瞬时表达和重组蛋白的细胞定位在培养的昆虫细胞

Nonlytic昆虫细胞表达系统没有得到充分利用进行生产，细胞运输/定位，和重组蛋白质功能分析。这里，我们描述的方法来产生在市售鳞翅目细胞系的表达载体和随后的瞬时表达。与亚细胞荧光标记蛋白烟粉虱水通道蛋白的共定位还提出。

该程序的总体目标是在市售昆虫细胞中表达感兴趣的荧光标记蛋白，以增强蛋白质功能和/或蛋白质细胞运输的阐明。该方法可以帮助回答有关蛋白质功能、蛋白质相互作用和/或亚细胞蛋白质定位的关键细胞生物学和生物化学问题。该技术的主要优点是可以快速生成构建体并在活细胞中表达蛋白质进行功能评估，而不会产生与杆状病毒表达相关的有害影响，从而提高通量。

虽然这种方法可以为昆虫蛋白质的研究提供见解，但它也可以应用于任何需要研究蛋白质功能或细胞定位的系统。演示昆虫细胞培养和转染程序的是我实验室的技术人员 Danni LeRoy。要开始此过程，请从零下 80 摄氏度的冰箱中取出冷冻 SF9 和 Tni 细胞的储备小瓶，并让它们在 37 摄氏度的水浴中解冻。

解冻后，用 70% 乙醇对小瓶进行去污，并将其置于冰上。所有需要打开样品瓶和组织培养瓶的细胞作必须在层流罩内进行，以保持无菌条件。将 4 mL 无血清昆虫培养基加入到新的 T25 培养瓶中，将 4 mL TNM-FH 培养基加入到另一个 T25 培养瓶中。

将 1 毫升解冻的 Tni 细胞转移到装有无血清昆虫培养基的培养瓶中，将 1 毫升解冻的 SF9 细胞转移到装有 TNM-FH 培养基的培养瓶中。将培养瓶置于 28 摄氏度的非加湿培养箱中，让细胞贴壁 30 至 45 分钟。用 5 毫升适当的培养基替换接种培养基。

并将培养瓶放回 28 摄氏度的非加湿培养箱中。每天监测细胞汇合度。当细胞达到 90% 汇合时传代细胞，如这些代表性图像所示。

倾斜含有汇合细胞的培养瓶，使培养基流向远离细胞单层的一角，并使用无菌的 5 毫升血清移液管小心地去除培养基，而不会干扰细胞。对于 Tni 细胞，使用新的无菌 5 毫升血清移液管将 4 毫升无血清昆虫培养基轻轻添加到汇合的单层上。将移液器吸头移过培养瓶并缓慢冲洗，以去除松散附着在培养瓶底部的细胞。

要检查细胞是否充分分离，请取出所有培养基，将培养瓶翻转过来，观察培养瓶底部是否透明。对于粘附更紧密的 SF9 细胞，加入 4 毫升新鲜的 TNM-FH 培养基，并使用细胞刮刀去除附着的细胞。使用 5 mL 血清移液管轻轻混合并减少细胞结块。

分离细胞后，将每个细胞和培养基混合物的大约 0.1 mL转移到 1.5 mL 微量离心管中。在单独的 0.5 ml 微量离心管中，将 10 μL 每个细胞和培养基混合物添加到 10 μL 台盼蓝中。从包装中取出细胞计数仪载玻片，向计数载玻片的每一侧添加 10 μL 细胞培养基台盼蓝混合物。

将玻片插入自动细胞计数仪中，测定细胞密度和活力。将大约 1 至 1.5 乘以 10 至第 6 个细胞转移到装有新鲜培养基的 T25 培养瓶中。用细胞系、日期、使用的培养基、添加的细胞数和传代次数标记培养瓶。

将培养瓶置于 28 摄氏度的培养箱中长达 72 小时。昆虫细胞转染程序也必须在层流罩内进行。在适当的昆虫细胞培养基中，将最多一乘以 10 的 T25 培养瓶接种到第 6 个 Tni 或 SF9 细胞中。

本演示中使用了 Tni 单元。在 18 摄氏度下将细胞培养至汇合 72 小时。72 小时后，去除并丢弃旧培养基，并用 4 毫升新鲜的无血清昆虫培养基去除 Tni 细胞，如前所述。

该程序最困难的方面是在转染过程中获得附着在玻璃底培养皿上的适当密度的细胞。每个培养皿中应添加不超过 7 乘以 10 至第 5 个单元格。使用自动细胞计数器估计细胞密度后，通过倒置试管彻底但轻轻地混合细胞悬液，并将大约 7 乘以 10 添加到第 5 个细胞中，放入单独的 35 毫米玻璃底培养皿中。

让细胞在 20 摄氏度下附着 25 到 28 分钟。对于每次转染，将 2 μg 质粒 DNA 添加到 0.1 mL 不含 FBS 的无血清昆虫培养基中，装在无菌的 1.5 mL 微量离心管中。在单独的试管中，将 8 μL 转染试剂与 0.1 mL 无血清昆虫培养基混合。

然后将溶液转移到含有目标质粒 DNA 的试管中。轻轻涡旋并在室温下孵育 20 至 30 分钟。接下来，用 0.8 mL 无血清昆虫培养基稀释质粒转染混合物，使总体积达到 1 mL。

小心地从含有附着细胞的玻璃皿中取出培养基。用稀释的质粒转染培养基覆盖贴壁的细胞。将细胞在 28 摄氏度下孵育 5 小时。

5 小时后，取出并丢弃转染培养基，用 1 mL 无血清昆虫培养基轻轻洗涤细胞，注意不要使细胞脱落。加入 2 毫升新鲜的无血清昆虫细胞培养基，在 28 摄氏度下孵育 48 至 72 小时。转染昆虫细胞后 48 至 72 小时，用 1 毫升 IPL-41 昆虫培养基洗涤细胞一次，然后用 2 毫升 IPL-41 覆盖进行成像。

向培养基中加入 4 滴 Hoechst 活细胞染色试剂，并在 28 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟。将 35 毫米培养皿放入自封闭式激光扫描共聚焦显微镜中。尽管许多玻璃皿在市场上都可以买到，但它们适合显微镜载物台很重要，并且可能需要根据经验确定哪种玻璃器皿与细胞附着最兼容。

根据 Hoechst、EGFP 和 mCherry 观察条件调整显微镜。Hoechst 激发和发射为 359 纳米和 461 纳米。EGFP 激发和发射为 489 纳米和 510 纳米。

以及 580 纳米和 610 纳米用于 mCherry 激发和发射。使用 10X 物镜进行初始扫描以确认荧光表达。之后，使用 60 倍相差水浸物镜切换到扫描模式。

调整激光功率、探测器灵敏度、扫描速度、Z 轴深度和数字变焦，以优化图像对比度和分辨率。以 1.5 倍数字变焦对细胞进行成像，以获得总共 90 倍的扩增。将原始数据保存并导出为 TIFF 图像文件以供以后分析。

用指定的质粒转染 Tni 细胞，并使用共聚焦荧光显微镜观察重组蛋白的表达。重组 BtDrip1-EGFP 的成功转染和表达通过细胞表面的绿色荧光来证明。转染 BtDrip2 版本 1 EGFP 的细胞在细胞内显示绿色荧光，表明 BtDrip2 版本 1 的细胞内表达。

同样，转染 PIB DmSPR-mCherry 或 PIB PLA2G15-mCherry 的细胞显示红色荧光，指示相应嵌合体的表达。在合并的图像中，橙色或黄色区域表示 EGFP 和 mCherry 的表达，这表明这些蛋白质共定位于相同的亚细胞结构中。用 PIB BtDrip1-EGFP 和 PIB DmSPR-mCherry 双重转染的细胞叠加表明 BtDrip1-EGFP 和 DmSPR-mCherry 在细胞表面共定位。

用 BtDrip2 版本 1 EGFP 和 PIB DmSPR-mCherry 双重转染的细胞显示绿色和红色荧光信号的几乎共定位，证实了 BtDrip2 版本 1 的细胞内表达。相比之下，PIB BtDrip2 版本 1 EGFP 和 PIB PLA2G15-mCherry 溶酶体标志物的共表达导致细胞质绿色和红色荧光信号显着重叠。这强烈表明 BtDrip2 是细胞间溶酶体的交通。

看完这个视频后，您应该对如何在培养的昆虫细胞中表达荧光蛋白嵌合体有了很好的了解。该系统在蛋白质合成中提供了快速的载体构建，避免了基于病毒的表达系统的挑战，并为观察细胞运输蛋白提供了一种可靠的方法。