Name: 使用自动细胞计数器简化基因表达研究:在Namalwa细胞的IL - 4依赖的基因表达的siRNA击倒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习使用电穿孔技术将siRNA导入难转染细胞系，结合自动化细胞计数器和实时PCR分析基因表达。该方法可高效研究基因通路调控机制。

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1. 准备和计数 Namalwa 细胞
<ol>
	<li>从培养瓶中取出细胞，离心使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于已知体积的 PBS 中。本实验所用细胞为悬浮细胞。若使用贴壁细胞，则需在收集前进行胰蛋白酶消化处理。</li>
	<li>为确定活细胞数量，取部分细胞悬液，与 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1 比例混合染色，用移液器吸取 10 μl 混合液加入计数载玻片，然后将载玻片插入 TC10 自动细胞计数仪（Bio-Rad Laboratories, Inc）中进行计数。</li>
	<li>TC10 细胞计数仪将自动对焦以确保计数的准确性，随后自动完成计数，并计算出样品中活细胞和总细胞的密度。</li>
	<li>选择“查看图像”以在屏幕上显示细胞图像，然后选择“稀释计算器”，由 TC10 细胞计数仪自动计算所需细胞悬液的体积。</li>
	<li>本实验共使用三种 siRNA：一种对照 siRNA、两种靶向 STAT6 基因的不同 siRNA，以及未转染的对照组。所需细胞终浓度为每毫升 5 × 106 个细胞，总体积为 3.6 ml。</li>
	<li>将所需的细胞浓度和最终体积输入稀释计算器，仪器将根据该样品的活细胞计数自动计算所需细胞悬液的体积。也可手动完成计算。然后将计算所得体积的细胞悬液转移至新的离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液离心使细胞沉淀，并完全去除 PBS。用 3.6 ml Gene Pulser 电穿孔缓冲液（Bio-Rad Laboratories）重悬细胞。将 800 μl 细胞悬液分装至含有相应 siRNA 的离心管中，轻轻混匀。此时细胞已准备就绪，可进行电穿孔转染。</li>
</ol>
2. 在96孔板中对细胞进行电穿孔
<ol>
	<li>96 孔电穿孔板可同时对全部四种处理的重复样本进行电穿孔。</li>
	<li>将 150 μl 细胞悬液转移至 96 孔电穿孔板的相应孔中。</li>
	<li>将板插入 MXcell 电穿孔板腔室，并关闭盖子。</li>
	<li>使用针对所用细胞系和缓冲液优化的参数进行电穿孔。本实验中采用指数衰减波，仪器设置为 250 V、350 μF 和 1000 Ω 电阻。</li>
	<li>电穿孔完成后，轻轻吹打每个孔以混匀细胞，然后将细胞转移至含有预热培养基的组织培养板中。Namalwa 细胞在 RPMI（Life Technologies）培养基中培养，添加 7.5% FCS 和 1% 丙酮酸钠。</li>
	<li>未进行电穿孔的对照样品取自剩余的细胞悬液，与电穿孔细胞相同地加入预热的培养皿培养基中。</li>
	<li>将细胞在 37°C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>24 小时后，一组细胞加入重组 IL-4（R&amp;D Systems），终浓度为 10 ng/ml 进行诱导；另一组对照细胞仅补充新鲜培养基。所有细胞继续在 37°C 和 5% CO2 条件下培养额外 24 小时。</li>
</ol>
3. 提取并检测 RNA
<ol>
	<li>经过总共 48 小时的培养后，计数每个孔中的细胞，并从每个孔中转移一份等分试样至微量离心管中用于 RNA 提取，另一份等分试样则冷冻保存，用于后续的蛋白质印迹或其他蛋白质分析。</li>
	<li>离心样品以沉淀细胞，然后移除并弃去每管中的上清液。</li>
	<li>随后进行 RNA 提取。我们通常使用 Aurum 总 RNA 试剂盒（Bio-Rad），并按照试剂盒提供的操作说明进行。</li>
	<li>在监测 siRNA 介导的基因敲低时，尤其需要验证 RNA 的质量，因为降解的 RNA 会导致误导性的结果。260/280 比值并不能反映 RNA 的完整性，因此必须通过凝胶电泳或微流控装置检测样品，以确认 RNA 未发生降解。</li>
	<li>为在一步内评估 RNA 的质量和数量，这些样品将使用 Experion 自动化电泳系统（Bio-Rad）进行分析。</li>
	<li>首先加热样品，然后对 Experion RNA 芯片进行预处理、加样并涡旋混匀。将芯片插入 Experion 电泳仪中，启动运行程序。</li>
	<li>运行完成后，Experion 软件将自动显示结果，包括电泳图谱、结果表格（显示 RNA 浓度、核糖体比值和 RNA 质量指示数值）以及虚拟凝胶图像（其外观类似于传统的 RNA 凝胶）。高质量的总 RNA 样品通常具有 8–10 的 RQI 值。</li>
</ol>
4. 实时荧光定量PCR
<ol>
	<li>在确认 RNA 质量后，进行 cDNA 反应。本实验采用 iScript 一步法 RT-PCR 混合液（Bio-Rad），将 cDNA 合成与实时 PCR 反应合并为一步完成。</li>
	<li>配制主混合液，包含除 RNA 模板外每对引物所需的全部反应组分，并将其分装至 PCR 板中。</li>
	<li>将 RNA 稀释至统一浓度后，将 RNA 样品加入相应的孔中。每个反应设三个重复。</li>
	<li>密封 PCR 板，放入 CFX384 实时 PCR 系统（Bio-Rad）中。选择合适的程序并开始运行。</li>
	<li>运行结束后，通过比较实验 siRNA 电穿孔细胞中目的基因相对于参照基因的表达水平，与对照 siRNA 电穿孔细胞中相同归一化处理的结果，确定基因表达变化。</li>
</ol>
5. siRNA 沉默效果分析
<ol>
	<li>为了研究转录激活因子STAT6在IL-4依赖性诱导CCL17表达中的作用，采用定量实时PCR检测CCL17的表达水平。本实验中使用GAPDH作为参考基因，也可采用其他参考基因或多个参考基因进行类似分析。</li>
	<li>CFX Manager软件可自动将同一标本中CCL17的表达量归一化至参考基因的表达量，并只需在CFX Manager软件的实验设置窗口中选择GAPDH为“参考基因”、对照处理（未进行IL-4诱导的对照siRNA）为“对照”，即可自动将归一化后的数值与对照处理组进行比较。</li>
	<li>在无IL-4诱导的情况下，CCL17的转录维持在较低的基础水平，与对照处理组相当。</li>
	<li>经IL-4诱导且STAT6信号通路正常的细胞（即转染对照siRNA或未转染的对照处理组）中，CCL17的表达量升高了8至10倍。</li>
	<li>经IL-4诱导但通过导入STAT6 siRNA抑制STAT6表达的细胞中，CCL17的表达量仅比未诱导细胞高出约2倍，从而证实了STAT6在IL-4诱导CCL17表达过程中的关键作用。</li>
</ol>
6. 代表性结果
<img alt="IL-4 信号通路示意图，STAT6 激活，IL-4 受体结合，影响 CCL17 表达。" src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. IL-4 信号通路概述。 
A) IL-4 与其受体结合后，导致受体二聚化并激活 STAT6。活化的 STAT6 转位至细胞核，启动其靶基因（如 CC17）的转录。 
B) 在无 IL-4 诱导的情况下，CCL17 的转录将维持在低水平的基础表达状态。 
C) 在通过 siRNA 介导沉默 STAT6 基因后，即使使用 IL-4 处理，CCL17 表达也应几乎不升高或无明显增加。
<img alt="显示IL4在siRNA、STAT6 siRNA比较条件下对CCL17表达影响的柱状图，实验结果。" src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 通过不同条件下的定量实时PCR检测IL4诱导的CCL17表达。 
A) 未添加IL-4培养的样品中，无论基因表达情况如何，CCL17均维持在较低的基础表达水平。 
B) 如绿色和蓝色所示，对照样品对IL-4处理表现出正常响应，CCL17表达上调8-10倍。然而，转染靶向STAT6的siRNA的细胞（如红色和粉色所示）在IL-4刺激下CCL17表达显著降低，支持STAT6在IL-4诱导CCL17表达中发挥作用的观点。

作者受雇于 Bio-Rad Laboratories，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

本文已演示了如何将siRNA电穿孔转染至难以转染的悬浮细胞系中，以及如何在这些细胞中检测基因表达。进行该实验操作时，重要的是要记住在所有样品中尽可能保持条件一致。

使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过sirna敲低namalwa细胞中il-4依赖性基因表达

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

小干扰RNA介导的基因敲低技术在基因表达研究中持续发挥着重要作用。目前，siRNA研究不仅用于分析单个基因下调所产生的效应，还广泛应用于信号通路及其他复杂相互作用网络的探究。此类通路分析需要采用相关的细胞模型，并使用对细胞生理状态干扰较小的实验方法。电穿孔技术正日益成为将siRNA及其他核酸分子高效导入难转染细胞系和原代细胞的有效手段，同时避免对所研究的信号通路造成干扰。一个成功的siRNA实验包含多个关键步骤，且在多个实验环节中存在简化操作并提升数据质量的方法。为帮助您顺利开展siRNA介导的基因敲低项目，本文将演示从电穿孔前的细胞收集与计数，到转染后实时定量PCR基因表达分析的完整通路研究流程。本研究旨在探讨转录激活因子STAT6在伯基特淋巴瘤细胞系（Namalwa）中对IL-4依赖性CCL17基因表达的调控作用。所展示的技术适用于多种基于siRNA的实验，涵盖贴壁细胞和悬浮细胞。我们还将展示如何利用TC10全自动细胞计数仪简化细胞计数流程，如何使用MXcell电穿孔系统同时对多个样品进行电穿孔，以及如何利用Experion全自动电泳系统同步评估RNA的质与量。

本实验方案介绍了一种快速简便的工作流程，用于将siRNA导入难转染的细胞系，并通过实时PCR检测基因表达。使用自动细胞计数仪、多孔电穿孔板和自动电泳工作站，无需昂贵的机器人操作设备，即可获得快速且可靠的结果。

使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过siRNA敲低Namalwa细胞中IL-4依赖性基因表达

小干扰RNA介导的基因敲低技术在基因表达研究中仍是一项重要工具。目前，小干扰RNA研究不仅在……

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