2.1: 使用细胞计数板计数细胞

细胞计数是许多基于细胞的测定中用于确定细胞数量和活力的重要步骤。一般来说，计数的目标是了解未知细胞浓度的样品应该稀释多少才能进一步使用。最常见的细胞计数实验室工具是血细胞计数器。

血细胞计数器是一种计数工具，最初是为计数血细胞而创建的。血细胞计数器的中心是两个计数室，可以在其上找到激光蚀刻网格。

网格由 9 个主要象限组成。四个角象限进一步分为 16 个较小的象限。中央象限分为 25 个较小的象限，每个象限又进一步分为 16 个微象限。

每个腔室的远端是样品引入端口，待计数的细胞样品被分配到该端口。

计数室的两侧是盖玻片安装支架，石英盖玻片位于其上，通常位于计数室上方约 0.1 毫米处。

由于每个大方块的面积为 1 mm2，因此每个大方块所含的体积为 0.1 mm3 或 1/10,000 毫升。

在计数之前，请务必花点时间使用乙醇和 kimwipe 清洁并擦干盖玻片和计数室中的任何棉绒、指纹或水印。

然后小心地向每个盖玻片安装支架中加入少量水，水的表面张力将盖玻片固定到位。

现在轻轻研磨细胞悬液，或上下移液，以去除任何细胞团块。使用微量移液器吸出约 10 ？l 的悬浮液，然后将样品加载到其中一个引入端口。溶液将通过毛细管作用吸入计数室，并应覆盖整个网格。

当细胞沉降时，选择物镜。然后将血细胞计数器加载到载物台上。

接下来在显微镜下观察细胞。如果每个大象限中的细胞少于 5 个，则可能需要再次离心样品并以较小的体积重悬沉淀。如果细胞彼此重叠或密度太大而无法轻松区分，则可能需要用更高体积的溶液稀释样品。请务必跟踪稀释细胞的因子。您将在以后的计算中需要它。

现在是时候计算细胞了！

正如我们之前谈到的，计数室覆盖在激光蚀刻网格中。象限的线条可以更轻松地跟踪您正在计数的单元格。根据样品中细胞的密度选择用于计数的大小象限。例如，如果单元格数量较少，则对其中一个角象限中的所有单元格进行计数。对于细胞数量中等的样品，请从 16 个较小的象限中选择一个。如果细胞密度非常高，则对 25 个中央象限之一的细胞进行计数。无论您选择哪个象限或细胞样品的密度如何，每个定量至少计数 20-50 个细胞。

并非所有单元格都会整齐地落在象限内。您可以计算接触顶部和左侧行的单元格，但忽略接触底部或右侧的单元格。为了获得最准确的计数，请使用细胞计数器跟踪细胞，并取 4 个相同大小的象限中细胞数量的平均值。

要计算 1 ml 体积中的细胞数，请将计数的细胞数乘以 10,000，因为正如我们之前提到的，网格上的每个大方块都是 1/10,000 ml 的。如果您计算这些较大的象限之一，只需将此数字乘以 1 即可。如果您计算了其中一个角象限中的一个较小方块，请将此数字乘以 16。如果您计数了 25 个中央象限之一中的所有单元格，请将此数字乘以 25。如果您碰巧在加载血细胞计之前稀释了细胞悬液，您还需要乘以稀释因子。

然后，为了计算 1 ml 该样品中的细胞数，我们将该中央象限中的 20 个细胞乘以 104 和 25，得到 1 ml 样品中总共 5 x 106 个细胞。

现在我们知道了 1 ml 样品中的细胞总数，我们需要将此数字乘以溶液的总体积。因此，例如，如果我们在 1 ml 中有 5 x 106 个细胞，那么在 2 ml 中，我们总共将有 1 x 107 个细胞。

然后，为避免计数错误、细胞分布不均匀或移液错误造成的误差，请加载腔室的另一侧并再次计数细胞样品。

在显微镜下对细胞进行计数也是评估样品中细胞活力的好时机。台盼蓝是一种重要的染色剂，为此，在上样到血细胞计数器之前，通常会与样品混合。

活细胞排除这种染料，因为活细胞对允许通过其膜的物质非常有选择性。然而，死细胞没有完整的膜，这使得台盼蓝能够穿过细胞质并染色。

要检查细胞样品的活力，请用台盼蓝稀释等分试样的细胞悬液，然后像常规细胞样品一样上样台盼蓝染色样品。在相差下，活细胞会显得明亮和金黄色，应该计数;不要计算任何暗淡、死去的蓝色细胞。

像以前一样计算细胞数，这次将最终数字乘以台盼蓝稀释因子。因此，如果我们的原始代表性样品先用台盼蓝稀释，那么我们将细胞总数乘以 1：10 的台盼蓝稀释度，得到样品中总共 1x108 个细胞。

完成计数后，请记得清洁盖玻片和计数室！

既然您是细胞计数专家，那么让我们谈谈您可能需要知道特定实验中有多少细胞的一些原因。

从正常或实验组织中分离细胞后，了解您回收了多少细胞非常重要。在这里，研究人员将想知道他们从这个小鼠脾脏中分离出多少脾细胞或脾细胞。

当您进行实验以查看两种不同细胞群的反应时，重要的是要知道每种细胞类型混合在一起的数量，就像 B 细胞和 T 细胞的共培养实验一样。

您将想知道对于许多其他类型的基于细胞的检测，您有多少个细胞。这里正在设置一种 ELISPOT 检测法，以确定样品中响应人瘤病毒而分泌 IFN？（一种炎症蛋白）的细胞数量。

在进行需要从目标细胞中提取或分离 mRNA 的实验时，重要的是要知道您从多少个检出开始，以便获得足够量的 mRNA 用于实验。

血细胞计数器是一种廉价且相对易于使用的细胞计数工具，但它可能很乏味，并且可能存在人为错误。

顾名思义，Scepter 手持式自动计数仪是一种手持式计数设备，与血细胞计数器相比，计数精度更高，并且可以区分细胞样品中细胞的大小和体积。

TC10 自动细胞计数仪可评估细胞数量和活力，自动计算样品中的总细胞数量，并允许在其读出屏幕上查看细胞。

您刚刚观看了 JoVE 的细胞计数介绍。在本视频中，我们回顾了：什么是血细胞计数器，如何对细胞进行计数并确定细胞活力，以及可能需要对细胞进行计数的一些不同原因。感谢您的观看，请记住不要计算蓝色单元格！