重组纤维素酶Cel5A从表达里氏木霉在烟草

以下实验的总体目标是在烟草中瞬时表达靶蛋白，以了解在短时间内植物性酶表达的可行性。这种瞬时表达是通过用农杆菌 tumor fain 菌株浸润烟草叶来实现的，该菌株包含掺入目标基因的载体作为第二步 孵育后收获浸润的植物叶子并部分纯化蛋白质提取物以获得工作酶溶液。接下来进行蛋白质分析，以评估植物表达对酶的影响并验证其酶活性。

根据 western blotting、zy 和底物降解测定获得的结果表明蛋白质大小、可能的糖基化效应和酶活性。这种方法可以帮助回答有关植物生物量转化的关键问题，还可以深入了解酶在烟草中瞬时表达后的活性。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于叶子很容易被注射器 herger 衣服损坏，因此很难学习渗透步骤，我将在无菌条件下进行实验。

将农杆菌的单个菌落转移到含有 10 毫升的锥形瓶中。酵母提取物汤与抗生素。然后将接种的肉汤在 26 摄氏度下以 180 RPM 振荡孵育 36 至 40 小时，然后将每种培养物的 200 微升接种在 20 毫升酵母提取物肉汤中，用与以前相同的抗生素，并在 36 至 40 小时后在相同条件下孵育。

在 pH 值为 5.6 的条件下，用 2 微升苯乙酮、100 微升 40% 葡萄糖溶液和 200 微升一摩尔 MES 缓冲液诱导培养物，并继续孵育过夜。现在从温室中取出植物，用移液管吸头从植物顶部划开第三到第五片叶子的 AB 轴向侧，以方便渗透。然后用渗透介质填充注射器，并将其放在先前制作的缺口之一上。

用手指支撑注射器的 axio 叶侧，然后小心地将培养基注射到静脉叶区。为了可视化表达 TR 细胞的叶切片中的荧光，5：00 AM 樱桃用发射绿光的便携式光源照射植物。通过红色滤光片观察时，来自 TR 细胞 5：00 AM 樱桃的荧光将清晰可见。

为了提取表达的蛋白质，选择已经被含有 P 追踪 ERTR 细胞 5 A 的 AUM 浸润的烟叶，并将它们切成 1 克小块。接下来，将它们放入预冷的研钵中，并向样品中加入适量的液氮。用杵将叶子磨成粉末。

对未浸润的烟叶重复该过程以获得对照样品。然后将含有 1 毫摩尔苯基甲基水氟化物的 2 毫升 PBS 添加到磨碎的叶质中并混合，直到大部分叶质处于悬浮状态。将提取物在 15， 000 GS 下在 4 摄氏度下离心 20 分钟。

然后将含有 S natin 的蛋白质在 55 摄氏度下孵育 10 分钟，丢弃沉淀、部分纯化的 TR 细胞 5 A，并使其在室温下再静置 10 分钟。然后在室温下以 15， 000 GS 离心 SNAT 10 分钟。丢弃沉淀，并使用含有蛋白质的 snat 进行所有。

进一步的分析。还要对未渗透的植物进行部分纯化过程，以获得对照样品。在此程序中，将乙基纤维素和水混合以获得 1.5% 的溶液，并在搅拌下孵育直至溶解。

为了使 A-C-M-C-S-D-S 页面凝胶在 10 毫升 SDS 页面凝胶混合物溶液中用一毫升 1.5% CMC 代替一毫升水，然后正常倒入凝胶，接下来通过在 SDS 存在下煮沸样品来使样品变性。在 200 伏电压下进行电泳 50 分钟，直到染料前沿到达凝胶底部。现在在 15%C-M-C-S-D-S 页面凝胶上进行凝胶蛋白复性。

在 pH 值为 6.5 的 20 毫摩尔磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中使用 1.5% β 环糊精。将凝胶在室温下在此溶液中孵育，轻轻摇动 15 分钟。弃去 β 环糊精溶液，用水在室温下在 pH 值为 4.8 的 50 毫摩尔乙酸钠缓冲液中孵育后短暂洗涤凝胶 15 分钟。

然后，使用重新折叠的点 15% C-M-CS-D-S 页面凝胶，将凝胶在 30 毫摩尔乙酸钠缓冲液中于 50 °C 孵育 20 分钟，进行 CMC zy。为了观察 CMC 降解的位置，使用 0.1% 刚果红溶液对凝胶染色 10 分钟，然后用一摩尔氯化钠将其保留 30 分钟，或者直到最后观察到清晰的条带，用 0.3% 乙酸洗涤凝胶。为了在运行测定之前立即进行更清晰的成像，准备一个 4 个 MUC 2 X 工作溶液，将 100 微升 4 个 MUC 工作溶液移液到 96 孔板的单独孔中。

然后将每个样品的 100 微升加入适当的孔中，使用 360 纳米的激发波长和 465 纳米的发射波长，将每个样品一式三份运行。通过荧光光谱确定 4 μ 荧光的零分钟时间点。接下来，将盖有胶盖的板在 50 摄氏度下孵育 20 分钟。

随后，通过冷冻终止反应。之后，使用与零分钟时间点相同的参数测量终点 mu 荧光。从 20 分钟的荧光值中减去 0 分钟时的荧光值，以确定在运行检测之前由酶活性引起的荧光变化。

准备 A-O-C-M-C 两个 X 工作溶液。然后将 50 μL 样品和 50 μL 工作溶液混合在 1.5 mL试管中。接下来，将样品在 50 摄氏度下孵育 20 分钟。

加入 250 μL 沉淀溶液终止反应。随后，将每个样品剧烈涡旋 10 秒，以确保样品与沉淀溶液完全混合。然后将样品在室温下孵育 10 分钟，再次涡旋，然后以 1000 Gs 离心 10 分钟。

200 微升 SNAT 从每个样品转移到 96 孔板中，而不会干扰。沉淀酶活性由较高水平的溶解染料显示。使用 590 纳米波长的吸收光谱进行测量。

在此步骤中。将一圈滤纸放入 1.5 或 2 毫升的试管中。将 100 微升 60 毫摩尔乙酸钠和 100 微升样品加入滤纸圈中，并在 50 摄氏度下以 300 RPM 振荡孵育 20 小时。

此外，在运行检测之前，立即孵育没有滤纸作为对照的单个样品。制备含有 1 毫升 PBA 溶液 A 和 9 毫升 PABA 溶液的 1.5 x PABA 工作溶液，B.Store 冰上直至使用。接下来，在 0.5 mL 热稳定管中制备样品。

样品由 45 微升水、每种溶液 5 微升与滤纸一起孵育和 100 微升 PABA 工作溶液组成。之后，运行以相同方式制备的样品对照和五个标准品。然后将样品、对照品和标准品在 100 摄氏度下孵育整整 10 分钟，并在室温下再冷却 10 分钟。

100 微升溶液移液到 96 孔板中，用分光光度计以 410 纳米的波长进行测定。从滤纸样品值中减去单个样品对照值，以确定释放的还原糖量。这是一张显示烟草植物中表达盒和蛋白质表达的图像。

这就是在正常光照下和在绿光下使用红色滤光片时浸润的烟叶的显示方式，其中红色表示的 TR 细胞 5：00 AM 樱桃的表达在这里清晰可见。SDS 页面凝胶 western lot 和 CMC zy 显示 T 细胞 5 的大小和活性 A.总可溶性蛋白已被分离，我们可以用 kumasi 蓝染色可视化它们 针对 T 细胞 5 的 hist 标签区域的蛋白质印迹确认蛋白质大小，此外，针对 CMC 的纤维素酶活性由用刚果红染色的异种移植物显示。这里可以看到的是来自烟草植物叶片的总可溶性蛋白，其中 TR 细胞 5 A 在热沉淀纯化前后瞬时表达，其中 TR 细胞 5 A 是最大的可见条带，在蛋白质批次和 CMCs igraph 中也可见。

我们还看到了来自烟草植物的总可溶性蛋白质，其中 Tcell 5 A 在热沉淀后也没有，以及来自市售的 tresa 纤维素酶混合物的蛋白质。该图显示了 TR 细胞 5 A 的酶活性定量 TR 细胞 5 A 与 4 MUC 偶氮 CMC 或滤纸一起孵育，并通过释放氟 4 4 μ 偶氮染料来测量底物降解，或通过定量 PBA 颜色变化的还原糖 遵循此程序。其他方法（如蛋白质靶向）可用于提供有关蛋白质定位如何影响酶稳定性和活性的额外信息。

观看了本视频后，您现在应该对如何在烟草中瞬时表达蛋白质有了清晰的了解，并且对如何评估酶活性也有了一些很好的了解。Foro 纤维素生物质转化。