Name: 重组纤维素酶Cel5A从表达里氏木霉在烟草 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 了解在烟草植物中瞬时表达真菌纤维素酶TrCel5A的方法，用于植物生物技术研究。通过荧光融合蛋白监测表达，并利用Western印迹和底物降解实验表征酶活性，为植物生物质转化提供新思路。

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本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）研究倡议项目“生物能源2021——生物质利用研究”以及“来自生物质的定制燃料”卓越集群资助，后者通过德国联邦和州政府的卓越计划资助，旨在促进德国大学的科学研究。

1. 野生型N. tabacum&#160;植株的培养
<ol>
	<li>培养 N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 植株的土壤培养：将烟草种子置于装有常规盆栽土的适当花盆中以促进萌发。2 周后，将幼苗移栽至单独的花盆中。在温室中培养植株，保持恒定环境条件：黑暗期 22 °C，光照期 25 °C，相对空气湿度 70%。光照周期设为 16 小时光照 / 8 小时黑暗&#160;hr 光照/黑暗循环（例如 飞利浦 IP65 400 W 灯；180 μmol·sec⁻¹·m⁻²-1·m-2；λ = 400–700 nm）以及水，每天一次。</li>
</ol>
2. TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 蛋白的瞬时表达
<ol>
	<li>在无菌条件下，挑取单个菌落 Agarobacterium tumefaciens (GV3101::pMP90RK GmR, KmR, RifR) 菌株，分别含有 pTRAkc-ER-TrCel5A 或 pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry，转移至含有 10 ml 液体培养基的三角烧瓶中&#160;酵母提取物肉汤（YEB，按制造商说明配制）培养基，以及用于筛选的卡那霉素（50 mg/ml）、利福平（50 mg/ml）和羧苄青霉素（100 mg/ml）。在26 °C、180 rpm条件下培养36–40小时。注意：蛋白表达用适当载体的设计不在本文范围之内，但可参考Maclean等人的方法作为指导。 等.13 和 Munro 与 Pellham14 可遵循该流程进行载体构建设计。</li>
	<li>取 200 µl&#160;每种培养物接种20 ml&#160;在含有上述抗生素浓度的YEB培养基中培养，并在与之前相同的条件下孵育。</li>
	<li>36–40 小时后，通过加入 2 µl 进行预诱导培养&#160;乙酰丁香酮（终浓度 200 µM），100 µl&#160;40% (w/v) 葡萄糖溶液和 200 µl&#160;1 M MES 缓冲液（pH 5.6）中，过夜孵育。</li>
	<li>准备 100 ml&#160;2×浸润缓冲液（100 g/L蔗糖，3.6 g/L葡萄糖，8.6 g/L Murashige和Skoog基础盐，用氢氧化钾调节pH至5.6）</li>
	<li>测量 OD600 用1:5的比例稀释培养物，直至其OD值达到600 5-6。计算获得30 ml所需的培养液体积&#160;OD下的浸润培养基600加入15 ml&#160;加入2倍体积的渗透缓冲液，然后加入去离子H2O，加缓冲液至30 ml。</li>
	<li>从温室中取出植物，使用移液器吸头在第3片叶的远轴面划出小切口rd 至 5th 从顶部叶片开始，以利于渗透。</li>
	<li>使用移液器吸头在叶片的远轴面划出小切口，以促进渗透。</li>
	<li>用浸润介质填充注射器，将注射器（不带针头）置于先前制作的切口之一上，用手指在叶片近轴面支撑注射器。小心地将介质压入叶脉间区域的组织中。注意：浸润后，将植株置于温室中培养，条件与上述描述相同。同时，在相同条件下设置相同比例的未处理、非瞬时表达植株（NTEPs）作为对照。</li>
</ol>
3. 植物叶片中 TrCel5A-mCherry 表达的评估
<ol>
	<li>接种含有携带 pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry 质粒的农杆菌（A. tumefaciens）后 4–6 天，将植株从温室中取出，置于暗室中进行荧光分析。</li>
	<li>为观察表达 TrCel5A-mCherry 的叶片组织中的荧光，使用发射波长为 515&#160;nm 的便携式绿光光源照射植株，并配合红光滤光片（620–750&#160;nm）。注意：可通过振动切片机对叶片进行薄切片，并在明场和荧光显微镜下观察，从而对植物叶片中蛋白的表达进行深入表征。具体操作步骤如下：
	<ol>
		<li>从已接种的叶片上切取约 5 × 5 mm 的小片组织，将其包埋于溶于 50 mM 磷酸缓冲液（pH 5.7）的 4% 琼脂糖中。</li>
		<li>使用振动切片机从包埋的叶片中切下 80–90 µm 厚的切片，将切片置于显微镜载玻片上，加入缓冲液或加盖盖玻片，然后在显微镜下以 10X&#160;倍放大倍数结合荧光检测器进行观察，激发光波长和滤光片参数同上所述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从烟草叶片中提取 TrCel5A
<ol>
	<li>从植株上剪取烟草叶片，每份约重 1 g&#160;感染了 A. tumefaciens 加入 pTRAkc-ER-TrCel5A 并置于经液氮预冷的研钵中。向样品中加入适量液氮，用预冷的研杵将叶片研磨成粉末。</li>
	<li>加入 2 ml&#160;加入含有1 mM苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液（PBS）至研磨后的叶片材料中，混匀直至大部分叶片物质呈悬浮状态。4 °C下以15,000 × g离心20分钟，收集含蛋白的上清液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心提取物 20 分钟，小心吸取含有蛋白质的上清液，避免扰动沉淀。弃去沉淀。</li>
	<li>通过将含蛋白质的上清液在 55 °C 下孵育 10 分钟，对 TrCel5A 进行部分纯化。室温下静置 10 分钟后，在 15,000 x&#160;4 °C下孵育10分钟。对未浸润的植物重复上述部分纯化步骤，以获得对照样品。将这些样品用于后续所有实验。注意：蛋白溶液可在4 °C保存最多1周，或在-20 °C保存最多3个月。</li>
	<li>对未浸润的植物重复部分纯化过程，以获得对照样品。将这些样品用于后续所有实验。注意：蛋白质溶液可在4 °C下保存最多1周，或在-20 °C下保存最多3个月。</li>
</ol>
5. TrCel5A-mCherry 的 SDS-PAGE、Western 印迹及 Azo-CMC 酶谱分析
<ol>
	<li>根据既定方法购买或制备12%（w/v）SDS-PAGE凝胶15.</li>
	<li>溶解CMC&#160;在水中配制成1.5%（w/v）的溶液。制备CMC-SDS-PAGE凝胶时，用1 ml替代&#160;1.5% CMC 溶液，每 1 ml&#160;10 ml 水&#160;SDS-PAGE 凝胶混合液，最终配制成含 0.1% (w/v) CMC 和 12% (w/v) SDS-PAGE 的凝胶混合液。按常规方法倒入凝胶。注意：在配制凝胶溶液前，务必通过搅拌并加热至 40 °C 的方式，确保原始溶液中的 CMC 完全溶解（在配制凝胶溶液前需再次重复此步骤）。</li>
	<li>在 SDS 存在下通过煮沸使样品变性，具体操作参照既定方法12. 作为阳性对照，使用市售纤维素酶混合物，按1:500稀释 T. reesei，例如 T. reesei ATCC 26921。作为阴性对照，使用来自未浸润叶片的类似制备的蛋白质溶液（NTEPs）。</li>
	<li>按照常规方案进行电泳操作15, 例如&#160;使用200 V电泳约50分钟，当染料前沿迁移至凝胶底部时停止电泳。</li>
	<li>使用0.1%（w/v）考马斯亮蓝对一块SDS-PAGE凝胶进行染色，并用甲醇/冰乙酸混合液进行脱色。注意：可通过轻微加热染色液和脱色液以实现快速染色和脱色。 即 使用微波炉加热约15秒，使染色液和脱色液依次温热（但不沸腾），脱色10分钟后或溶液冷却后更换脱色液，并更换新的脱色液重复进行。</li>
	<li>使用既定方案对一个SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹（Western blotting）16,17使用以下抗体：一种针对a的兔多克隆抗体&#160;His标签（一抗）和与碱性磷酸酶偶联的多克隆山羊抗兔抗体Fc区（二抗）。注意：应选择能够通过氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3′-吲哚磷酸对甲苯胺盐（NBT/BCIP）显色的二抗，具体方法如所述18.</li>
	<li>在室温下，将0.15%（w/v）CMC SDS-PAGE凝胶置于含1.5%（w/v）β-环糊精和20 mM磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 6.5）的溶液中，轻轻振荡孵育15分钟，进行凝胶内蛋白质复性。19.</li>
	<li>弃去β-环糊精溶液，用H短暂洗涤凝胶2O. 在50 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.8）中室温孵育额外15分钟。将复性后的含0.15%羧甲基纤维素（CMC）的SDS-PAGE凝胶置于30 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.8）中，于50 °C孵育20分钟，进行CMC酶谱分析。</li>
	<li>使用重折叠的0.15%（w/v）CMC SDS-PAGE凝胶进行CMC酶谱分析，将凝胶置于30 mM醋酸钠缓冲液中孵育&#160;（pH 4.8）下 50 °C 反应 20 分钟。</li>
	<li>将凝胶染色10分钟&#160;使用0.1%（w/v）刚果红溶液染色10分钟，然后用1 M NaCl脱色30分钟或直至观察到清晰条带。用0.3%（v/v）乙酸洗涤凝胶以获得更清晰的成像效果。</li>
</ol>
6. TrCel5A 的 4-MUC 活性测定
<ol>
	<li>配制10 mM 4-MUC的储备液，溶剂为50% (v/v) 甲醇，避光保存于室温。</li>
	<li>在进行检测前立即配制4-MUC工作液（2×浓度），其中含1 mM 4-MUC和60 mM醋酸钠，pH 4.8。</li>
	<li>对以下样品进行检测：分别含有100 μl叶片蛋白（诱导或不诱导表达TrCel5A）、100 μl商业来源的里氏木霉（T. reesei）纤维素酶混合物（1:1,000稀释）以及纯H2O的样品。每个样品设三个重复。</li>
	<li>将100 μl 4-MUC工作液加入96孔板的不同孔中，然后向每孔加入100 μl相应样品。</li>
	<li>使用荧光光谱法测定4-MU荧光的0分钟时间点，激发波长为360 nm，发射波长为465 nm。</li>
	<li>将96孔板在50 °C孵育20分钟，加盖密封膜以防止蒸发。通过冷冻终止反应（或在另一块96孔板中将100 μl 0.15 M甘氨酸缓冲液（pH 10.0）与100 μl样品混合以终止反应）&#160;。</li>
	<li>使用荧光光谱法测定4-MU荧光的终点值（20分钟），激发波长为360 nm，发射波长为465 nm。用终点（20分钟）荧光值减去0分钟荧光值，得到荧光变化量。</li>
</ol>
7. TrCel5A 的偶氮-羧甲基纤维素活性测定
<ol>
	<li>配制1.5%（w/v）Azo-CMC储备液，于室温保存；另配制沉淀溶液，含18 mM乙酸锌、0.5 M乙酸钠（pH 5）和80%乙醇（v/v），室温保存。</li>
	<li>在进行检测前立即配制Azo-CMC 2倍工作液，成分为1%（w/v）Azo-CMC（溶于H2O）和60 mM乙酸钠（pH 4.8）。</li>
	<li>在1.5 ml&#160;离心管中加入50 μl样品和50 μl工作液。</li>
	<li>检测样品包括：含50 μl叶片蛋白（瞬时表达TrCel5A或未表达）的样品；100 μl来自T. reesei的商品化纤维素酶混合物（1:1,000稀释）；以及纯H2O。所有样品和标准品均设三个重复。</li>
	<li>50 °C孵育20分钟。加入250 μl沉淀溶液终止反应，每管剧烈涡旋振荡10秒，确保溶液充分混匀。</li>
	<li>室温孵育10分钟后再次涡旋振荡。以1,000 × g离心10分钟，小心吸取200 μl&#160;上清液转移至96孔板，避免扰动沉淀。</li>
	<li>在590 nm波长下使用吸光度光谱法进行检测。</li>
</ol>
8. TrCel5A 的 PAHBAH 测定
<ol>
	<li>使用打孔器从滤纸上切下一个圆形（直径约5.5 mm）。加入100 μl&#160;60 mM NaAc，pH 4.8，以及 100 μl&#160;样品，包含叶蛋白（可诱导表达或不表达TrCel5A）或商用 T. reesei 纤维素酶混合物按1:1,000稀释，与滤纸圆片在50 °C、300 rpm振荡条件下孵育20小时。每个含滤纸孵育的样品均需设置一个不含滤纸的平行溶液作为单独的样品对照。</li>
	<li>配制 330 mM p-羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）溶液A：将PAHBAH溶解于H中2O，加入5 ml&#160;浓盐酸，加至总体积 100 ml&#160;溶液，并在室温下保存。注意：将盐酸加入较少量的PAHBAH浆液中可获得最佳效果， 即 30 ml，于一定温度下搅拌以促进溶解，再定容至 100 ml&#160;与 H2O.</li>
	<li>配制含有50 mM柠檬酸钠、10 mM氯化钙和500 mM NaOH的PAHBAH溶液B&#160;储存&#160;室温下</li>
	<li>在进行检测前立即配制1 ml的1.5倍工作液&#160;将PAHBAH试剂加入9 ml&#160;缓冲液，置于冰上保存直至使用（4小时内使用完毕）。</li>
	<li>在耐热的 0.2 或 0.5 ml 离心管中制备样品&#160;离心管。将5 μl每种与滤纸孵育后的溶液（步骤8.1）与45 μl H2O 和 100 μl PAHBAH 工作溶液。样品对照（未加入滤纸孵育的样品）应使用相同浓度进行操作（5 μl 样品，45 μl H2O，100 μl PAHBAH 工作溶液）。同时检测5种标准品（5 μl），其中葡萄糖浓度范围为0至0.2 g/L，以及纯H2O. 样品和标准品均设三个重复孔进行检测。</li>
	<li>将样品在100 °C下准确孵育10分钟，随后在室温下准确冷却10分钟。用移液器将溶液转移至96孔板中，在410 nm波长下进行分光光度测定。从样品中减去各自的对照样本（未加滤纸孵育）的数值，以获得最终结果。</li>
</ol>

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<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于人们希望开发出更高效的生物燃料生产系统，纤维素酶的重组表达成为一个备受关注的研究领域1。植物为成功生产纤维素酶提供了多种可能性，其具备经济的收获技术和自水解方法等特性，非常适合大规模生物燃料生产。此外，利用不同的蛋白质定位策略可在需要时实现翻译后修饰20。虽然通过改造植物实现纤维素酶的组成型表达具有明显优势，但该方法耗时较长，且成功率不确定。诸如蛋白质区隔化和诱导型表达等技术可提高在植物中成功生产纤维素酶的可能性，但这些方法仍需数月时间才能建立。本文展示了瞬时表达方法，以说明在数天之内即可利用植物系统生产特定纤维素酶的潜力。

此处使用与荧光蛋白 mCherry 的融合来验证瞬时蛋白表达方法的成功。TrCel5A-mCherry 明显分布于已浸润含载体的绝大多数叶片中 农杆菌. 定位于内质网可实现表达蛋白的翻译后修饰。表达系统能否实现这一能力 例如&#160;糖基化对于这些纤维素酶尤为重要&#160;最初来源于真菌类生物体，例如 T. ...

木质纤维素生物质的降解及其转化为液体燃料被视为减少对化石燃料依赖的一种方法。建立经济可行的生物质处理系统面临的一个重要障碍是纤维素和半纤维素的酶解降解1。植物表达系统在工业规模酶的生产方面展现出巨大潜力。用于经济、大规模收获植物的农业系统早已建立，并已有数千年历史。在植物中生产纤维素酶具有诸多优势，例如易于实现自水解2，以及通过提高植物细胞壁的可消化性，最大限度地利用较低水平的酶1。最后，植物系统能够将重组蛋白靶向至植物细胞的特定区域，并在需要时对酶进行翻译后修饰3。

Nicotiana tabacum （烟草）由于其生长迅速和生物量积累快的特点，常被用作植物中异源蛋白表达研究的模式生物4瞬时表达重组蛋白是一种能够在短时间内实现蛋白质生产的实验技术。5，同时保持所选蛋白质的定位灵活性，从而实现翻译后修饰的多样性 即 纤维素酶。这不仅能够实现纤维素酶的生产以用于基础分析，同时也为在植物中进一步开展表达策略奠定了基础。利用这种瞬时表达策略，可从真菌宿主中获得属于糖苷水解酶家族5的内切葡聚糖酶Cel5A。 Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina)6 产生（下文简称 TrCel5A）。TrCel5A 是一种天然糖基化的 42 kDa 蛋白，在水解纤维素链方面具有高活性7.

此处描述的瞬时表达技术基于一种相对常用的系统，即通过浸润植物叶片进行 农杆菌 在合适的表达载体中携带目的基因。以实现对成功转化的快速分析 在植株中 表达，TrCel5A 也可与 mCherry 融合表达为融合蛋白，mCherry 是一种最初来源于 Discosoma sp. 蛋白 DsRed8，C末端融合了六个额外的组氨酸残基（His标签）（TrCel5A-mCherry）。因此，可通过绿色光照射观察mCherry的分布，从而在植株生长过程中监测异源融合蛋白TrCel5A-mCherry的表达。如有需要，可对植物材料进行切片，并在显微镜下用绿色光观察，以确定该蛋白的特异性定位。本研究中，载体构建时包含了信号肽和转运肽序列，以引导异源蛋白向内质网的定向转运与分泌9.

为了分析植物表达的纤维素酶（包括 TrCel5A）的活性，可进行多种纤维素酶活性检测。在提取植物总可溶性蛋白后，可采用热孵育技术对 TrCel5A 进行部分纯化。通过 SDS-PAGE 并结合 Western 印迹法确定蛋白质的分子量。可利用酶谱法分析其对底物的酶活性。 例如 经过羧甲基化处理的纤维素（生成羧甲基纤维素：CMC），以提高其溶解性10纤维素酶和葡萄糖苷酶活性可通过与β-D-纤维二糖苷结合的荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）进行检测（二者合称4-MUC）。另一种评估内切葡聚糖酶活性的方法涉及对羧甲基纤维素（CMC）进行分光光度分析。&#160;与偶氮染料（Remazol Brilliant Blue R）相连11此外，可通过糖分析检测方法（如 p对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）测定12这些技术可用于阐明和定量分析目标表达纤维素酶的活性。

<table><tbody><tr><td>4-甲基伞形基 &amp;beta;-D-纤维二糖苷</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮（浓缩液）</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>抗生素 - 卡那霉素</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>抗生素 - 利福平</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>抗生素 - 羧苄西林</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - 兔抗 His(6) 多克隆抗体</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - 山羊抗兔碱性磷酸酶，FC多克隆抗体</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>偶氮-羧甲基纤维素</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-环糊精</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>来自的纤维素酶 &lt;em&gt;Trichoderma reesei&lt;/em&gt; ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>刚果红</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>滤纸 - Rotilabo 印迹纸</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES缓冲液</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>土壤，Einheitserde classic&amp;nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光谱仪 - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基苯甲酰肼&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>紫外光源 - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在烟草植物中表达来自trichoderma reesei的重组纤维素酶cel5a

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

纤维素降解酶（纤维素酶）是科研与工业领域共同关注的目标。由于这类酶大多存在于难以培养的生物体中，例如形成菌丝的真菌和厌氧细菌，因此推动了重组技术在该领域的应用。植物表达系统是大规模生产酶及其他具有工业价值蛋白质的理想体系。本文展示了在烟草（ Nicotiana tabacum ）中瞬时表达丝状真菌 Trichoderma reesei Cel5A内切葡聚糖酶的方法。通过mCherry-酶融合蛋白的荧光检测，证实了蛋白质的成功表达。此外，还采用一系列基础实验检测瞬时表达的 T. reesei Cel5A酶活性，包括SDS-PAGE、Western印迹、酶谱分析，以及&#160;基于荧光和染料标记底物的降解活性检测。本文所述系统可在短时间内获得具有活性的纤维素酶，从而评估其通过组成型或诱导型表达系统在植物中进一步规模化生产的潜力。

利用瞬时表达系统，TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 在烟草植株中成功表达（图1A 和 图1B）。对 TrCel5A-mCherry 融合蛋白表达模式的观察显示，健康叶片中蛋白表达广泛（图1C），在绿光下可见明显的荧光信号（图1D）。
从表达瞬时TrCel5A蛋白的烟草植株叶片中提取总可溶性蛋白，SDS-PAGE结果显示存在多种蛋白（图2A，第1道）。将表达TrCel5A植株的总可溶性蛋白样品与来自NTEPs的总可溶性蛋白样品分别在55 °C下孵育10分钟。TrCel5A在55 °C时仍保持稳定且具有活性，而许多其他（天然烟草）蛋白在此温度下不稳定。因此，该处理使许多非必需蛋白发生沉淀，从而获得部分纯化的TrCel5A样品。经过这一热沉淀步骤后，在约40 kDa处观察到一条明显的蛋白条带（图2A，第1道）。该条带很可能是TrCel5A的催化结构域（CD），此前已有研...

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶 TrCel5A。可通过荧光融合蛋白监测其表达，并在表达后对蛋白活性进行表征。

在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

降解纤维素的酶类，即纤维素酶，是科研与工业领域共同关注的研究对象。这些酶在难以培养的...

以下实验的总体目标是在烟草中瞬时表达目标蛋白，以在较短时间内评估基于植物的酶表达的可行性。这种瞬时表达是通过将含有目的基因的农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）浸润烟草叶片来实现的。第二步是在培养后收获浸润的植物叶片，并对蛋白提取物进行部分纯化，以获得可用的酶溶液。随后进行蛋白质分析，以评估基于植物表达对酶的影响，并验证其酶活性。通过 Western 印迹、zy 以及底物降解实验，获得的结果可显示蛋白质大小、可能的糖基化效应及酶活性。该方法有助于解答有关植物生物质转化的关键问题，同时也能提供瞬时表达于烟草中后酶活性的相关信息。本方法的可视化演示至关重要，因为浸润步骤较难掌握，叶片易被注射器、抹布等物品损伤，且实验将在无菌条件下进行。将农杆菌的单菌落转移至含有10毫升添加抗生素的酵母提取物肉汤的三角烧瓶中。然后在26°C、180 RPM振荡条件下培养接种后的肉汤36至40小时。接着，将每种菌液200 µL接种到20毫升含有相同抗生素的酵母提取物肉汤中，并在相同条件下继续培养36至40小时。向培养物中加入两微升苯乙酮、100 微升 40% 葡萄糖溶液和 200 微升 pH 5.6 的 1 摩尔 MES 缓冲液进行诱导，并继续过夜培养。现在从温室中取出植株，用移液器吸头在植株顶端第三至第五片叶的 AB 轴侧面轻轻划伤，以利于渗透。然后用渗透培养基填充注射器，并将其置于先前制作的其中一个切口处。用手指支撑住针筒的轴向叶侧，并小心地将培养基注入叶片的静脉内区域。为了观察表达TR细胞5:00 AM樱桃荧光蛋白的叶片部分的荧光，需使用发射绿光的便携式光源照射植株。通过红色滤光片观察时，TR细胞5:00 AM樱桃的荧光将清晰可见。为了提取表达的蛋白质，选择已用含有P track ERTR细胞五A的AUM侵染的烟草叶片，并将其切成每片一克的小块。接着，将叶片放入预冷的研钵中，并向样品中加入适量液氮。用研杵将叶片研磨成粉末状。使用未侵染的烟草叶片重复该过程，以获得对照样品。然后向研磨后的叶片材料中加入含有1毫摩尔苯甲基磺酰氟的2毫升PBS缓冲液，混匀直至大部分叶片材料呈悬浮状态。将提取物在4摄氏度下以15,000 ×g离心20分钟。然后弃去沉淀，通过在55摄氏度下孵育含有S natin的蛋白10分钟，对TR细胞五A进行部分纯化，并在室温下静置10分钟。随后将SNAT在室温下以15,000 ×g离心10分钟。弃去沉淀，将含有蛋白的上清液snat用于后续所有实验。其他检测。对未侵染的植物也进行部分纯化处理，以获得对照样品。在此步骤中，将乙基纤维素与水混合，配制成1.5%的溶液，并在搅拌条件下孵育至完全溶解。在10毫升SDS聚丙烯酰胺凝胶配制液中，用1毫升1.5%羧甲基纤维素（CMC）替代1毫升水，以制备A-C-M-C-S-D-S凝胶，然后按常规方法灌胶。接下来，在SDS存在条件下将样品煮沸以使其变性。在200伏电压下电泳50分钟，直至染料前沿迁移至凝胶底部。随后在0.15% C-M-C-S-D-S聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白原位复性。使用 pH 6.5 的 20 毫摩尔磷酸柠檬酸缓冲液配制 1.5% β-环糊精溶液。将凝胶置于该溶液中，在室温下轻轻振荡孵育 15 分钟。弃去 β-环糊精溶液，用室温水短暂洗涤凝胶，随后在 pH 4.8 的 50 毫摩尔醋酸钠缓冲液中室温孵育 15 分钟。然后，将复性后的15% C-M-C-S-D-S聚丙烯酰胺凝胶置于30毫摩尔/升醋酸钠缓冲液中，在50摄氏度下孵育20分钟，进行CMC酶解。为观察CMC降解的位置，使用0.1%刚果红溶液染色10分钟，随后用1摩尔/升氯化钠溶液脱色30分钟，或直至出现清晰条带为止；最后用0.3%乙酸溶液洗涤凝胶。为获得更清晰的成像效果，在进行检测前立即配制4 MUC的2倍工作液，将100微升4 MUC工作液分别加入96孔板的不同孔中。然后，将每种样品各100微升加入相应的孔中，每个样品设三个复孔，使用360纳米的激发波长和465纳米的发射波长进行检测。通过荧光光谱法测定四甲基伞形酮（four mu fluorescence）在零分钟时的荧光值。接着，将加样后的酶标板用粘性盖密封，在50摄氏度下孵育20分钟。随后，通过冷冻终止反应。然后，使用与零分钟时间点相同的参数测定终点微荧光。将20分钟时的荧光值减去零分钟时的荧光值，以确定在开始检测前由酶活性引起的荧光变化。配制 A-O-C-M-C 两倍工作液。然后在 1.5 毫升离心管中加入 50 微升样本和 50 微升工作液。接着，将样本在 50 摄氏度下孵育 20 分钟。加入250微升沉淀液以终止反应。随后，将每个样品剧烈涡旋振荡10秒，以确保样品与沉淀液充分混匀。然后在室温下孵育10分钟，再次涡旋振荡，随后在1000 ×g 离心10分钟。随后，将每个样品中的 200 微升 SNAT 轻柔转移至 96 孔板中，避免扰动沉淀。沉淀中的酶活性通过可溶性染料水平的升高来显示。使用分光光度法在 590 纳米波长处测定该信号。在此步骤中，将滤纸圆片放入1.5或2毫升离心管中。向滤纸圆片加入100 µL 60 mM醋酸钠溶液和100 µL样品，在50 °C、300 rpm振荡条件下孵育20小时。此外，在进行检测前立即设置不加滤纸的单个样品作为对照。配制1.5倍浓度的PABA工作液，包含1毫升PBA溶液A和9毫升PABA溶液B，冰上保存备用。接着，将样品置于0.5毫升耐热管中进行准备。样品由45微升水、5微升与滤纸共同孵育的每种溶液以及100微升PABA工作液组成。随后，运行以相同方式制备的样品对照和五个标准品。然后在100摄氏度下准确孵育样品、对照和标准品10分钟，再于室温下冷却10分钟。用移液器将100微升溶液加入96孔板中，使用分光光度计在410纳米波长下进行检测。用滤纸样品的数值减去各对应样品对照组的数值，以确定释放的还原糖量。以下为展示表达盒以及烟草植株中蛋白表达情况的图片。这是在普通光下以及在绿光下加红色滤光片观察到的经农杆菌浸润的烟草叶片，其中TR细胞5:00 AM樱桃蛋白的表达由红色显示，清晰可见。SDS-PAGE凝胶、Western印迹以及CMC纤维素酶活性染色图显示了T细胞五A蛋白的大小和活性。总可溶性蛋白已通过考马斯亮蓝染色进行分离和可视化；针对T细胞五A蛋白组氨酸标签区域的Western印迹进一步确认了该蛋白的大小，此外，通过刚果红染色的透明圈实验展示了其对CMC的纤维素酶活性。此处可见的是在烟草叶片中瞬时表达TR细胞五A蛋白后，经热沉淀纯化前后的总可溶性蛋白，其中TR细胞五A蛋白为最明显的条带，并且在Western印迹和CMC透明圈图中均可观察到。我们还观察了未经过热沉淀处理的烟草植株中的总可溶性蛋白，以及市售的纤维素酶混合物中的蛋白质。该图显示了TR细胞五号A的酶活性定量结果：将TR细胞五号A与4-MUC、偶氮羧甲基纤维素（Azo-CMC）或滤纸共同孵育，通过检测荧光素4-甲基伞形酮（fluoro four four mu）偶氮染料的释放，或通过测定PBA显色反应中还原糖的生成量来评估底物降解情况。按照此流程，还可采用其他方法，如蛋白质靶向技术，以进一步了解蛋白质定位对酶稳定性和活性的影响。观看本视频后，您现在应已清楚了解如何在烟草中瞬时表达蛋白质，以及掌握一些评估酶活性的方法。用于纤维素生物质转化。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

重组纤维素酶Cel5A从表达<em&gt;里氏木霉</em&gt;在烟草

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高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性 大肠杆菌

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium...

高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌...

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。...

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。...

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关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

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不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。...

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高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

在Nicotiana benthamiana叶片中进行三萜类化合物制备规模的瞬时表达

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。...

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

了解在烟草植物中瞬时表达真菌纤维素酶TrCel5A的方法，用于植物生物技术研究。通过荧光融合蛋白监测表达，并利用Western印迹和底物降解实验表征酶活性，为植物生物质转化提供新思路。

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