Name: 微阵列分析FOR酿酒酵母 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学习微阵列分析技术，通过过氧化氢诱导的氧化应激实验，分析酿酒酵母基因表达差异。该方法帮助本科生掌握RNA提取、cDNA合成及生物信息学分析等分子生物学核心技术。

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佛蒙特大学，佛蒙特遗传网络。本出版物由佛蒙特遗传网络资助完成，资助项目包括美国国家研究资源中心（NCRR）生物研究基础设施网络（BRIN）计划授予的项目编号P20 RR16462，以及NCRR创新基础研究奖（INBRE）计划授予的项目编号P20 RR16462。NCRR为美国国立卫生研究院（NIH）下属机构。本出版物内容仅由作者负责，不代表NCRR或NIH的官方观点。
我们感谢所有参与本次推广活动的机构在完善本模块过程中所提供的合作与建议，包括卡斯尔顿州立学院、格林山学院、约翰逊州立学院、林登州立学院、马尔伯勒学院、米德尔伯里学院、诺维奇大学以及圣迈克尔学院。

1. 使用酶法裂解从Saccharomyces cerevisiae中分离总RNA
<ol>
 <li>使用 RNase ZAP（Ambion）准备一个无 RNase 的工作区域。</li>
 <li>通过将 1 ml 无 RNase 水直接加入溶壁酶小瓶中，配制新鲜的工作用溶壁酶试剂，得到终浓度为 10 U/μl 的工作液。充分涡旋混匀并颠倒数次以确保完全混合。该 10 单位/μl 溶液在 12 小时内稳定。</li>
 <li>使用 Qiagen DNase 试剂盒配制新鲜的 DNase I 溶液，并置于冰上保存。</li>
 <li>用您的标识信息标记一个 1.7 ml 微量离心管。将 1.5 ml 相应的酵母培养物转移至该管中。</li>
 <li>在室温下以 5000 × g（约全速的 3/4）离心 2 分钟。使用移液器小心移除上清液（不要扰动沉淀），弃去上清液。**** 如果沉淀量过小或指导教师有要求，请重复步骤 4。****</li>
 <li>向沉淀中加入 1000 μl DEPC 水，涡旋混匀，然后在 5000 × g 下离心 2 分钟。弃去上清液，并尽可能彻底去除酵母沉淀中的液体。</li>
 <li>向酵母沉淀中加入以下试剂，并涡旋混匀。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>SG缓冲液</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>溶壁酶溶液（10 U/μl）</td>
 <td>30 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>在室温下孵育 30 分钟。</li>
 <li>每 10 分钟轻轻摇动试管一次，以生成原生质球。操作原生质球时必须轻柔。在显微镜下观察酵母，确认原生质球形成完全。在载玻片上观察酵母时，加入少量 0.1% SDS，使酵母膨胀并形成完美的球形（包括出芽细胞）。这表明细胞壁已被消化。</li>
 <li>向试管中加入 350 μl β-RLT 缓冲液，并剧烈涡旋 1 分钟。确保试管盖紧，涡旋时用手按住管盖。此步骤将裂解原生质球。</li>
 <li>向试管中加入 250 μl 100% 乙醇，并短暂涡旋。加入乙醇后可能形成沉淀，但这不会影响 RNA 的收集。</li>
 <li>收集 RNA：用您的标识信息标记一个 RNeasy 离心柱，并使用移液器小心地将步骤 10 中的全部溶液转移至离心柱中。注意不要让移液器吸头接触硅胶膜。盖紧管盖，全速离心 15 秒。样品中的 RNA 将吸附在离心柱的硅胶膜上。</li>
 <li>将离心柱从收集管中取出。将穿流液（收集管中的液体）重新吸出并加回到离心柱上，再次离心。弃去收集管（含穿流液），将离心柱放入一个新的 2 ml 收集管中。</li>
 <li>向离心柱中加入 350 μl RW1 缓冲液。该溶液用于洗涤 RNA，去除盐分和溶解的细胞碎片。盖紧管盖，全速离心 15 秒。</li>
 <li>消化 DNA：将离心柱从离心机中取出，打开管盖，向离心柱膜中央加入 80 μl DNase I 溶液。此步骤将消化样品中的任何基因组 DNA。盖上柱盖，在室温下孵育 15 分钟。</li>
 <li>将离心柱转移至一个新的 2 ml 收集管中。</li>
 <li>清洗和洗涤 RNA：向离心柱中加入 350 μl RW1 缓冲液，并以全速离心 15 秒。</li>
 <li>弃去收集管，将离心柱放入一个新的 2 ml 收集管中。</li>
 <li>向离心柱中加入 500 μl RPE 缓冲液，洗涤硅胶膜上的 RNA。盖紧管盖，全速离心 15 秒。</li>
 <li>弃去收集管，将离心柱放入一个新的 2 ml 收集管中。</li>
 <li>再次向离心柱中加入 500 μl RPE 缓冲液，洗涤硅胶膜。盖紧管盖，全速离心 15 秒。</li>
 <li>将离心柱放入一个新的 2 ml 收集管中，在微量离心机中以全速离心 1 分钟，以确保硅胶膜上残留的液体被彻底去除。</li>
 <li>回收 RNA：将 RNeasy 离心柱转移至一个已标记样品信息的新 1.7 ml 微量离心管中。注意：接下来的几个步骤中，新管的管盖将保持打开状态。</li>
 <li>小心地将 30 μl 无 RNase 水直接滴加到硅胶膜的中心。切勿让移液器吸头接触硅胶膜（见示意图）。仔细操作此步骤，双手稳定移液器，确保水均匀分布在膜上。</li>
 <li>在室温下孵育离心柱 1 分钟。全速离心 30 秒。</li>
 <li>小心地将 1.7 ml 管中回收的 30 μl 溶液再次转移回上述步骤 22 中使用的同一离心柱的硅胶膜中心。将离心柱放回同一个 1.7 ml 收集管中，在室温下孵育 1 分钟，然后全速离心 1 分钟。此双重洗脱步骤可确保从膜上回收最大量的 RNA。</li>
 <li>用您的标识信息标记两个新的 1.7 ml 微量离心管，并将所有回收的 RNA 样品转移至其中一个管中。</li>
 <li>将 4 μl 该样品转移至另一个已标记的管中。此样品将被送回 UVM 进行 Nanodrop 定量和 RNA 质量评估（用于验证参与机构现场进行的 RNA 定量和定性分析）。</li>
 <li>将所有样品置于冰上。</li>
 <li>RNA 定量：使用 Eppendorf Biophotometer，在分光光度计上测量 RNA 样品在 1:50 稀释度（1 μl 样品 + 49 μl H2O）下的吸光度。</li>
 <li>使用 E-Gel（Invitrogen）1.2% 预制琼脂糖凝胶进行电泳，评估 RNA 质量。</li>
 <li>RNA 定性分析：设置 E-gel 电泳装置。根据制造商的操作说明预电泳 2 分钟。预电泳结束后，取出梳子，向每个孔中加入 14 μl 水，然后向每个孔中加入 1 μl 样品。通过上下吹打充分混匀。在一个孔中加入适当大小的 DNA Ladder 作为后续大小比对（BioLine Easy Ladder I 大小标准或 Novagen PCR marker）。记录每个泳道中的样品。电泳运行 20 分钟。</li>
 <li>拍摄凝胶图像。</li>
</ol>
2. 第一链 cDNA 合成
<ol>
 <li>标记一个0.5 ml的PCR管，并注明您的标识信息。根据上述实验测定的RNA浓度，计算获得3.0 μg RNA所需的样本体积，并将该体积的样本转移至管中。加入无RN酶的水，使总体积达到11.0 μl。</li>
 <li>加入1.0 μl T7寡聚(dT)24 将试剂加入离心管中。此步骤需特别注意移液器吸头的体积，确保所有试剂完全转移。涡旋混匀离心管，并以最高速度离心5秒。将离心管置于设定为70°C的PCR仪中孵育10分钟。</li>
 <li>在70°C孵育进行的同时，于新管中配制第一链主混合液。务必加入以下试剂 依次 涡旋并以最大速度离心5秒，然后将试管置于冰上。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">第一链合成预混液：</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5X 第一链缓冲液</td>
 <td>4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1M DTT</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mM dNTP</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>上标II</td>
 <td>1 μl </td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
使用P2微量移液器量取2 μl或更小体积的液体。</li>
<li>在步骤2的70°C孵育完成后，向管中加入8 μl在步骤3中配制的第一链预混液，然后在PCR仪中于42°C孵育60分钟。第一链合成孵育结束后，将管置于冰上。在此孵育期间，配制第二链预混液。</li>
</ol>
3. 第二链 cDNA 合成
<ol>
 <li>在新离心管中配制以下第二链预混液。置于冰上保存。使用前对所有试剂进行涡旋振荡和短暂离心。按列表顺序依次加入试剂。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">第二链预混液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 水</td>
 <td>91 µl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5X 第二链缓冲液</td>
 <td>30 µl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs (10 mM)</td>
 <td>3 µl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. coli DNA 连接酶 (10 U/µl)</td>
 <td>1 µl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. coli DNA 聚合酶 I (10 U/µl)</td>
 <td>4 µl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E. coli RNase H (2 U/µl)</td>
 <td>1 µl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
 <li>涡旋振荡离心管，然后以最高速度离心5秒。</li>
 <li>当42°C孵育结束后，将全部130 µl第二链预混液转移至含有RNA和第一链试剂的样品管中。涡旋振荡后，在室温下离心5秒。将离心管置于PCR仪中，在16°C下孵育2小时。</li>
 <li>2小时孵育结束后，样品仍保持在16°C时，向离心管中加入2 µl T4 DNA聚合酶试剂。短暂涡旋振荡并离心，然后在16°C继续孵育，额外时间不得超过5分钟。由于T4 DNA聚合酶具有3'至5'外切酶活性，孵育时间超过5分钟可能会降低cDNA的质量。</li>
 <li>5分钟孵育结束后，加入10 µl 0.5 M EDTA以终止T4 DNA聚合酶反应。将样品管储存于-20°C。</li>
</ol>
4. 沉淀 cDNA
<ol>
 <li>将相锁凝胶管以最大速度离心1分钟，确保凝胶位于管底。切勿涡旋震荡相锁凝胶管。</li>
 <li>从pH 8.0 Tris缓冲的苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）试剂中吸取162 μl的下层液体，加入第二链cDNA合成反应管中，涡旋震荡5秒以充分混匀内容物（上述实验中cDNA合成步骤的总体积为162 μl。PCI步骤要求水相与有机相体积相等）。</li>
 <li>使用微量移液器将全部cDNA-PCI混合液转移至相锁凝胶管中。切勿涡旋震荡相锁凝胶管。</li>
 <li>以最大速度离心2分钟。</li>
 <li>标记一个新的1.7 ml微量离心管。用微量移液器将相锁凝胶管中的上层液体转移至新标记的1.7 ml管中。尽量收集尽可能多的该层液体。</li>
 <li>向1.7 ml微量离心管中加入以下试剂并涡旋震荡。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>乙醇（100%）</td>
 <td>405 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4OAc</td>
 <td>80 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pellet Paint</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
 <li>将管子放入离心机中，使管盖铰链朝外，于室温下以最大速度离心20分钟。</li>
 <li>小心地从离心机中取出管子，注意不要扰动cDNA沉淀。沉淀应呈粉红色，大小约如盐粒，位于管壁铰链下方处。立即将其置于冰上，并立即进行下一步操作。</li>
</ol>
5. 清洗 cDNA 沉淀
<ol>
 <li>使用 P1000 移液器，小心地从离心管中移除全部上清液。注意不要扰动沉淀。请记住，沉淀即为您的样品！</li>
 <li>向离心管中加入 500 μl 冷的 80% 乙醇（存放于 -20°C 冰箱中）。轻轻盖上管盖，缓慢倒置数次。请密切观察沉淀。若沉淀脱落，将离心管放回管架，静置使沉淀重新沉降至管底。或者，也可将离心管以最大速度离心 15 秒，使沉淀重新沉降至管底。</li>
 <li>使用 P1000 移液器，小心地移除乙醇，注意不要扰动沉淀。倾斜离心管，以便尽可能多地移除液体。</li>
 <li>用新的一份 80% 乙醇重复步骤 2 和 3。</li>
 <li>最后，使用 P1000 移液器尽可能完全移除乙醇。以最大速度离心 5 秒，然后使用 P20 移液器移除最后几微升乙醇。目标是在不扰动沉淀的前提下，尽可能彻底地去除乙醇。</li>
 <li>将打开盖的离心管置于管架或干燥盒中，静置 10–20 分钟，使残留乙醇挥发。干燥后的沉淀在干燥状态下极易丢失，请小心轻柔操作。完成后盖上管盖。观察干燥沉淀，确认其仍存在于管中。</li>
 <li>将沉淀重悬于 22 μl 无 RNase 水中，并将离心管置于冰上。</li>
</ol>
6. 体外转录（IVT）
<ol>
 <li>ENZO 生物芯片试剂盒包含从 cDNA 制备生物素标记 cRNA 所需的全部试剂。 
将为整个班级配制一份总反应混合液，具体如下。此混合液由指导教师配制，或由教师指定班级中的一名人员配制。此操作必须在无 RNase 的环境中进行。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>每样本用量</td>
 <td>样本数</td>
 <td>总量</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>试剂 1 [10x 反应缓冲液]</td>
 <td>4μl</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>试剂 2 [10x 生物素化核苷酸]</td>
 <td>4μl</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>试剂 3 [10x DTT]</td>
 <td>4μl</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>试剂 4 [10x RNase 抑制剂]</td>
 <td>4μl</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>试剂 5 [20x T7 RNA 聚合酶]</td>
 <td>2μl </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>18 μl</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
注意：应为样本数量额外多准备一份总反应混合液，以确保移液时有足够的液体量。</li>
<li>标记一个 0.5 ml 的 PCR 管。将以下组分加入该管中，并上下吹打数次以充分混匀。在离心机中以最高速度离心 5 秒，使所有试剂沉降至管底。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>cDNA 混合物</td>
 <td>22μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ENZO 总反应混合液 [来自上文]</td>
 <td>18μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>40μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>将反应管置于 PCR 仪中，在 37°C 下孵育 16 小时。反应完成后，将样品储存于 -20°C。</li>
</ol>
7. 纯化生物素标记的cRNA
<ol>
 <li>将全部cRNA样品转移至新的1.7 ml微量离心管中。加入60 μl无RNase水和350 μl RLT缓冲液，涡旋振荡5秒。</li>
 <li>加入250 μl 100%乙醇，再次涡旋振荡。</li>
 <li>标记一个RNeasy离心柱，并将全部cRNA样品转移至该离心柱中。注意不要让移液器吸头接触硅胶膜。盖紧管盖，以最高速离心15秒。</li>
 <li>将离心柱从收集管中取出。用移液器将穿流液（收集管中的液体）重新加回到离心柱中，再次以最高速离心15秒。</li>
 <li>将离心柱放入一个新的2 ml收集管中，向离心柱中加入500 μl RPE缓冲液。盖紧管盖，以最高速离心15秒。弃去收集管及穿流液。将离心柱放入另一个新的2 ml收集管中。</li>
 <li>向离心柱中再加入500 μl RPE缓冲液。</li>
 <li>将离心柱转移至一个新的收集管中，以最高速离心2分钟，进行柱子“干燥”步骤。</li>
 <li>用您的标识信息标记一个新的1.7 ml微量离心管。将离心柱转移至该管中。</li>
 <li>向RNeasy硅胶膜中心加入30 μl无RNase水，室温孵育1分钟。盖紧管盖，以最高速离心1分钟。</li>
 <li>小心地将1.7 ml管中回收的30 μl液体重新加回到同一离心柱的RNeasy硅胶膜中心。将离心柱放回同一1.7 ml收集管中，室温孵育1分钟。以最高速离心1分钟。此双重洗脱步骤可确保从膜上回收最大量的cRNA。</li>
 <li>将此纯化的生物素标记cRNA转移至一个新的1.7 ml离心管中，并做好相应标记。</li>
 <li>采用上述RNA分离过程中所述的相同方法测定cRNA浓度。记录浓度值及260/280比值。</li>
</ol>
8. 靶标制备中cRNA的片段化
<ol>
 <li>用您的标识信息标记一个0.5 ml的PCR管。将相当于5 μg的cRNA转移至该管中。加入无RNase的水，使总体积达到16.0 μl，然后向管中加入4.0 μl的5X片段化缓冲液。管中最终总体积应为20.0 μl。</li>
 <li>涡旋混匀管内溶液，并离心10秒。将管置于热循环仪中，在94°C下孵育30分钟。孵育结束后立即置于冰上冷却。</li>
</ol>
9. 使用琼脂糖凝胶评估片段化与非片段化的cRNA
<ol>
 <li>使用1.2%预制琼脂糖凝胶安装E-gel电泳装置。根据制造商的建议，预先运行凝胶2分钟。</li>
 <li>向E-gel的每个孔中加入14 μl水。</li>
 <li>向每个孔中加入2 μl每种样品，并用移液器上下吹打充分混匀。分别分析每种样品的片段化和未片段化的cRNA。最好将同一样品的片段化和未片段化样品加载在相邻的泳道中。记录每条泳道中各样品的身份信息。</li>
 <li>向凝胶的一个泳道中加入4 μl DNA Ladder（BioLine Easy Ladder I尺寸标准或Novagen PCR Marker）。</li>
 <li>电泳运行20分钟。</li>
 <li>在凝胶成像仪上观察E-gel结果，并拍摄凝胶图像。</li>
</ol>
10. 酵母2.0基因芯片杂交
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="显示噪声模式的光谱图像；光学激发、发射结果、数据分析。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 扫描的Affymetrix酵母基因芯片图像（Affymetrix基因芯片操作系统（GCOS））
<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="静态平衡散点图、蛋白质表达分析、颜色编码标记、对数刻度。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> 
图2. 所有遗传转录本（约6,700个基因）的二维散点图，比较对照组与处理组酵母数据。每个点代表一个单独的基因。紫色标记的基因为差异表达基因，红色标记的基因则无差异表达。差异表达基因的描述见相应图例，本示例中大多数基因参与细胞周期调控。（Affymetrix GeneChip 操作软件（GCOS））
<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="细胞周期调控示意图；显示减数分裂进程中的分子相互作用和信号通路。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
图3. 该流程图展示了在受影响的生物学通路中差异表达的基因。带有红色星号标记的基因表示在减数分裂通路中下调的基因。（功能注释、可视化与整合发现数据库（DAVID）
<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="火山图，差异表达分析，p值与log2倍数变化，基因表达研究。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> 
图4. 火山图的代表性结果。对照样本与处理样本之间的比较采用p值0.05作为截断值，表达变化倍数1.5倍作为截断标准。该图使用Geospiza公司提供的Genesifter软件生成，该公司慷慨地将该软件捐赠给学生用于教学目的。

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
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<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

本视频文章的制作由 EMD-Millipore 赞助。

应用与意义。
佛蒙特大学的佛蒙特遗传学网络外展项目在全州范围内面向八所合作的学士授予院校开展本科生外展工作。VGN 外展核心的目标是通过实践体验，使佛蒙特州的本科生能够接触最先进的科学技术与资源。所述的基因芯片模块于2003年开发，并随后进行了升级。该模块已作为短期课程提供，或整合进参与机构现有的实验课程体系中。
该项目连接研究型大学核心设施与本科院校，推动了教育与科研领域的合作。全州范围内的微阵列技术推广活动丰富了教学内容，为核心设施、教师和学生创造了科研及交流机会。
当本科教师采用该课程时，只要存在适当的Affymetrix GeneChips芯片及相应注释，就鼓励他们设计独特的实验。本模块的全部信息，包括实验手册、参考文献和PowerPoint演示文稿，均可在线获取（Vermont Genetics Network，2008）。
关键步骤：
原生质球制备：在显微镜下观察原生质球制备是否成功至关重要。使用SDS具有显著优势，因为它可导致酵母细胞膨胀，形成球状体。需注意观察出芽细胞是否也形成了球状体。若观察到部分原生质球化现象，建议延长溶壁酶处理时间。
沉淀物清洗：在沉淀反应及随后的乙醇洗涤步骤中，非常容易丢失cDNA沉淀物。必须格外小心，并对沉淀物进行细致的观察和处理。
将水加至膜的中心位置： 在从膜上洗脱 RNA 的步骤中，必须将 30 μl 水直接“喷射”到硅胶膜的中心。如果未准确加至中心，可将柱子进行离心，然后将所得的洗脱液再次加回到硅胶膜上。此操作可根据需要重复多次。
修改与产品替代：
<ol>
 <li>可使用其他替代的RNA纯化柱，例如USB prep-ease、Invitrogen Pure Link RNA试剂盒以及Omega RNA纯化试剂盒等。</li>
 <li>裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为可选酵母。Affymetrix GeneChip芯片上同时包含了两种酵母的基因组。</li>
 <li>可采用不同的处理方式和处理时间，包括药物处理、温度处理、抗氧化剂处理等，处理时间也可根据需要进行调整。</li>
 <li>由于本方法采用Oligo(dT)引物，因此可能无需进行DNase处理。</li>
 <li>无需使用同一份30 μl洗脱液对柱子进行两次洗脱，通常一次洗脱已足够。建议进行两次洗脱是为了确保RNA的完全回收。此外，用于从柱子上洗脱RNA的水可预先加热至65°C，以进一步提高从硅胶柱上回收RNA的效率。</li>
 <li>RNA定量方法有多种，Eppendorf和Nanodrop仪器仅因其操作简便且准确性经过验证而被选用。</li>
 <li>琼脂糖凝胶电泳可使用常规实验室设备进行。E-Gel并非必需，但因其无RNase且无需等待凝胶凝固，故更受推荐。</li>
 <li>文中已提供相关产品的订购信息，但许多通用试剂可从多个供应商处采购。</li>
 <li>若更具成本效益，One Cycle cDNA试剂可单独购买。</li>
 <li>尽管存在其他靶标制备方法，但我们认为本方法能为学生提供更多的教学实践机会。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌器（2个）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-10移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-20&amp;#39;移液器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-200&amp;#39;移液器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000&amp;#39;移液器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机与透射仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-Gel装置</td><td>Invitrogen</td><td>G6000-08</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>G6018-02</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1.7 ml 透明离心管</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT175C</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.5 ml 透明离心管</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 2 ml 收集管</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT200NC</td><td></td></tr><tr><td>P-10 ART吸头盒：</td><td>CLP</td><td>BT10XL</td><td></td></tr><tr><td>P-100 ART吸头盒：</td><td>CLP</td><td>BT200</td><td></td></tr><tr><td>P-20 ART吸头盒：</td><td>CLP</td><td>BT20</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 ART吸头盒：</td><td>CLP</td><td>BT1000</td><td></td></tr><tr><td>酵母芯片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml 无菌一次性移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 无菌一次性移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验服</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>记号笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌指示胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>386790</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca、Mg或染料的HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini试剂盒：</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNase试剂盒：</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase清除剂</td><td>Denville Scientific</td><td>D1180</td><td></td></tr><tr><td>Harleco 100%乙醇</td><td><a href="http://www.emdchemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>65347</td><td></td></tr><tr><td>ENZO IVT试剂盒</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-42655-10</td><td></td></tr><tr><td>溶壁酶：一瓶</td><td>VWR international</td><td>IC19012310</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4.86505</td><td></td></tr><tr><td>酵母培养物：</td><td>ATCC</td><td>18824</td><td></td></tr><tr><td>YPD肉汤粉末</td><td><a href="http://www.emdchemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4.8504</td><td></td></tr><tr><td>D(+)葡萄糖，无水</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>346351</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>56755</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS溶液</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>7990-OP</td><td></td></tr><tr><td>沉淀染料（Pellet Paint）</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>69049</td><td></td></tr><tr><td>无RNase和DNase的PCI（7份分装）：</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32711-500</td><td></td></tr><tr><td>7.5 M NH₄OAc</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1987 5980</td><td></td></tr><tr><td>片段化缓冲液（200 mM Tris-乙酸盐，pH 8.1，500 mM KOAc，150 mM MgOA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱基</td><td>Fiaher</td><td>50-899-90034</td><td></td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9757725</td><td></td></tr><tr><td>MgOA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681042</td><td></td></tr><tr><td>上样染料</td><td>Invitrogen</td><td>10482055</td><td></td></tr><tr><td>PCR Marker</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>69278-3</td><td></td></tr><tr><td>相分离凝胶（Phase Lock Gels）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP2302820</td><td></td></tr><tr><td>One-Cycle cDNA试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A10752-030</td><td></td></tr><tr><td>包含：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌DNA聚合酶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP&amp;#39;s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-7寡聚(dT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml EDTA，pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>第一链合成缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌RNaseH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>第二链合成缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌DNA连接酶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 的微阵列分析

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

在本实验方案中，酵母（Saccharomyces cerevisiae）在暴露于由过氧化氢（H2O2）——一种氧化剂——诱导的氧化应激后，其基因表达发生变化。实验中，酵母在含3倍葡萄糖的1/2X YPD培养基中培养48小时。随后将培养物分为对照组和处理组。实验组培养物用含有0.5 mM H2O2的Hanks平衡盐溶液（HBSS）处理1小时，对照组则仅用HBSS处理。从两组培养物中提取总RNA，并通过多步反应将其转化为生物素标记的cRNA产物。最终合成产物送回佛蒙特大学（UVM）微阵列核心实验室，杂交至Affymetrix酵母基因芯片。所得基因表达数据被导入生物信息学数据分析软件进行分析。

在本实验方案中，酵母（Saccharomyces cerevisiae）在暴露于由过氧化氢（H2O2）这一氧化剂诱导的氧化应激后，其基因表达发生变化。

Saccharomyces cerevisiae 的微阵列分析

在本实验方案中，通过添加过氧化氢诱导氧化应激后，改变酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的基因表达。

本实验的总体目标是通过检测经历氧化应激的酵母基因表达差异，向本科科学专业学生介绍微阵列技术。首先，从经过过氧化氢处理的酵母培养物及其未处理的对照样本中分离总RNA，以实现这一目标。实验的第二步是从这些RNA样品中生成并纯化cDNA。然后利用cDNA通过体外转录制备生物素标记的cRNA。该实验流程的最后一步是将生物素标记的cRNA片段化，以便与AFI指标酵母基因芯片进行杂交。最终获得的结果可显示两种酵母样品间的基因表达差异，并通过生物信息学分析向本科生展示微阵列分析的强大功能。佛蒙特州遗传学网络外展团队首次提出该方法的构想，是源于他们承担了一项任务，即向整个佛蒙特州的科学学生推广微阵列（microray）技术，以增强其科学教育。迄今为止，该方法已应用于该州八所学士学位授予院校的多个教学点。因此，使用微阵列教学模块的主要优势在于，它使我们能够向一组学习者讲授在实验室中日常广泛使用的通用分子生物学技术。我们还可以利用这一平台向学生、教师以及各类团体开展教学。事实上，我们的项目中有学生与教授共同合作，他们学习一些需要精细操作的技术，例如RNA操作，这并非易事。他们学习如何使用可视化试剂沉淀DNA。学生将实际操作他们在研究生阶段或日常分子生物学实验中会遇到的技术。尽管该方法适用于研究氧化应激和酵母，但它同样可应用于其他模式生物及您可能希望研究的其他生物系统。基因表达的变化可能与发育变化、环境毒素、特定疾病状态以及其他众多因素相关。为了检测酵母在氧化应激条件下基因表达的差异，首先通过酶解法从两个酵母培养物中提取总RNA。其中一个培养物经0.5毫摩尔过氧化氢在Hank's平衡盐溶液中处理一小时以诱导氧化应激，另一个培养物则仅用HBSS处理作为对照。首先，用适当的标识信息标记两支1.7毫升的微量离心管。将1.5毫升相应的酵母培养物转移至每支离心管中。在室温下以5,000 ×g离心2分钟。离心后，使用微量移液器小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。在继续操作前，检查沉淀是否足够大。如果沉淀过小，向含有沉淀的同一离心管中加入1.5毫升培养物，再次离心以获得更大的沉淀。用微量移液器弃去上清液，尽可能去除酵母沉淀中的液体。然后向酵母沉淀中加入100 µL SG缓冲液和30 µL溶壁酶溶液，涡旋混匀。将两个试管在室温下孵育30分钟，孵育期间保持静置。每10分钟轻轻摇动每个试管以生成球形体。进行酵母球形化培养时最关键的步骤之一是确保处理后真正形成了100%的球形体。这意味着并非所有的溶壁酶效果都相同。因此，您必须进行检查，以确保所用的裂解酶能够获得良好的球形化效果。这意味着您需要取少量样品，将其置于显微镜载玻片上，并加入0.1% SDS，在显微镜下观察，以确认原生质体是否成功形成。为观察完整的球形化过程，可吸取10微升酵母样品置于载玻片上，在显微镜下边观察边加入1微升0.1% SDS，使酵母细胞膨胀并形成完美的球体或类球体。需要注意的是，出芽细胞也应形成S形球体。若观察到部分球形铺板，建议延长裂解酶处理时间。当每管中加入 350 微升 BRLT 缓冲液后确认已实现完全的球形铺板时，再加入 250 微升 100% 乙醇。确保管盖紧密闭合，用手按住管盖后剧烈涡旋震荡一分钟。该实验步骤将裂解Sphero平板中的细胞。随后，使用R和easy Z自旋柱从两种培养物中收集并纯化RNA。最后，通过1.2%预制琼脂糖凝胶电泳评估提取RNA的质量，以制备生物素标记的cRNA。首先利用从酵母细胞中提取的总RNA通过逆转录合成cDNA。在cDNA生成后，准备用于cDNA沉淀的相锁凝胶管，将相锁凝胶管以最大速度离心一分钟，确保凝胶位于管底。请勿涡旋振荡相锁管以沉淀cDNA，用移液器吸取162微升pH为8.0的Tris缓冲酚-氯仿-异戊醇（PCI）混合物的下层液体，加入至第二条链cDNA合成反应管的162微升反应产物中，此步骤需使用等体积的水相与有机相混合物。涡旋5秒以混匀内容物。接着，使用微量移液器将全部CD N-A-P-C-I混合物转移至相锁凝胶管中。请勿涡旋相锁凝胶管，以最高速离心2分钟。然后使用微量移液器将相锁凝胶管中的上层液体转移至新标记的1.7毫升离心管中。尽量收集尽可能多的该层液体。向该1.7毫升微量离心管中加入405 µL 100%乙醇、80 µL乙酸铵以及1 µL沉淀染料涡旋液。将离心管轻轻放入离心机中，管盖铰链朝外，以最大转速离心20分钟。室温下离心结束后，小心从离心机中取出离心管，注意不要扰动CD NA沉淀。由于沉淀染料的存在，沉淀应呈粉红色，大小约如一粒盐。在管子铰链下方的一侧，将CD NA沉淀置于冰上，并立即开始清洗沉淀。开始清洗CD NA沉淀的操作时，使用P 1000微量移液器小心地将管中所有上清液移除，注意不要扰动沉淀。将500 µL冰冷的80%乙醇加入管中。轻轻盖紧管盖，缓慢倒置数次。密切观察沉淀物，确保其未从管壁脱落。如果沉淀物脱落，可通过将离心管放回离心架并静置，使沉淀物重新沉降至管底，或以最高速度离心15秒，使沉淀物重新聚集。接下来，使用P1000微量移液器小心吸除乙醇，避免扰动沉淀物。倾斜离心管，以便尽可能多地移除液体。加入适量冰冷的80%乙醇，盖紧管盖后缓慢倒置数次。用P1000微量移液器尽可能吸除全部乙醇后，将离心管以最大转速离心5秒。然后使用 P 10 微量移液器小心吸除残留的少量乙醇，避免扰动沉淀。将管盖打开，置于干燥箱中 10 至 20 分钟，以挥发残留的乙醇。沉淀干燥后极易丢失，因此请轻柔操作离心管，并及时盖上管盖。干燥完成后，观察干燥沉淀物以确认其存在于离心管中。最后，将干燥沉淀物重悬于 22 µL 无 RNA 酶的水中，并将离心管置于冰上。随后，此 cDNA 将用于通过体外转录（使用 Enzo BioArray 试剂盒）制备生物素标记的 cRNA。在生物素标记的cRNA经过纯化和定量后，需进行片段化以制备靶标。一旦cDNA合成完成，我们便采用标准的体外转录方法来生成生物素标记的cRNA。cRNA在应用于微阵列芯片之前必须经过片段化处理。开始此操作时，将相当于五微克的 CRNA 转移至一个已标记的 0.5 毫升 PCR 管中。加入无 RNA 酶的水，使总体积达到 16 微升，然后向管中加入 4 微升 5 倍浓度的片段化缓冲液。管中的总体积应为 20 微升。涡旋混匀试管并离心10秒。然后在94摄氏度下孵育试管30分钟。在热循环仪中，孵育结束后将试管置于冰上。通过使用1.2%预铸AROS凝胶进行电泳，分析各样本中已断裂和未断裂的CRNA。电泳完成后，在透射成像仪上观察凝胶并获取图像。将最终的合成产物杂交至拟酵母基因芯片，并在此展示微阵列分析的代表性结果。此图是 atrics 基因芯片操作软件生成的扫描型 atrics 酵母基因芯片图像示例。该图为二维散点图，展示了约 6,700 个基因的全部遗传转录本，用于比较对照组与处理组酵母的数据。每个点代表一个单独的基因。用紫色标记的基因为差异表达基因，而用红色标记的基因则无差异表达。在此示例中，大多数差异表达基因均为参与细胞周期调控的基因，其功能描述已标明这一点。该流程图来自注释可视化与综合发现数据库，展示了在受影响的生物学通路中的差异表达基因。用红色星号标注的基因为减数分裂通路中表达下调的基因。最后，此处展示了使用 Geo Species Gene Sifter 软件生成的火山图的代表性结果。对照样本与处理样本之间的比较采用 P 值截断值为 0.05，表达变化倍数截断值为 1.5 倍。我们选择使用酵母，是因为酵母易于快速培养，但我们同时也意识到，操作酵母最关键的部分实际上是制备质量良好的原生质球（sphero plating）。在微阵列实验中，我们不希望发生不完全消化，导致仅获得处于G1期或G2/M期的原生质球细胞。否则，我们进行微阵列实验所用的酵母将仅处于特定的复制阶段。本实验中我们试图强调的另一个复杂问题是，沉淀 DNA 是人们日常谈论的操作，但实际操作并不一定容易。在我们的实验模块中，我们使用了专用的离心管和可视化试剂，从而能够成功离心沉淀 DNA，并直接观察到沉淀物，这为学生和教师都带来了便利。因此，该模块在开发完成后可应用于DNA和RNA研究的各个阶段。该模块实际上为本科院校的教师探索其他模式生物或其他处理方案铺平了道路，这些方案可能与现有课程体系相容，或符合他们自身的研究兴趣。例如，有研究团队考察了除草剂处理对酵母的影响，另一个团队研究了LAMP IDE处理在酵母中的作用，而还有一个团队则研究了他们特别感兴趣的一种哺乳动物细胞系中的发育变化。最后，还有另一项研究考察了不同光源对拟南芥或其他植物的影响。在观看本视频后，您应能充分理解如何与本科科学专业学生一起开展微阵列实验，包括从酵母中分离总RNA、合成cDNA，以及对生物素标记的cRNA进行片段化。通过亲自动手实践此类高水平技术，有助于巩固和加强本科阶段的科学教育。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微阵列分析FOR酿酒酵母</em

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学习微阵列分析技术，通过过氧化氢诱导的氧化应激实验，分析酿酒酵母基因表达差异。该方法帮助本科生掌握RNA提取、cDNA合成及生物信息学分析等分子生物学核心技术。

Saccharomyces cerevisiae 的微阵列分析

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