使用自动细胞计数器简化基因表达研究:在Namalwa细胞的IL - 4依赖的基因表达的siRNA击倒

该程序的总体目标是使用电穿孔将 siRNA 引入难以转染的细胞中，以研究基因表达。首先使用 TC 10 确定所需的 awa 细胞悬液量即可完成。然后将自动细胞计数器 irna 添加到细胞悬液中，并电生成细胞。

使用 MXL 电穿孔系统，细胞在电穿孔后孵育 24 小时。然后添加 IL 4 以诱导实验细胞中的基因转录。最后，提取 RNA，并使用实时 PCR 测量基因表达水平。

最终，可以获得显示特异性 siRNA 对基因表达通路影响的结果。大家好，我是 Bio Rad Laboratories 基因表达部门的高级科学家 Adam McCoy。今天，我们将向您展示通过电穿孔将 RNA 引入难以转染的细胞系中的程序，然后研究对基因表达的影响。

我们在实验室中使用该程序来分析单个基因的基因表达或通过敲除一个基因并寻找下游效应来研究基因通路。那么让我们开始吧。在细胞培养罩下工作，从培养瓶中取出细胞。

该方案中使用的细胞是悬浮细胞。如果您使用的是贴壁细胞，则需要在去除它们之前对眼睛进行胰蛋白酶分析。离心细胞以使其沉淀。

细胞离心后，去除上清液并将细胞重悬于 PBS 中。为了确定活细胞的数量，取细胞悬液的等分试样，并以 1 比 1 的比例加入 trian blue 染色剂以对死细胞进行染色。活死细胞评估需要 Trian 蓝，但总细胞计数不需要。

只需将混合物挤到一次性计数玻片的开口处，然后将其插入 TC 10 自动细胞计数仪中。TC 10 将首先自动对焦以确保最准确的计数，然后我们将开始计数细胞。显示样品中每毫升的活细胞数和总细胞数。

选择 view image 以在视图屏幕上显示单元格。然后使用向上或向下箭头。根据需要放大或缩小要计算实验所需的细胞悬液量，请选择稀释计算器。

输入此实验所需的浓度和最终体积值。总共将准备 16 个样品，包括每个处理的重复样品。因此，每毫升悬浮液总共需要 3.6 毫升 6 个细胞的 5 乘以 10 倍。

然后，细胞计数仪将根据活细胞计数和输入的目标值报告所需的细胞悬液体积。如果使用 TRIAM blue，计数器将自动调整所使用的 1：1 稀释度。现在在引擎盖下，将计算出的细胞悬液体积转移到新管中。

然后在细胞旋转时旋转细胞混合物以沉淀细胞。通过向每个管中加入 SIR A 来准备用于电穿孔的微量离心管。对于本实验，将制备一个对照 irna、两个 stat 6 个特异性 siRNA 和未切除的对照：离心后，去除 PBS 并将细胞重悬于 3.6 毫升基因 Pulser 电穿孔缓冲液中，将 800 微升等分试样转移到含有适当 IRNA 的试管中并轻轻混合。

细胞现在已准备好进行电穿孔，以同时吃掉所有样品。使用 MXL 电穿孔系统，将 150 μL 每个细胞悬液转移到 96 孔电穿孔板的相应孔中。接下来，将板放入 MXL 电穿孔系统的板室中并盖上盖子。

选择所需的电穿孔方案，并在电穿孔完成后按下脉冲以吃掉细胞，从仪器中取出板并将细胞转移到含有预热培养基的新组织培养板中。接下来，将每个样品的 150 μL 非额定对照细胞转移到新培养皿中。然后将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳下过夜。

24 小时后，使用 IL 4 在一组细胞中诱导基因转录，并仅向第二组细胞中加入培养基。将 1 IL 4 添加到细胞中。总共生长 48 小时后，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下再孵育 24 小时。

如果实验性治疗影响细胞分裂，则细胞密度可能存在很大差异。因此，最好使用 TC 10 自动细胞计数仪根据细胞计数再次快速计数细胞。将一份等分试样从每个孔中转移到微量离心管中，用于 RNA 提取和冷冻。

用于 western blotting 或其他蛋白质分析的第二份等分试样。今天将仅显示 RNA 工作流程。离心样品以沉淀细胞。

然后从每个试管中取出并丢弃 SUP natin。使用 orum 总 RNA 试剂盒进行 RNA 提取。提取 RNA 后，立即进行分析，将样品保存在冰上。

为了一步验证 RNA 的质量和数量，使用 Experian 自动电泳站对样品和 Experian RNA 分子量标准进行热变性，并置于冰上。将准备好的凝胶和染色剂混合物添加到引物中。在 RNA 芯片上，将引物代码设置在引物站上。

将芯片放入自动灌注站，然后按开始。从启动站中取出芯片并加载芯片。涡旋芯片以将样品与上样缓冲液混合。

将芯片放入电泳站并开始运行。Experian 软件将自动以电泳图、显示 RNA 浓度核糖体比率的结果表、RNA 质量指标编号和虚拟凝胶的形式显示结果，其外观类似于传统的 RNA 凝胶。高质量总 RNA 样品的 RQI 通常为 8 至 10。

验证 RNA 质量后，在此处准备 CD NA 反应。IS 脚本一步 R-T-P-C-R 混合物用于结合 CD NA 合成和实时 PCR。在一个反应中，制备包含每个引物组别的 RNA 模板之外的所有反应组分的预混液。

然后将混合物分配到 PCR 板的孔中。将 RNA 稀释至均匀浓度后，将样品加入适当的孔中，一式三份。密封板，将其放入实时荧光定量 PCR 机器中，然后选择合适的方案并在运行完成后开始运行，使用实时轨迹确定表达水平。

该软件根据处理细胞和对照细胞中实验基因和内参基因的相对表达，从数据中计算标准化基因表达。该图显示了 IL 4 与其受体结合的 IL 4 信号通路的概述。导致 STAT six 的分类化和激活，激活的 STAT six 易位到细胞核并激活其靶标的转录。

在 irna 介导的 STAT six 基因沉默后，CCL 17 等基因（如没有 IL 4 诱导转录的 CCL 17）将保持在低组成型水平。用 IL 4 处理应导致 CCL 17 表达很少或没有增加。在不同条件下通过定量实时测量 IL 4 对 CCL 17 的诱导。

在没有 IL 4 的情况下生长的 PCR 样品具有低组成型表达水平。无论 sir 如何，如绿色和蓝色对照样品所示，递送的 A 对 IL 4 治疗反应正常，CCL 17 诱导为 8 至 10 倍。然而，转染靶向 STAT 6 的 siRNA 的细胞（以红色和粉红色显示）响应 IL 4 后 CCL L 17 表达减少，这支持 STAT six 在 IL 4 诱导的 CCL 17 表达中发挥作用的观点。

我们刚刚向您展示了如何将 siRNA 插入难转染的悬浮细胞系中，以及如何跟踪这些细胞中的基因表达。执行此程序时，请务必记住在所有样品中保持一致。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。