蛋白质中 Plasmodesmal 定位序列的识别在底中
August 15th, 2017
植物细胞间连接, 胞 (Pd), 在植物生理学和植物-病毒相互作用中扮演中心角色。对 pd 传输的关键是分拣信号, 直接蛋白质的 pd。然而, 我们对这些序列的了解还处于起步阶段。我们描述了一种在 pd 靶蛋白中识别 pd 定位信号的策略。
该程序的总体目标是识别靶蛋白中的胞间连丝定位信号。该方法可以通过识别将蛋白质引导至胞间连丝的信号中的批判性思想来帮助回答研究植物细胞间连接的关键问题，这反过来又促进了大分子的细胞间运输。该技术的主要优点是该程序可靠，并且可以很容易地适应在大多数胞间连丝靶向蛋白中发现胞间连丝定位信号序列。
这种方法的视频演示至关重要，因为典型的印刷出版物很难了解共聚焦观察步骤的种植、过滤和准备工作。在潮湿的土壤中以高密度种植 Nicotiana benthamiana 种子。生长时，将它们保存在 20 至 25 摄氏度的受控环境室中，每天光照 16 小时，每秒每平方米包含约 75 微摩尔的光子。
当 u. fil 的直径达到半厘米后，小心地将幼苗转移到更大的花盆中，并在相同条件下在同一腔室中继续生长。维护植物，直到它们在 4 周内长到 4 到 8 片叶子阶段。
此时，最大的叶子直径应为 4 到 6 厘米。为了便于鉴定和分析，请选择一种表达系统，并按照随附文本方案中的说明对每种表达的蛋白质进行荧光标记。如前所述制备基于 pPZP-RCS2 的质粒，并将其 1 微克加入 100 微升根癌农杆菌感受态细胞培养物中。
将细胞在冰上孵育 30 分钟。然后，将细胞在液氮中快速冷冻 1 分钟。接下来，将细胞在 28 摄氏度下加热 15 分钟，然后将 1 mL LB 培养基添加到感受态细胞混合物中。
加入 LB 培养基后，将细胞放回 28 摄氏度 2 小时。接下来，将细胞以 3， 000 倍 G 离心 1 分钟。将细胞沉淀重悬于 0.2 mL LB 培养基中，并将其接种在抗生素选择性 LB 琼脂平板上。
将细胞在 28 摄氏度下在平板上培养 48 小时，直到看到单个菌落。然后，将几个单独的菌落挑取并铺板到新鲜的 LB 琼脂平板上，并在 28 摄氏度下培养细胞 48 小时。接下来，从每个板中取出少量细菌进行分析，并使用菌落 PCR 确认存在特定的目标二元构建体。
将每个农杆菌菌落与感兴趣的构建体添加到 5 毫升补充有适当抗生素的 LB 培养基中。在 28 摄氏度下培养细胞过夜。然后，以 3， 000 次 G 离心细胞，在农杆菌浸润缓冲液中重悬沉淀至 OD 600 为 0.5。
将悬浮液在室温下孵育 2 小时，然后将接种物装入 1 毫升塑料注射器中。用戴手套的手指在近轴面上握住完全成熟的 N.Benthamiana 叶子，将注射器的喷嘴压在叶子的下表皮上。然后，通过注入培养基将农杆菌缓慢引入浸润培养基中。
保持浸润的植物，直到要观察它。渗透后 24 至 48 小时，用刀片将每片叶子切成叶脉之间的碎片。将叶切片放在对象载玻片上，使背面叶表面朝上。
然后，在叶片上滴一滴水，并用盖玻片盖住。用每侧的小块胶带固定盖玻片。将载玻片转移到激光扫描共聚焦显微镜下，并使用 10X 主观镜头识别具有最佳信号的细胞。
然后，使用 63X 主观镜头记录图像以进行更详细的观察。此外，使用适当的荧光灯来激发表达的荧光蛋白。保留用于图像采集的所有设置，以保持实验之间的一致性。
平均而言，每种实验条件检查 100 到 120 个细胞。使用共聚焦显微镜图像诊断测试蛋白质的定位。这些图像说明了在与货物分子 CFP 融合的全长 TMV 运动蛋白、与 CFP 融合的已鉴定胞间连丝定位信号以及共表达的胞间连丝定位蛋白 PDCB1 与 DsRed 融合中观察到的特征性外周点状胞间连丝定位模式。
在对照条件下，与 CFP 融合的全长 TMV 运动蛋白的胞间连丝靶向以及与 CFP 融合的 TMV 运动蛋白中的定位信号，如图所示，CFP 的亚细胞定位和标记物 DsRed2 的核质定位。当第四个氨基酸缬氨酸突变为丙氨酸时，全长 TMV 运动蛋白靶向的胞间连丝和 TMV 运动蛋白中鉴定的定位信号都丢失。这表明该残基对于胞间连丝定位信号结构或功能很重要。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 50 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住让植物处于非常健康的状态，并且植物处于正确的叶子阶段。看完这个视频，你应该对如何识别胞间连丝定位蛋白信号有了很好的了解，而且也知道如何识别植物蛋白中的其他某些信号。
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概览
本研究的重点是识别目标蛋白中的胞质连丝定位信号，这对理解植物的细胞间连接至关重要。所描述的方法可靠且适用于发现各种胞质连丝靶向蛋白中的这些信号。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生理学
- 细胞生物学
- 植物-病毒相互作用
背景
- 胞质连丝（Pd）对于植物的细胞间运输至关重要。
- 分类信号将蛋白质引导到Pd，促进运输。
- 目前对这些序列的了解有限。
- 理解这些信号可以增进我们对植物生理学的认识。
研究目的
- 识别目标蛋白中的胞质连丝定位信号。
- 提高对植物细胞间连接的理解。
- 促进蛋白质运输机制的研究。
使用的方法
- 在受控条件下种植本杰明烟种子。
- 保持最佳生长条件（20-25掳C, 16小时光照）。
- 利用共聚焦观察技术进行分析。
- 提供复杂步骤的视频演示。
主要结果
- 该方法有效地识别蛋白质中的定位信号。
- 它适用于各种胞质连丝靶向蛋白。
- 视频资源增强了对程序的理解。
- 可靠的结果为植物生物学领域做出了贡献。
结论
- 该研究提供了一种有价值的技术来识别Pd定位信号。
- 理解这些信号可以促进植物生理学研究的进展。
- 该方法的可靠性使其成为研究人员的有用工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying plasmodesmata localization signals enables mechanistic de-risking of plant-based expression systems used in recombinant protein production. This approach supports target validation by clarifying subcellular trafficking pathways critical for biologics manufacturing in plant hosts. The method enhances predictive confidence in protein localization, informing go/no-go decisions for plant-derived therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates protein-sorting mechanisms to validate functional targeting signals necessary for plasmodesmata transport.
- Operational Value: Provides a reliable, adaptable strategy to identify necessary and sufficient localization signals directly in living plant cells.
- Predictive Value: Enables functional confirmation of targeting motifs through mutagenesis, such as valine-to-alanine substitution disrupting localization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescent tagging and confocal microscopy to generate quantitative, reproducible localization readouts.
- Scalability: Supports screening of multiple protein variants via Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana.
- Platform Reuse: The workflow can be applied to diverse plasmodesmata-targeted proteins beyond viral movement proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery of localization signals to downstream evaluation of protein mobility and intercellular transport efficiency.
- Disease-Relevant System: Utilizes a well-established plant model system compatible with transient expression for rapid signal validation.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in protein trafficking by defining cis-acting elements required for plasmodesmata targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where subcellular localization informs protein engineering and construct design for plant-based expression platforms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targeting sequences via direct visualization of protein localization in planta.
- Screening: Enables assessment of signal functionality through co-localization with plasmodesmata markers like PDCB1-DsRed.
- Analytics: Generates imaging-based quantitative data on subcellular distribution patterns under controlled expression conditions.
- Translational Research: Provides mechanistic insight into intercellular transport, relevant for optimizing protein yield and mobility in plant bioproduction.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for localization signal discovery applicable across multiple protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by defining minimal functional sequences required for plasmodesmata localization.
- Operational Value: Delivers a reproducible, video-supported protocol reducing variability in localization assays.
- Strategic Value: Informs construct optimization to enhance intracellular trafficking in plant expression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on validated subcellular targeting.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transient expression, confocal microscopy, and fluorescent protein tagging.
- Dependent on Agrobacterium infiltration infrastructure and controlled plant growth chambers.
- Necessitates standardization of imaging settings and analysis criteria across experimental conditions.
- Adaptation to different plant species may require optimization of infiltration and growth parameters.
- Limited to proteins that can be stably expressed and fluorescently tagged in planta without disrupting native function.
