使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过siRNA敲低Namalwa细胞中IL-4依赖性基因表达

本实验的总体目标是利用电穿孔技术将siRNA导入难以转染的细胞中，以研究基因表达。首先使用TC10自动细胞计数仪确定所需细胞悬液的用量，然后将siRNA加入细胞悬液中，并对细胞进行电穿孔处理。

使用MXL电穿孔系统进行电穿孔后，细胞培养24小时。然后向实验组细胞中添加IL-4以诱导基因转录。最后，提取RNA并采用实时PCR检测基因表达水平。

最终可以获得显示特定siRNA对基因表达通路影响的结果。大家好，我是Bio Rad Laboratories基因表达部门的高级科学家Adam McCoy。今天我们将向您展示通过电穿孔法将RNA导入难以转染的细胞系的操作流程，然后观察其对基因表达的影响。

我们在实验室中采用此方法分析单个基因的表达或通过敲除一个基因并观察其下游效应来研究基因通路。现在让我们开始操作。在细胞培养罩内，从培养瓶中取出细胞。

本实验方案中使用的细胞为悬浮细胞。如果您使用的是贴壁细胞，则在收集细胞前需要用胰蛋白酶处理。通过离心使细胞沉淀。

细胞离心后，弃去上清液，并将细胞重悬于 PBS 中。为确定活细胞数量，取一部分细胞悬液，按 1:1 的比例加入台盼蓝染液以染色死细胞。台盼蓝染色可用于活死细胞鉴定，但总细胞计数时无需使用。

仅将混合液移液至一次性计数板的加样口，然后将其插入TC 10全自动细胞计数仪。TC 10将首先自动对焦，以确保计数结果最为准确，随后开始进行细胞计数。屏幕上将显示样品中每毫升的活细胞数和总细胞数。

选择查看图像以在屏幕上显示细胞。然后使用上或下箭头，根据需要放大或缩小，以计算实验所需的细胞悬液量，并选择稀释计算器。

输入本实验所需的浓度和最终体积值。总共将制备16个样品，包括每种处理的重复样本。因此，需要总共3.6毫升、浓度为每毫升5×10⁶个细胞的悬浮液。

细胞计数器将根据活细胞计数和输入的目标值报告所需的细胞悬液体积。如果使用了TRIAM蓝，计数器将自动校正所用的一比一稀释比例。现在在通风橱中，将计算出的细胞悬液体积转移至一个新的离心管中。

然后离心细胞混合物以沉淀细胞，同时准备用于电穿孔的微量离心管，向每根管中加入SIR A。本实验中，将制备一组对照siRNA、两组STAT6特异性siRNA以及未转染的对照组。离心结束后，弃去PBS，将细胞重悬于3.6毫升Gene Pulser电穿孔缓冲液中，取800微升等分试样加入含有相应siRNA的管中，并轻轻混匀。

细胞现已准备好进行电穿孔，可同时处理所有样品。使用 MXL 电穿孔系统，将每种细胞悬液各 150 微升转移至 96 孔电穿孔板的相应孔中。随后，将该板放入 MXL 电穿孔系统的板腔内，并盖上盖子。

选择所需的电穿孔程序，按下脉冲键。电穿孔完成后，将培养板从仪器中取出，并将细胞转移至含有预热培养基的新组织培养板中。接着，将每份样品的150微升未处理对照细胞转移至新培养皿中。然后将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中过夜培养。

24小时后，使用IL-4诱导其中一组细胞的基因转录，另一组细胞仅添加培养基。向细胞中加入IL-4，在37°C和5%二氧化碳条件下继续培养24小时，细胞总培养时间为48小时。

如果实验处理影响了细胞分裂，细胞密度可能会存在较大差异。因此，根据细胞计数结果，使用 TC 10 全自动细胞计数仪快速重新计数细胞是一个很好的做法。从每个孔中转移一份等分试样至微量离心管中用于 RNA 提取，并进行冷冻。

用于蛋白质印迹或其他蛋白质分析的第二份等分试样。今天仅展示RNA实验流程。离心样品以沉淀细胞。

然后从每根试管中移除并弃去上清液。使用全血总RNA试剂盒进行RNA提取。RNA提取完成后，立即进行分析，并将样品置于冰上保存。

为一步验证RNA的质量和数量，使用Experian自动化电泳工作站对样本及Experian RNA Ladder进行热变性处理，随后置于冰上。将预制的凝胶与染料混合物加入RNA芯片的上样孔中，并在上样站设置相应的上样程序代码。

将芯片放入自动预处理工作站中，然后按下启动按钮。从预处理工作站中取出芯片并进行加载。涡旋震荡芯片以混合样品与上样缓冲液。

将芯片放入电泳仪中并开始运行。Experian 软件将自动以电泳图谱的形式显示结果，包括一个显示 RNA 浓度、核糖体比值和 RNA 质量指示数值的结果表格，以及一个类似于传统 RNA 琼脂糖凝胶的虚拟凝胶图。高质量的总 RNA 样本其 RQI 值通常在 8 到 10 之间。

在确认RNA质量后，开始准备cDNA反应。使用IScript ONE-Step RT-PCR试剂盒可将cDNA合成与实时PCR结合进行。在单个反应中，为每对引物配制一个主混合液，其中包含除RNA模板外的所有反应组分。

然后将混合液分配至PCR板的各孔中。将RNA稀释至相同浓度后，将样品加入相应的孔中，并设置三个复孔。密封PCR板，放入实时PCR仪中，选择合适的程序并开始运行。运行结束后，利用实时扩增曲线确定基因表达水平。

该软件根据处理组和对照组细胞中实验基因与参考基因的相对表达水平，从数据中计算标准化基因表达。此图展示了IL-4信号通路的概览：IL-4与其受体结合，导致STAT6的二聚化和激活；活化的STAT6转位至细胞核，启动其靶基因的转录。

例如 CCL17 基因，在无 IL-4 诱导的情况下，CCL17 的转录在通过 siRNA 介导沉默 STAT6 基因后将保持在较低的组成型水平。使用 IL-4 处理后，CCL17 的表达应几乎不增加或无明显增加。在不同条件下，通过定量实时 PCR 检测 IL-4 对 CCL17 的诱导作用。

未用IL-4培养的PCR样本表现出较低的基础表达水平。无论siR如何，以绿色和蓝色显示的对照样本在IL-4处理后正常响应，CCL17表达上调8至10倍。然而，转染靶向STAT6的siRNA（以红色和粉色显示）的细胞在IL-4刺激下CCL17表达降低，支持STAT6在IL-4诱导CCL17表达中发挥作用的观点。

我们刚刚向您展示了如何将siRNA转染到难以转染的悬浮细胞系中，以及如何在这些细胞中检测基因表达。进行此操作时，重要的是要确保所有样品之间的条件尽可能保持一致。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。