 CRNA 片段化，以便与 AFI 指标酵母基因芯片杂交。最终，可以获得显示两种酵母样品中表达差异的结果，并通过生物信息学向本科生展示了微阵列分析的力量。

Vermont Genetics Network Outreach 团队在负责向佛蒙特州的理科学生提供微射线技术以加强他们的科学教育时，首次想到了这种方法。迄今为止，这种方法已交付到全州八所学士学位学院的多个站点。因此，使用 microray of at 教学模块的主要优势是，它使我们能够向一组人教授整个实验室中每天使用的一般分子生物学技术。

我们还可以使用它来向学生、教师和我们的小组进行教学。实际上，我们有学生和教授一起从事同一个项目。他们学习某些需要非常技巧的技术，例如处理 RNA，这不是一件容易的事。

他们学习如何使用可视化试剂沉淀 DNA。他们实际上可以使用他们在研究生学习或日常分子生物学实验室中遇到的技术。虽然这种方法适用于深入了解氧化应激和酵母，但它肯定适用于您可能想要查看的其他模式生物和其他生物系统。

基因表达会改变它们是否与发育变化、环境毒素、特定疾病状态等有关。为了检查经历氧化应激的酵母的表达差异，首先通过酶裂解从两种酵母培养物中提取总 RNA。一种培养物通过在 Hank 缓冲盐水中用 0.5 毫摩尔过氧化氢处理 1 小时而暴露于氧化应激下，而另一种培养物仅用 HBSS 作为对照处理。

首先，用适当的识别信息标记两个 1.7 mL 微量离心管。将 1.5 毫升适当的酵母培养物转移到每个试管中。在室温下以 5， 000 Gs 离心试管 2 分钟。

离心后，使用微量移液器小心地取出并丢弃上清液，不要干扰沉淀。在继续该过程之前，请检查颗粒是否足够大。如果沉淀太小，则将 1.5 毫升培养物加入含有沉淀的同一管中，然后离心以获得更大的沉淀。

用微量移液管弃去上清液，从酵母沉淀中去除尽可能多的液体。然后将 100 微升 SG 缓冲液和 30 微升连接酶溶液加入酵母沉淀涡旋中混合。孵育过程中，将两支试管在室温下孵育 30 分钟。

每 10 分钟轻轻旋转每根试管以产生平台。当您对酵母进行球状电镀时，最关键的步骤之一是确保您在处理后实际上创造了 100% 的球状塑料。这意味着并非所有的裂解酶都是一样的。

因此，您必须检查以确保良好的裂解酶为您提供良好的球形电镀，这意味着您必须采集这些样品，将它们放在显微镜载玻片上，并在显微镜下添加 0.1%SDS 进行检查，以确保您确实有原生质体形成。为了观察完整的球状电镀，将 10 微升酵母样品移液到显微镜载玻片上，同时在显微镜下以 1 微升 0.1%SDS 检查样品，以使酵母细胞膨胀并形成完美的球体或球体。重要的是要观察出芽细胞也形成 S 球体。

如果观察到部分球状电镀，建议使用 liase 进行扩展处理。一旦在每个试管中确认 350 μL BRLT 缓冲液完成球形电镀，然后加入 250 μL 100% 乙醇。保持盖子关闭并剧烈涡旋 1 分钟，确保试管盖紧。

此过程将对 Sphero 平台进行虱子处理。在此之后，使用 R 和 easy Z 离心柱从两种培养物中收集和纯化 RNA。最后，使用 1.2% 预制 aros 凝胶进行电泳以评估提取的 RNA 的质量，以制备生物素标记的 CRNA。

从酵母细胞中提取的总 RNA 首先用于通过逆转录合成 CD NA。生成 CD NA 后，准备用于 CD NA 沉淀的锁相凝胶管，全速离心锁相凝胶管 1 分钟，以确保凝胶位于管底部。不要涡旋锁相管沉淀 CD NA 移液管从 pH 8.0 三缓冲苯基氯仿、异戊醇或 PCI 混合物的底层中移取 162 微升，并添加到第二链的 162 微升内容物中，CD NA 合成反应管此步骤需要等体积的水溶液和有机混合物。

涡旋 5 秒钟以混合内容物。接下来，使用微量移液器将所有 CD N-A-P-C-I 混合物转移到锁相凝胶管中。不要全速涡旋 Phase Lock 凝胶管离心机 2 分钟。

然后使用微量移液器将顶层从锁相凝胶管转移到新标记的 1.7 毫升试管中。尝试收集尽可能多的图层。将以下内容添加到 1.7 毫升微量离心管中，加入 405 微升 100% 乙醇、80 微升乙酸铵和 1 微升颗粒涂料涡旋中。

将试管短暂放入离心机中，试管铰链朝外，全速离心 20 分钟。在室温下，当离心完成时，轻轻地从离心机上取出试管，小心不要干扰 CD NA 沉淀。颗粒应该是粉红色的，因为颗粒涂料大约是一粒盐的大小。

在铰链下方的管侧，将 CD NA 沉淀物放在冰上，并立即进行清洁沉淀物。要开始清洁 CD NA 沉淀的程序，请使用 P 1000 微量移液器小心地从试管中取出所有上清液。小心不要打扰颗粒。

这是您在 500 μL 冷 80% 乙醇中加入试管的样品。轻轻盖上试管并缓慢倒置数次。请密切观察沉淀，确保其不会从管侧面脱落。

如果沉淀脱落，您可以通过将试管放回架子中，让沉淀沉降到底部或全速离心试管 15 秒，将其放回试管底部。接下来，使用 P 1000 微量移液器小心地去除乙醇，不要干扰沉淀。倾斜试管，以便去除尽可能多的液体。

加入新的 Eloqua 冷 80% 乙醇，盖上试管并缓慢倒置数次。使用 P 1000 微量移液器去除所有可能的乙醇后。全速离心试管 5 秒钟。

然后使用 P 10 微量移液器去除最后几微升乙醇，而不会干扰沉淀。将打开的试管放入干燥箱中 10 到 20 分钟，以蒸发剩余的乙醇。颗粒干燥后很容易丢失，因此请小心轻拿管并盖上盖子。

干燥完成后，观察干燥的沉淀以确认它存在于试管中。最后，将干燥的沉淀重悬于 22 μL 不含 RNA 的水中，并将试管置于冰上。然后使用 Enzo BioArray 试剂盒通过体外转录使用该 CDNA 制备生物素标记的 CRNA。

生物素标记的 CRNA 经过清洁和定量后，将其片段化用于靶标制备。一旦生成了 CDNA，我们就会使用标准的体外转录方法来生成生物素化的 CRNA。CRNA 需要经过碎裂才能应用于 microray 芯片。

要开始此过程，请将相当于 5 μg CRNA 的量转移到标记的 0.5 ml PCR 管中。加入足够的不含 RNA 的水，使总体积达到 16 μL，然后向试管中加入 4 μL 的 5 x 片段化缓冲液。试管中的总体积应为 20 微升。

涡旋试管并离心 10 秒钟。然后将试管在 94 摄氏度下孵育 30 分钟。在热循环仪中，孵育后将试管放在冰上。

然后使用 1.2% 预制 AROS 凝胶通过电泳评估来自每个样品的片段化和未片段化的 CRNA。电泳完成后，凝胶在透射光器上可视化并获取图像。最终合成产物与 atric 酵母基因芯片杂交，微阵列分析的代表性结果如下所示。

第一张图是由 atrics 基因芯片作软件生成的扫描 atrics 酵母基因芯片图像的示例。这是所有遗传转录本的 2D 散点图，大约 6， 700 个基因比较对照和处理过的酵母数据。每个点代表一个基因。

紫色的基因表示差异表达的基因，而红色的基因则不是。在这个例子中，大多数差异表达的基因是那些参与细胞周期控制的基因，如它们的描述所示。该流程图来自数据库，用于注释可视化和集成发现，说明了受影响生物通路中的差异表达基因。

用红星表示的基因表示有瞳孔途径中下调的基因。最后，此处显示了使用 geo species 基因筛软件生成的火山图的代表性结果。对照和处理样品与 0.05 的 P 值截留值和 1.5 倍的表达变化截留值进行比较。

我们选择使用酵母是因为酵母很容易快速生长，但我们也意识到使用酵母最关键的部分实际上是创造像样的球状电镀。在微阵列芯片中，我们不想做的一件事实际上是进行不完全消化，实际上只对处于 G 1 或 G 2 M 期的球形质细胞进行消化。然后，您对处于特定复制阶段的酵母进行微阵列实验。

我们试图在这个练习中带回家的另一个复杂点是，人们每天都在谈论 CD NA 颗粒，但这并不一定容易。我们在模块中所做的是，我们实际上使用了专用的试管和可视化试剂。因此，我们实际上可以旋转 DNA，您可以可视化 appellate，这对学生和教师来说都更容易。

所以可以在 DNA 和 RNA 工作的所有阶段进行开发。该模块确实为学士学位学院的教师铺平了探索的道路，可能会研究其他模式生物或其他可能与现有课程或他们自己的研究兴趣兼容的治疗方案。举个例子，说明所做的一些修改，有一个网站研究了除草剂处理对酵母的影响，另一个网站研究了酵母中的 LAMP IDE 处理，而另一个网站则研究了他们特别感兴趣的哺乳动物细胞系的发育变化。

最后，另一个网站研究了不同光源对拟南芥或植物的影响。看完这个视频后，你应该对如何与本科理科学生一起设置微射线实验有一个很好的了解，包括从酵母中分离总 RNA、CDNA 的产生以及生物素标记的 CRNA 的片段化。使用这种高级技术的实践经验有助于加强和加强本科科学教育。