Name: 通过流动细胞测定检测和描述 Vivo 中的蛋白质自组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 了解DAmFRET流式细胞术检测活体蛋白质自组装的方法。该技术可在单细胞水平高灵敏度、高通量地定量分析蛋白质聚集倾向，适用于酵母和哺乳动物等多种模型系统。

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我们感谢 Jeff Lange、Jay Unruh、Jianzheng Wu、Tarique Khan 和 Ellen Ketter 在本检测方法开发过程中所做的贡献。本研究部分完成了 T.S.K. 和 A.R.G. 分别作为英国开放大学和美国霍华德·休斯医学研究所圣owers医学研究所研究生院注册学生攻读博士学位的论文研究要求。有关该检测方法的其他信息可访问 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016。本论文原始数据可通过圣owers原始数据存储库获取，网址为 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372。本研究由美国国立卫生研究院主任早期独立奖 DP5-OD009152、March of Dimes 基金会资助项目 No. 5-FY17-32 以及圣owers医学研究所共同资助。
作者贡献如下：概念化：T.S.K.、S.V. 和 R.H.；方法学：T.S.K.、S.V.、A.R.G. 和 A.B；调查研究：S.V.、T.S.K. 和 A.R.G.；正式分析：S.V. 和 T.S.K.；数据管理：T.S.K.；可视化：T.S.K. 和 S.V.；撰写（初稿）：S.V. 和 T.S.K.；撰写（审阅与修改）：R.H.、S.V. 和 T.S.K.；以及经费获取：R.H.。

1. 准备 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 用于 DAmFRET 检测
<ol>
	<li>使用标准的乙酸锂方法12，将实验相关的酵母菌株转化至含有目的蛋白表达的2µ型半乳糖诱导质粒中，目的蛋白在C端或N端标记mEos3.18。</li>
	<li>在液体培养基中培养酵母。
	<ol>
		<li>针对每种待测蛋白，将已转化的酵母菌落接种至96孔板中，每种设置三个重复，每个孔加入200 µL适当的非诱导培养基（即含2%葡萄糖、酵母氮源基础培养基以及用于质粒筛选的氨基酸）（图1C）。</li>
		<li>将96孔板置于板式摇床（见材料表）上，以1.5 mm振幅、1200 rpm转速、30 °C振荡培养16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导目的基因的表达（以16小时为例的代表性方案——某些蛋白可能需要更长或更短时间）。
	<ol>
		<li>诱导培养16小时后，在室温下以2200 × g 离心2分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>通过剧烈倒置去除培养基。用200 µL适当的诱导培养基（即含2%半乳糖、酵母氮源基础培养基以及用于质粒筛选的氨基酸）重悬细胞。参见图1C。</li>
		<li>在30 °C下振荡培养12小时。</li>
		<li>将培养板在室温下以2200 × g 离心2分钟（见材料表），使细胞沉淀，通过剧烈倒置去除培养基，并用200 µL诱导培养基重悬细胞。</li>
		<li>继续在30 °C、1200 rpm条件下振荡培养4小时。为降低自发荧光，应在进行DAmFRET实验前4小时完成此步新鲜培养基的重悬操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 哺乳动物质粒构建
<ol>
	<li>构建一个具有组成型启动子和mEos3.1的哺乳动物表达载体，其中包含一个用于插入目的基因的占位区域，并在两者之间加入连接子。 
	注意：我们基于一个公开可用的质粒（见材料表）构建了一个适用于Golden Gate克隆的载体M1，具体修改如下：通过G到A的点突变（根据已提交序列的位置3719）移除了原有的一个BsaI位点；通过定点突变技术对荧光蛋白mEos3.1的I157V位点进行修饰获得mEos3.1；利用Gibson组装方法，在CMV启动子与mEos3.1之间正向插入反向的BsaI位点及4x(EAAAR)连接子，从而构建出最终的M1载体。蛋白表达由CMV增强子和启动子驱动，转录终止由SV40多聚腺苷酸化信号完成。</li>
	<li>构建与上述载体兼容的插入片段文库。 
	注意：我们以合成线性片段的形式订购用于Golden Gate组装的插入片段（见材料表），其两端带有BsaI位点，可连接至M1载体中CMV启动子与4x(EAAAR)-mEos3.1之间的位置。</li>
</ol>
3. 哺乳动物细胞培养与转染
<ol>
	<li>在 DMEM + 10% FBS + 1x 青霉素-链霉素培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 HEK293T 细胞。</li>
	<li>转染前一天，将 5 × 105 个细胞接种至 6 孔板中，每孔加入 2 mL 培养基。</li>
	<li>使用转染试剂（参见材料表），按 3:1（转染试剂:DNA）的比例将 2 µg 质粒 DNA 转染入细胞。将组分混合于 150 µL 低血清培养基中（参见材料表），室温孵育 15 分钟，然后将混合物加入各孔，继续孵育 48 小时以表达蛋白。</li>
	<li>转染 24 小时后，通过落射荧光显微镜（激发波长 488 nm，发射波长 515 nm）确认蛋白表达。</li>
</ol>
4. DAmFRET 检测用哺乳动物细胞的制备
<ol>
	<li>蛋白表达48小时后，从每个孔中移除培养基，并用1 mL 37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞。洗涤后，吸除PBS。</li>
	<li>向每孔加入0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>向每孔加入0.5 mL完全DMEM培养基，重悬细胞，并确保无明显大团块存在。</li>
	<li>将每孔的全部液体转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在室温（RT）下以1000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 10 mM EDTA中。</li>
	<li>在室温（RT）下以1000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL含10 mM EDTA的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液中。</li>
	<li>将细胞置于摇床上，在持续振荡条件下固定5分钟。</li>
	<li>在室温（RT）下以1000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 10 mM EDTA中。</li>
	<li>在室温（RT）下以1000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞重悬于适合流式细胞术检测的缓冲液体积中（对于96孔板中的1个孔，使用200 µL PBS + 10 mM EDTA）。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至圆底96孔板的一个孔中。</li>
</ol>
5. 检测用酵母和哺乳动物细胞的光转化
<ol>
	<li>使用配备320-500 nm（紫色）滤光片和光束准直器的紫外灯（见材料表），在无盖微孔板上方45 cm处，边振荡边照射25分钟，对样品进行光转化。当照射到微孔板表面的光束功率为11.25 mW/cm2，总光子剂量约为17,000 mJ/cm2时，此条件适用8。</li>
</ol>
6. DAmFRET 数据采集
<ol>
	<li>使用具有非共线 488/561 激光器的成像流式细胞仪检测细胞。以下数据是计算 FRET 所需的最低要求：
	<ol>
		<li>使用 488 nm 激发 / 515 nm 发射通道采集供体荧光信号。</li>
		<li>使用 488 nm 激发 / 595 nm 发射通道采集 FRET 荧光信号。</li>
		<li>使用 561 nm 激发 / 595 nm 发射通道（与 488/595 通道非共线）采集受体荧光信号。</li>
		<li>使用 405 nm 激发 / 457 nm 发射通道采集自发荧光信号8。</li>
		<li>利用明场图像通道进行细胞体积计算。 
		注意：S. cerevisiae 的成像流式细胞仪设置如下：60 倍物镜，低流速和高灵敏度；激光功率设置为 405 nm 15 mW、488 nm 15 mW、561 nm 20 mW。HEK293T 细胞的成像流式细胞仪设置如下：40 倍物镜，低流速和高灵敏度；激光功率设置为 405 nm 15 mW、488 nm 15 mW、561 nm 20 mW。此外，我们的成像流式细胞仪为定制设计，488 nm 和 561 nm 激光器空间分离（即位于不同相机上），以便清晰区分 FRET 信号与受体荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在荧光阳性门控范围内，每样本采集 20,000–50,000 个单细胞数据。
	<ol>
		<li>通过高长宽比和较小的细胞面积对单细胞进行门控，排除具有低长宽比或大/极小细胞面积的细胞聚集体或碎片。 
		注意：在非成像流式细胞仪中，相应的参数为 FSC（前向散射）用于估算细胞大小，SSC（侧向散射）用于评估细胞颗粒度。此外，可使用 FSC 脉冲高度与脉冲宽度的关系作为单细胞门控的替代指标。此外，必须避免采集荧光值超过细胞仪灵敏度上限的事件。在我们的成像流式细胞仪中，每个荧光通道采集的事件均限制为原始像素最大值比饱和极限低一单位。同样，对于传统流式细胞仪，最高荧光强度区间的信号点（包含超出检测动态范围的事件）不应纳入分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用未进行光转化的 mEos3.1 样品获取纯供体信号，使用单体 DsRed2（其光谱与 mEos3.1 的红色形式相似）获取纯受体信号，进行补偿校正13。为提高灵敏度，在分析程序中应将 FRET 检测通道也视为溢出目标。</li>
	<li>设门筛选仅含荧光阳性的单细胞样本（如图2所示）。</li>
	<li>将 AmFRET 参数计算为总 FRET 信号（488ex/595em）与总 FRET 受体信号（561ex/595em）的比值。</li>
	<li>使用流式细胞术软件对数据进行可视化分析（参见材料表）。 
	注意：本研究中 S. cerevisiae 的胞质浓度计算采用如下设置，同 Khan 等人8所述。数据分析使用流式细胞术软件完成（参见材料表）。</li>
</ol>

<ol><li>Krissinel, E., Henrick, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+macromolecular+assemblies+from+crystalline+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inference of macromolecular assemblies from crystalline state.</a> Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).</li>
<li>Kühner, S., van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+organization+in+a+genome-reduced+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteome organization in a genome-reduced bacterium.</a> Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).</li>
<li>Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+two%3A+protein+dimerization+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The power of two: protein dimerization in biology.</a> Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).</li>
<li>Matthews, J. M., Sunde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers%2C+oligomers%2C+everywhere%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Dimers, oligomers, everywhere.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).</li>
<li>Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-seeded+fibers+formed+by+Sup35%2C+the+protein+determinant+of+%5BPSI%2B%5D%2C+a+heritable+prion-like+factor+of+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
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<li>Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+calculus+of+protein+filament+formation+under+spatial+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22New+journal+of+physics%22%5BJournal%5D)">Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement.</a> New journal of physics. , (2018).</li>
<li>Khan, T., Kandola, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Nucleation+In+Reveals+the+Physical+Basis+of+Prion-like+Phase+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior.</a> Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).</li>
<li>Cai, X., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Lu, A., Magupalli, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Zhang, M., Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+true+monomeric+and+bright+photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).</li>
<li>Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+fluorescent+protein%2C+DsRed2%2C+as+a+visual+reporter+for+transient+expression+and+stable+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean.</a> Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).</li>
<li>Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+homo-heptamer+thermodynamics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+entropy-driven+assembly+of+co-chaperonin+protein+10%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10.</a> Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

DAmFRET 是体内检测蛋白质自组装最全面的方法。DAmFRET 能够在宽浓度范围内以单细胞分辨率和高通量直接读取同源蛋白质-蛋白质相互作用。由于 DAmFRET 可直接读取结果，且融合蛋白无需特定的亚细胞定位或不溶性状态，因此可消除假阳性信号，并将其适用性扩展至在天然亚细胞位置上的多种蛋白质。值得注意的是，通过使用光谱上与 mEos3.1 兼容的荧光团（如 T-Sapphire 和 mCardinal）标记细胞器，可在进行 DAmFRET 检测的同时确定可溶性及组装形式蛋白质的亚细胞定位。
按照本文所述使用成像流式细胞仪，分析一块96孔板（每孔约20,000个门控细胞）需要8小时。然而，我们也常规使用标准（非成像）流式细胞仪进行DAmFRET检测，其通量显著更高（每分钟最多可达20个样本）。事实上，任何具备空间分离的488 nm和561 nm激光器、无对数放大伪影，并配备适当光电倍增管（PMT）和滤光片以检测供体、FRET和受体信号的流式细胞仪，均足以完成DAmFRET实验。目前，这种通量的提升是以牺牲定位信息和体积测定为代价的，因此自组装分析只能基于蛋白表达水平而非浓度进行。对于定性分析而言，这并非问题。此外，可通过将光谱上 distinct 的荧光团与一种内源性“看家”蛋白融合，而该蛋白的表达水平与胞质体积高度相关，从而可能实现对胞质体积的估算。
正如我们在酵母和哺乳动物细胞中应用DAmFRET所展示的那样，DAmFRET可轻松适配于不同的表达系统，从而能够在天然的细胞环境中研究蛋白质的自组装过程。此外，该方法还能够比较在差异较大的细胞培养模型中蛋白质的组装情况，以研究调控蛋白质自组装机制的保守性。

研究同型蛋白质相互作用或&#34;自组装&#34;的实验方法至关重要，因为蛋白质的寡聚状态和溶解度决定了其功能。蛋白质组中存在大量同源多聚体1,2,3,4，而以单体形式发挥功能的蛋白质相对较少。在应激、衰老或调控异常的情况下，蛋白质也可能发生异常组装，从而导致活性的病理性改变。确定调控此类事件的因素，甚至这些组装体的物理本质，通常极具挑战性。
越来越多的蛋白质被发现能够以极强的协同性和不确定的化学计量比进行自组装，从而与其他细胞组分分离，形成富含蛋白质的相态。这些相态可表现为无序的凝聚体，如液滴和凝胶，或高度有序的纤维结构，如淀粉样纤维。后者的构象波动使其初始形成过程（即成核）在分子水平上本质上具有概率性5,6。由于成核概率与体积成正比，在活细胞有限的空间范围内，这类组装过程可能表现出高度的随机性7,8。在随机成核限制的相分离极端情况下，存在一类称为朊病毒（prions）的高度有序蛋白质组装体，它们极少自发成核，但一旦形成，便能无限地自我复制并持续生长。其中一种名为ASC的蛋白质，在哺乳动物先天免疫细胞的活性调控中执行一种数字化的、类朊病毒样的开关功能。ASC的自组装由其与特定蛋白质的相互作用引发，这些蛋白质在结合病原体相关或危险相关分子模式后自身已发生寡聚化。形成的ASC组装体继而促使前体半胱天冬酶-1（procaspase-1）发生自组装并激活，导致细胞因子成熟及细胞焦亡9,10。ASC中负责其组装的区域属于死亡结构域超家族，该家族在人类蛋白质组中包含一百多个成员。尽管死亡结构域在先天免疫和程序性细胞死亡中发挥关键作用，但其中大多数成员在自组装特性方面尚未被充分表征。发现并表征更多具有此类行为的蛋白质，将极大受益于一种直接的、单细胞水平的蛋白质自组装检测方法。
研究蛋白质自组装的经典蛋白质生物化学方法，如尺寸排阻色谱法和超速离心法，主要局限于对群体水平的评估。然而，由成核限制的相变所导致的细胞间异质性无法通过这种程度的分析进行建模。基于荧光显微镜的单细胞方法能够重新获得这种分析能力，但其通量不足以准确定量成核过程或检测稀有聚集体。此外，大多数可溶性自组装体（如多数酶和前淀粉样寡聚体）体积过小且运动性强，无法通过标准光学显微镜分辨。尽管可通过荧光相关光谱等更复杂的技术进行检测，但这些方法在可分析细胞数量和通量方面极为有限。
基于邻近关系的蛋白质组装检测方法（如FRET和分裂荧光蛋白互补技术）为解决上述问题提供了潜在方案。然而，这些方法通常需要使用两种不同的构建体，分别表达与互补标签融合的目标蛋白——在FRET中即为供体和受体荧光蛋白。这种策略限制了实验通量，并且由于细胞间供体与受体表达水平的差异，还会降低检测灵敏度。为克服这一局限，我们设计了一种检测方法，采用一种可光转换荧光蛋白mEos3.111，使得单一构建体即可同时表达供体和受体标记的蛋白。未转换的mEos3.1（类似GFP的供体）发射光谱与经光转换后的mEos3.1（类似dsRed的受体）激发光谱具有足够重叠，当分子彼此靠近时（&#60;10 nm），即可发生FRET。因此，通过用经验确定剂量的405 nm光照处理细胞，将总mEos3.1中适量比例转换为受体形式，我们可在不同样本、不同表达水平及多次实验之间实现供体与受体相对含量的一致性和可重复性。我们分别使用561 nm光直接激发受体荧光，或使用488 nm光通过供体能量转移间接激发受体荧光（即敏化发射FRET），测量受体荧光强度。将这两个信号值的比值作为蛋白质组装程度的指标，我们将其称为双激发荧光FRET（amphifluoric FRET），简称AmFRET。
为了通过流式细胞术计算蛋白质浓度，我们首先计算用 mEos3.1 标记的 Spc42 的平均荧光强度。由于酵母细胞含有约 1000 个 Spc42 分子，因此我们可以进一步计算单个荧光绿色 mEos3.1 分子的荧光强度。利用在所有细胞浓度下均一的光转化效率（图 1E），我们将光转化后所有受体强度对应的总 mEos3.1 荧光值进行关联。随后，我们将荧光蛋白的总摩尔数除以近似的细胞质体积（通过成像流式细胞术测定），从而获得目标蛋白质的总细胞质浓度。具体计算过程请参见原始文献8。
通过在酵母中表达融合了mEos3.1的蛋白并使用2µ质粒，我们可在每个样品中检测约一千倍范围内的蛋白浓度8。在HEK293T细胞中，我们则利用转染过程中质粒摄取的差异，从而导致拷贝数不同，实现相同的浓度范围检测。
对成千上万个细胞的AmFRET或DAmFRET结果分布进行分析，可揭示任意目标蛋白在细胞质中自组装的浓度依赖性。总体而言，DAmFRET是一种具有推动作用的方法学，能够以前所未有的灵敏度、通量和可重复性组合，用于发现和表征蛋白质自组装过程。
尽管使用成像流式细胞仪能够实现体内蛋白质浓度的测量，但这类仪器尚未在大多数研究机构中普及。然而，即使在普通的非成像流式细胞仪上也可以运行DAmFRET，以获得蛋白质表达水平范围内蛋白质组装的分布情况。

<table><tbody><tr><td>96 孔板</td><td>Axygen</td><td>P96-450R-C-S</td><td></td></tr><tr><td>ASC 2-92（哺乳动物质粒）</td><td></td><td>rhm1.0095</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>ASC 2-92 (R41E)（哺乳动物质粒）</td><td></td><td>rhm1.0096</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>ASC 2-92 (R41E)（酵母质粒）</td><td></td><td>rhx2432</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>ASC 2-92（酵母质粒）</td><td></td><td>rhx2431</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>&quot;centrifuge&quot; in text</td></tr><tr><td>CSM -Ura</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1004-100</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>EMD Millipore</td><td>DX0145-5</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td>DeNovo</td><td>FCS Express 6 Flow</td><td>&quot;flow cytometry software&quot; in text</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR Life Science</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BioRad</td><td>ZE5</td><td>非成像流式细胞仪</td></tr><tr><td>FUGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&quot;transfection reagent&quot; in text</td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>VWR Life Science</td><td>0637-500g</td><td></td></tr><tr><td>HSPE1（酵母质粒）</td><td></td><td>rhx1531</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>成像流式细胞仪</td><td>EMD Millipore</td><td>ImageStream X Mark II</td><td>&quot;imaging flow cytometer&quot; in text</td></tr><tr><td>哺乳动物细胞</td><td></td><td>HEK293T</td><td></td></tr><tr><td>mEos3.1（哺乳动物质粒）</td><td></td><td>rhm1</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>mEos3.1（酵母质粒）</td><td></td><td>rhx0935</td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>optiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>&quot;reduced serum media&quot; in text</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR Life Science</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>光转化灯</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>质粒 #54525</td><td>Addgene</td><td>#54525</td><td>&quot;publicly available plasmid&quot; in text</td></tr><tr><td>Titramax 1000 板式振荡器</td><td>Heidolph Instruments</td><td>1000</td><td>&quot;plate shaker&quot; in text</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>酵母菌株</td><td></td><td>rhy1713</td><td>可应要求提供 - S288c (MAT&amp;alpha; lyp1&amp;Delta; can1&amp;Delta;::STE2pr_SpHIS5 his3&amp;Delta;1 leu2&amp;Delta;0 ura3&amp;Delta;0 met15&amp;Delta;0 cln3&amp;Delta;0::GAL1pr_WHI5_hphMX)</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

蛋白质自组装调控蛋白质功能，并在时间和空间上对细胞过程进行区室化。目前研究该过程的方法存在灵敏度低、读数间接、通量有限，以及仅限于群体水平而非单细胞分辨率等局限性。我们设计了一种基于流式细胞术的单一方法——分布式两亲性荧光共振能量转移（DAmFRET），可克服上述所有限制。DAmFRET通过体内敏化发射荧光共振能量转移（FRET）来检测和定量蛋白质自组装，适用于从酵母到人类细胞等多种模式系统，且无论蛋白质定位或溶解性如何，均可实现高灵敏度、单细胞水平、高通量的检测读数。

检测不形成点状结构的寡聚体
我们此前已应用 DAmFRET 技术表征蛋白质相分离，该过程通常形成较大的蛋白质组装体，可通过荧光显微镜检测。为证明 DAmFRET 在衍射极限下蛋白质组装体中的适用性，我们分析了一种生化性质明确、可形成离散同源七聚体的蛋白质，其尺寸远小于光学显微镜的分辨极限：人源辅伴侣素 HSPE114。我们比较了仅表达 mEos3.1 或表达 HSPE1-mEos3.1 的酵母细胞的 DAmFRET 谱图。后者表现出均匀的正 AmFRET 值，而前者 AmFRET 可忽略不计（图 3A）。成像流式细胞仪（见材料表）获取的细胞图像显示，无论是表达 mEos3.1 还是 HSPE1-mEos3.1 的细胞，在所有通道（供体、FRET 和受体）均呈现弥散的荧光信号（图 3B）。为在更高光学分辨率下验证该结果，我们采用共聚焦显微镜对多个视野的细胞采集 z 轴层扫图像。结果表明，无论细胞表达 HSPE1-mEos3.1 还是单独的荧光蛋白，荧光信号均均匀分布于细胞质中，未检测到任何明显荧光点（图 3C）。需注意，HSPE1 的表征解离常数 Kd 约为 3 µM，略低于本系统的检测灵敏度，因此我们未观察到该离散同源寡聚体所预期的 FRET 与浓度之间的S形关系。尽管如此，我们仍得出结论：DAmFRET 能够在单细胞分辨率下稳健地检测体内可溶性同源寡聚化。
检测成核限制性组装体
为了展示 DAmFRET 区分离散型同源寡聚体与成核限制性组装体（如朊病毒）的能力，我们分析了人源炎性小体蛋白 ASC。与野生型 ASC 相比PYD 形成丝状结构 体内ASC的无活性突变体R41EPYD 不9,10在酵母细胞中表达 mEos3.1，或表达与 WT 或 R41E ASC 融合的 mEos3.1PYD仅表达荧光蛋白或ASC突变体的酵母细胞PYD 在整个浓度范围内表现出可忽略的AmFRET，表明其无自相互作用能力。相比之下，野生型ASCPYD 表现出具有两个群体的 DAmFRET 谱型：一个群体的 AmFRET 可忽略不计，另一个群体则具有高 AmFRET（图4A）。荧光图像已证实这一点（图 4B），这些群体分别代表仅含有可溶性蛋白的细胞，或主要含有自组装蛋白的细胞。这两个群体之间呈现不连续关系，且在重叠的浓度下出现，这表明成核屏障能够稳定蛋白的单体形式，并在实验持续时间内阻止其发生组装。8两个群体之间的AmFRET差异表明，一旦成核发生，即可近乎瞬时地将其他单体模板化为组装形式，并达到新的AmFRET稳态水平。DAmFRET验证了先前的结构数据，即点突变体ASCPYD R41E 在该表达系统可达到的浓度范围内破坏了成核过程图4A).
DAmFRET 在哺乳动物细胞中的适用性
尽管酵母细胞是进行DAmFRET实验的理想宿主细胞，但我们希望将DAmFRET的应用扩展到哺乳动物细胞。为了避免功能性ASC多聚体引起的细胞死亡，我们在缺乏caspase-1表达的HEK293T细胞中测试了DAmFRET。我们在HEK293T细胞中表达了与图4A中酵母细胞相同的蛋白。结果显示，HEK293T细胞中的DAmFRET谱图在定性上与酵母细胞中的结果相似（图4A、C）。因此，DAmFRET是一种用途最广泛的体内方法，可在单细胞分辨率下高通量地检测和定量核化蛋白的自组装，且不受显微镜下可见点状结构的存在与否以及细胞类型的限制。
<img alt="蛋白质诱导与光转化FRET实验；示意图、图形分析、发射光数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：S. cerevisiae实验设计概览。本图经Khan等8许可改编。（A）2µ质粒图谱，显示目标蛋白的开放阅读框，该蛋白带有光可转化的mEos3.1标签，并由诱导型启动子驱动表达。（B）当转化至酵母细胞后，2µ复制系统导致细胞间拷贝数高度变异。这种变异与GAL1启动子引起的转录噪声共同作用，导致细胞群体中蛋白表达水平呈现广泛分布。（C）酵母DAmFRET实验总体流程。为确保实验中细胞状态良好，首先将菌落接种于含非诱导性碳源葡萄糖的合成培养基中，培养16小时以促进增殖。增殖完成后，将细胞转移至含诱导性碳源半乳糖的合成培养基中继续培养16小时。诱导完成后，通过暴露于405 nm光照下，对细胞中的蛋白进行部分且均匀的光转化。（D）随后使用成像流式细胞术对样品进行分析。绿色和红色mEos3.1的光谱特性及荧光强度使其分别非常适合作为FRET的供体和受体。当二者彼此靠近时（如底部细胞所示聚合物中），激发绿色分子可使红色分子产生荧光（即发生FRET）。（E）供体与受体荧光强度的散点图，显示光转化后呈紧密线性关系，表明光转化效率不受蛋白表达水平影响。（F）表达多种mEos标记蛋白（包括可溶性与淀粉样形式）的细胞群体中，平均受体与供体荧光强度的散点图，显示光转化效率不受融合蛋白或溶解性影响（误差棒表示三次生物学重复的标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；单细胞数据；散点图；自发荧光；FRET；胞质浓度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于成像流式细胞术数据的 DAmFRET 门控策略。 门控策略用于仅分析聚焦良好、无出芽的单细胞，这些细胞具有低自发荧光并表达荧光蛋白。(A) 获取聚焦良好、活的单细胞用于分析的门控层级。(B) 明场通道梯度均方根（RMS）的直方图。该测量可用于选择在透射光下聚焦良好的细胞。(C) 圆形度与面积的密度图，显示已门控的无出芽球形单细胞群体。(D) 自发荧光（Ch07）与供体荧光（Ch02）强度的密度图，显示表达荧光蛋白的细胞（已门控）与暗细胞的两个独立群体。(E) 供体与受体荧光强度的散点图，显示部分细胞中供体荧光明显减弱，这是由于供体与受体荧光团之间发生 FRET 所致。(F) 最终的 DAmFRET 图。含有未组装蛋白的细胞集中在 AmFRET 值为零附近，而含有自组装蛋白的细胞则表现出正的 AmFRET 值。图中两个重叠的群体表明，该蛋白形成如淀粉样蛋白等高阶组装结构时存在有限的成核能垒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="mEos3.1、HSPE1 蛋白相互作用的 FRET 分析图表与显微镜图像；浓度效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过流式细胞术和显微镜观察单体与七聚体蛋白的代表性数据。（A）单体 mEos3.1 蛋白（左）和标记 mEos3.1 的七聚体 HSPE1（右）的 DAmFRET 谱图，显示同源组装导致的比率型 FRET 增强。（B）流式细胞仪获取的表达 mEos3.1（左）和 HSPE1（右）细胞的图像，显示所有捕获通道的结果。（C）表达单体 mEos3.1（左）和 HSPE1（右）的酵母细胞代表性图像。图像为共聚焦切片的叠加投影。至少观察了五十个细胞以验证此结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="评估蛋白质相互作用的FRET分析图，包括细胞质浓度和受体强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4DAmFRET谱图显示人ASC具有相似的自组装行为PYD 蛋白在 S. cerevisiae 和 HEK293T 细胞。 (A密度图显示AmFRET与细胞质浓度（以 µMmEos3.1（左），或与ASC野生型（中）及ASC单体化突变体融合的mEos3.1PYD （右侧）在 S. cerevisiae. (B流式细胞仪图像，分别显示来自下门和上门（左图和中图）表达野生型ASC的细胞PYD；以及表达ASC的细胞PYD 所示门控的 R41E（右侧面板）。(C密度图显示与 (A) 相同系列的蛋白质在 HEK293T 细胞中表达时，AmFRET 与受体荧光强度的关系。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于FRET的流式细胞术方案，用于定量分析酿酒酵母（S. cerevisiae）和HEK293T细胞中的蛋白质自组装。

蛋白质自组装调控蛋白质功能，并在时空上对细胞过程进行区室化。目前研究该过程的方法存在……

由于缺乏合适的工具，人们对细胞内蛋白质自组装物理基础的理解受到限制。现有方法存在灵敏度低、读数间接、通量有限和/或群体水平分辨率不足等问题。相比之下，我们的检测方法能够以高灵敏度、单细胞分辨率和高通量的方式，在体内直接检测并量化蛋白质自组装的倾向性，且不受蛋白质定位或溶解度的影响。初次尝试该检测时，为在整个培养板上获得良好的检测信号，可能需要通过一些经验性测试来优化光转换条件。如果流式细胞仪没有为FRET信号和受体信号配备独立的检测滤光片，则该检测的灵敏度可能会受到影响。接下来将与我一同演示实验操作的是细胞分析核心实验室的实验室主管Andrew Box。为准备用于DAmFRET的酵母培养物，针对每种目标蛋白，将转化后的酵母菌落以三份重复接种于96孔圆底培养板的各个孔中，每孔含200微升适当的非诱导性生长培养基。将酵母细胞在30摄氏度下，以1.5毫米轨道直径、1,200转/分钟的振荡条件下培养16小时。培养结束后，通过离心沉淀酵母细胞，并通过剧烈倒置去除上清液。加入200 µL适当的诱导培养基，将细胞放回摇床培养箱中继续培养12小时。培养结束后，通过离心和剧烈倒置沉淀酵母细胞，然后加入200 µL新鲜的诱导培养基。随后将细胞在摇动条件下继续孵育额外4小时，以降低自发荧光。为进行光转化处理，将无盖的培养板置于紫外灯下，紫外灯需配备320至500纳米的滤光片和准直光束器，并将其放置在培养板上方45厘米处。打开光源，在振荡条件下照射25分钟以完成细胞的光转化。对于DAmFRET数据采集，将光转化后的细胞加载至成像流式细胞仪上，该仪器配备非共线的488和561纳米激光器，并通过高圆度和小细胞面积圈选四个单个未出芽细胞。然后在荧光阳性门内，每样本收集两万至五万个单细胞的数据。分析结束时，使用未进行光转换的 mEos3.1 样本作为纯供体信号，单体 DsRed two 作为纯受体信号来设置补偿。为了获得更高的灵敏度，确保在分析程序中也将 FRET 检测通道设为溢出目标通道。将AmFRET参数计算为总FRET信号与总FRET受体信号的比值。仅表达荧光蛋白的酵母细胞表现出可忽略的AmFRET，而表达与荧光蛋白融合的稳定同源寡聚体的酵母细胞则表现出均匀的正值AmFRET。通过成像流式细胞术获取的细胞图像显示所有通道中均存在弥散的荧光。对多个细胞区域的Z轴层扫共聚焦显微镜成像显示，荧光在整个细胞质中均匀分布，未检测到明显的荧光点状聚集。仅表达荧光蛋白或表达荧光蛋白加上人源炎症小体蛋白突变体的酵母细胞，在整个浓度范围内均表现出可忽略的AmFRET信号，表明其不具备自我相互作用能力。相比之下，野生型炎症小体蛋白呈现出DAmFRET分布特征，包含一个AmFRET信号可忽略的群体和一个AmFRET信号较强的群体。需要注意的是，即使在高浓度下，野生型炎症小体蛋白仍抵抗自组装，仅在少数细胞中转变为自组装形式。这明确表明自组装过程存在成核能垒。荧光成像结果证实，这些细胞群体分别代表仅含有可溶性蛋白或主要含有自组装蛋白的细胞。事实上，DAmFRET 验证了先前的结构数据，即炎性小体中的点突变会破坏该表达系统所能达到浓度范围内的成核过程。需要注意的是，在缺乏 Caspase-1 表达的哺乳动物细胞中，蛋白质表达谱与在酵母细胞中观察到的结果相似。最需要牢记的关键步骤是光转化。其他关键步骤包括收集足够数量的、荧光信号未饱和的事件，并正确进行补偿。通过后续的适当生物化学实验、合理诱变以及结构生物学方法，有助于全面阐明自组装的机制。

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科研

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