Name: 瞬时表达和重组蛋白的细胞定位在培养的昆虫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习在培养的昆虫细胞中进行瞬时表达和荧光标记蛋白定位的方法。该技术可快速构建载体并在活细胞中评估蛋白质功能，无需杆状病毒表达系统的有害影响，适用于研究蛋白质相互作用和亚细胞定位。

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感谢Lynn Forlow-Jech和Dannialle LeRoy提供的技术协助。本研究由美国农业部农业研究局基础CRIS资金支持，属于国家项目304——作物保护与检疫 [项目编号：2020-22620-022-00D]，资助对象为J.A.F.和J.J.H.。本文中提及的贸易名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。

1. 表达质粒构建的重叠延伸 PCR
注意：OE-PCR 中使用的所有引物见表1。所有扩增反应均建议使用高保真 DNA 聚合酶。然而，由于这些酶通常不会在产物 3' 端添加 A，因此在将 PCR 产物克隆至 TA 昆虫细胞表达载体之前，需使用 Taq DNA 聚合酶进行短暂的非扩增性孵育，以对产物进行&#34;A加尾&#34;。本方案展示了一种构建携带嵌合蛋白的昆虫表达质粒的方法，其中荧光蛋白与目标基因（本例中为两种 Bemisia tabaci 水通道蛋白）的羧基末端或亚细胞定位标记蛋白以同读框融合表达（图1）。
<ol>
	<li>使用OE-PCR（重叠延伸PCR），通过两轮独立的扩增反应生成：（1）目的基因的编码序列B. tabaci 水通道蛋白1：BtDrip1； B. tabaci 水通道蛋白2：BtDrip2_v1）与一种称为EGFP的绿色荧光蛋白变体进行同框融合，或（2）亚细胞标记物（黑腹果蝇 性肽受体：DmSPR Homo sapiens 磷脂酶A2（HsPLA2）与mCherry编码序列进行直接连接，将最终的OE-PCR产物直接连接至pIB/V5-His-TA质粒中。
	<ol>
		<li>第一轮OE-PCR（由A-D和A'-D'表示） 图1），使用基因特异性的正义引物（在图中以粗体显示） 表1）以及一个嵌合反义引物（原文中以斜体表示） 表1）对应于目的基因/亚细胞标记物的最后15个碱基对（不含终止密码子）以及目标荧光蛋白（EGFP或mCherry）5'端的15个碱基对，以生成具有3'突出端的产物。 
		注意：参见 表2 用于PCR条件。</li>
		<li>在另一个离心管中，使用基因特异性的荧光蛋白反义引物（如下划线所示） 表1以及一个嵌合正义引物，该引物包含目的基因/亚细胞标记物3'端的15个碱基和所需荧光蛋白5'端的15个碱基，用于生成具有5'突出端的扩增产物。 
		注意：参见 表 2 用于PCR反应条件。PCR模板可以是经序列验证的PCR产物，但更优选的是含有目标序列的质粒DNA。本研究所描述的方法使用经序列验证的质粒。</li>
		<li>使用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物（采用标准分子级琼脂糖）。</li>
		<li>切下并纯化预期大小的产物（参见 表2使用市售的DNA凝胶回收试剂盒（具体试剂盒见材料表）进行操作。</li>
		<li>使用步骤 1.1.4 中经凝胶纯化的 PCR 产物，扩增获得最终的重叠延伸产物（以 A''-D'' 表示） 图1使用目的基因/亚细胞标记物的基因特异性正义引物和荧光蛋白对应的基因特异性反义引物，扩增获得目标嵌合序列。 
		注意：参见 表2 对于PCR反应条件，可能需要通过实验确定添加至反应体系中的第一轮重叠延伸产物的最佳用量，以获得最终的全长嵌合PCR产物。</li>
		<li>通过1%琼脂糖凝胶电泳分离第二轮OE-PCR产物。使用市售DNA凝胶回收试剂盒切取并纯化目标条带。</li>
		<li>将第二轮OE-PCR产物经凝胶纯化后，与1单位Taq DNA聚合酶预混液在72 °C孵育10分钟，以生成3'端腺苷酸化（即 A尾)&#160;TA克隆所需的产物</li>
		<li>将所得的腺苷酸化产物连接至pIB表达载体，并采用标准分子克隆技术转化感受态细胞（化学法转化采用热激法，电转化采用电穿孔法） 大肠杆菌 细胞。在含有适当筛选标记的培养基中过夜培养即， 氨苄青霉素或羧苄青霉素</li>
		<li>进行菌落PCR12 使用载体特异性引物和插入片段特异性引物，鉴定已转化含有5'-3'方向插入片段的表达质粒的插入阳性菌落。对产生预期大小PCR产物的菌落制备过夜培养物。</li>
		<li>使用市售DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书提取质粒DNA（参见 材料 表格 针对本实验方案所用的特定试剂盒）。通过直接DNA测序验证每个插入片段的序列完整性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 昆虫细胞培养的维持
注意：为保持无菌条件，所有需要打开组织培养瓶的细胞操作均应在超净工作台内进行。细胞操作前至少1小时开启超净工作台的紫外杀菌灯。操作时佩戴腈手套，并在使用前用70%乙醇对实验台面、移液器、器具、离心管和培养瓶表面进行去污染处理。建议操作者熟悉基本的细胞培养技术13。
<ol>
	<li>使用Tni细胞（一种源自Trichoplusia ni卵巢组织的已建立细胞系），该细胞系已适应无血清培养基，并在28 °C条件下，以无血清昆虫培养基在T25细胞培养瓶中维持贴壁单层培养。</li>
	<li>以类似方式维持Sf9细胞（一种源自Spodoptera frugiperda卵巢组织的已建立细胞系），但使用添加了10%胎牛血清（FBS）的TNM-FH昆虫培养基。</li>
	<li>从-80 °C取出冻存的Sf9或Tni细胞冻存管，置于37 °C水浴中解冻，以启动初始培养。解冻后用70%乙醇对冻存管进行去污处理，并置于冰上。</li>
	<li>向新的T25培养瓶中加入4 mL昆虫细胞培养基，转移1 mL解冻后的昆虫细胞悬液。将培养瓶置于28 °C非加湿培养箱中，使细胞贴壁30–45分钟。</li>
	<li>将接种培养基更换为5 mL相应的新鲜培养基，将培养瓶转移至28 °C非加湿培养箱中。每日监测细胞融合度。当细胞融合度达到90%时进行传代。 
	注意：T25培养瓶完全覆盖约相当于5 × 106个细胞。</li>
	<li>昆虫细胞传代。
	<ol>
		<li>传代时，首先使用无菌5 mL移液管从含有融合细胞的培养瓶中移除耗尽的培养基。倾斜培养瓶，使培养基流向一角，远离细胞单层。小心吸取培养基，避免扰动细胞。</li>
		<li>对于Tni细胞，使用新的无菌5 mL移液管，以4 mL无血清昆虫培养基轻轻冲洗含有融合单层的T25培养瓶，使细胞脱落。移动移液管头在培养瓶表面缓慢冲洗，以去除松散附着于瓶底的细胞。
		<ol>
			<li>通过移除所有培养基，将培养瓶倒置并观察瓶底是否清晰，以检查细胞是否充分脱离。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于贴附更紧密的Sf9细胞，加入4 mL新鲜TNM-FH培养基，并使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。使用5 mL移液管轻轻吹打混匀，以减少细胞团块。</li>
		<li>使用自动细胞计数仪估算每单位体积培养基中的活昆虫细胞数量。取0.1 mL细胞/培养基混合液加入1.5 mL微量离心管中。另取10 µL细胞/培养基混合液与10 µL台盼蓝混合于0.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>从包装中取出细胞计数仪专用计数板，将10 µL细胞/培养基/台盼蓝混合液分别加入计数板两侧。将计数板插入细胞计数仪，测定细胞密度和细胞活力。</li>
		<li>根据测得的细胞密度，计算所需体积，并向新的无菌T25培养瓶中加入适量昆虫细胞培养基（最多5 mL）。</li>
		<li>将约1–1.5 × 106个细胞转移至含新鲜培养基的T25培养瓶中；在培养瓶上标注细胞系名称、日期、所用培养基、接种细胞数量及传代代数（Pn + 1代，其中Pn为上一代细胞的传代数）；并将培养瓶置于28 °C培养箱中培养最多72小时。 
		注意：昆虫细胞可连续传代，但传代超过30次后，细胞对转染和/或异源蛋白表达的敏感性可能降低。所有废弃的细胞和培养基均需用10%次氯酸钠溶液处理，一次性塑料器皿须经高压灭菌后丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 昆虫细胞转染
<ol>
	<li>在T25培养瓶中接种最多1 × 10⁶个细胞6 在适当的昆虫细胞培养基中培养Tni或Sf9细胞（Tni细胞使用无血清昆虫培养基，Sf9细胞使用TNM-FH培养基），于28 °C培养72小时至细胞汇合。</li>
	<li>移除并弃去旧的培养基，加入4 mL新鲜无血清昆虫培养基使细胞脱落（见上述步骤2.6.2和2.6.3）。</li>
	<li>使用自动细胞计数器估算细胞密度（参见上述步骤 2.6.4）。</li>
	<li>加入约 7 x 105 将细胞接种至各35 mm玻璃底培养皿中，在28 °C条件下孵育20-25分钟，使细胞贴壁。</li>
	<li>每次转染时，加入 2 µg 质粒 DNA（单次转染使用一种质粒，或两种质粒各加入 2 µg）&#160;用于双重转染）加入到无血清昆虫细胞培养基（Sf9和Tni转染均不含FBS）0.1 mL中，置于无菌的1.5 mL离心管内。</li>
	<li>在另一个离心管中，将8 µL转染试剂与0.1 mL无血清昆虫细胞培养基混合，然后将该溶液转移至含有目标质粒DNA的离心管中。轻轻涡旋混匀，室温孵育20–30分钟。</li>
	<li>将步骤 3.5 和 3.6 中的质粒-转染混合物用 0.8 mL 无血清昆虫培养基稀释，使总体积达到 1 mL。</li>
	<li>小心移除含有贴壁细胞的玻璃培养皿中的培养基，然后加入稀释后的质粒-转染培养基覆盖贴壁细胞。</li>
	<li>在28 °C下孵育细胞5小时。 
	注意：转染条件需根据经验进行优化，以获得最大转染效率 例如，&#160;过夜&#160;转染时间而非5小时，所用质粒DNA的量，所用转染试剂的化学成分 等等.).</li>
	<li>移除并弃去转染培养基，用1 mL无血清昆虫培养基轻柔洗涤细胞，注意避免细胞脱落。</li>
	<li>加入2 mL新鲜昆虫细胞培养基（Tni细胞使用无血清昆虫培养基，Sf9细胞使用TNM-FH），于28 °C培养48–72小时。 
	注意：同样，为实现异源蛋白的高效表达，相关条件需通过实验进行优化。</li>
</ol>
4. 共聚焦荧光显微镜
<ol>
	<li>转染后48-72小时，用1 mL IPL-41昆虫培养基洗涤细胞一次，然后加入2 mL IPL-41培养基用于成像。 
	注意：此洗涤步骤可降低在常规细胞维持中使用的昆虫细胞培养基所产生的背景自发荧光。</li>
	<li>向培养基中加入4滴Hoechst活细胞染色试剂（参见材料表中本实验方案所用的具体核染料），在28 °C下孵育20-25分钟。 
	注意：可使用其他核染料替代，但染料的荧光光谱应与EGFP和mCherry明显不同。</li>
	<li>将一个35 mm培养皿放入自封闭式激光扫描共聚焦显微镜中（参见材料表中本实验方案所用的具体仪器）。</li>
	<li>调整显微镜以满足Hoechst、EGFP和mCherry的观察条件：Hoechst激发/发射波长 -&#160;359/461 nm；EGFP激发/发射波长 -&#160;489/510 nm；mCherry激发/发射波长 -&#160;580/610 nm。</li>
	<li>首先使用10倍物镜进行初步扫描，确认荧光表达，然后切换至60倍相差水浸物镜进行扫描模式成像。</li>
	<li>调整激光功率（5-7%）、检测器灵敏度（47-49%）、扫描速度、Z轴深度和数字放大倍数，以优化图像对比度和分辨率。以1.5倍数字放大倍数成像，实现总共90倍的放大效果。 
	注意：显微镜参数需根据具体使用的仪器进行经验性调整，以获得最佳图像采集效果。</li>
	<li>将原始数据导出为TIFF图像文件，并进行裁剪和叠加等处理，用于生成图表。</li>
</ol>

<ol><li>Kost, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>van Oers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+baculovirus-insect+cell+protein+expression%3A+from+dark+horse+to+mainstream+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology.</a> J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).</li>
<li>Contreras-Gòmez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Kollewe, C., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://thescipub.com/abstract/10.3844/ajbbsp.2013.255.271">Production of recombinant proteins in insect cells.</a> Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).</li>
<li>Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltmann%2C+F+%22Glycotechnology%22">Glycotechnology</a>. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+transient+gene+expression+method+using+High+Five+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells.</a> J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+membrane+protein+expression+in+transiently+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells.</a> Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-free+transient+protein+production+in+Sf9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-free transient protein production in Sf9 cells.</a> J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).</li>
<li>Loomis, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InsectDirect+System%3A+rapid%2C+high-level+protein+expression+and+purification+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).</li>
<li>Wurch, T., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1023%2FA%3A1008848517221">A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes.</a> Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).</li>
<li>Woodman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+intact+bacteria+%28colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).</li>
<li>Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0">http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0</a> (2014).</li>
<li>Mathew, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+functional+aquaporin+water+channel+protein+from+alimentary+tract+of+whitefly%2C+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).</li>
<li>Van Ekert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+Bemisia+tabaci+aquaporins+reveals+the+water+channel+diversity+of+hemipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).</li>
<li>Hull, J. J., Brent, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+sex+peptide+receptor-like+transcript+from+the+western+tarnished+plant+bug+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus.</a> Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).</li>
<li>Maroniche, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+set+of+Gateway-compatible+vectors+for+live+imaging+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells.</a> Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).</li>
<li>Hull, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+western+tarnished+plant+but+%28Lygus+hesperus%29+olfactory+co-receptor+ORCO%3A+Expression+profile+and+confirmation+of+atypical+membrane+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology.</a> Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+the+PBAN+receptor+molecule%3A+Characterization+of+PBANR+variants+expressed+in+the+pheromone+glands+of+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths.</a> Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).</li>
<li>Fabrick, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+multiple+aquaporin+water+channel+proteins+from+the+western+tarnished+plant+bug%2C+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+baculovirus+%28Bombyx+mori+nuclear+polyhedrosis+virus%29+repeat+element+functions+as+a+powerful+constitutive+enhancer+in+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells.</a> J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286814771_Comparative_analysis_of_the_activity_of_two_promoters_in_insect_cells">Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells.</a> African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).</li>
<li>Kohnhorst, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+functions+of+proteins+under+fluorescence+single-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/263/5148/802">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

异源蛋白表达系统是生产用于多种下游应用的重组蛋白的重要工具4。从多种可用的表达系统中进行选择，取决于目标蛋白的最终用途。目前已有多种昆虫细胞表达系统，可作为原核和真核细胞表达系统的灵活替代方案5,6。其中，依赖杆状病毒感染以驱动蛋白表达的昆虫系统是迄今为止最流行且应用最广泛的昆虫表达系统，许多用于科研和治疗用途的蛋白均通过该系统生产1,2,3。然而，杆状病毒表达系统也存在一些局限性，包括：1）病毒生命周期会导致宿主细胞裂解；2）裂解的宿主细胞通常会释放大量降解酶；3）构建稳定细胞系耗时较长，且对于具有细胞毒性的蛋白可能不可行；4）非连续性表达需要频繁维护；5）载体构建通常需要多个克隆步骤；6）昆虫细胞密度往往与病毒感染效率呈负相关；7）重组蛋白主要被大量转运至细胞表面或被分泌出去<sup ...

利用昆虫细胞表达系统生产重组蛋白为真核蛋白的研究提供了诸多优势。具体而言，昆虫细胞具有与哺乳动物细胞相似的翻译后修饰、加工和分选机制，有利于获得正确折叠的蛋白质1,2,3昆虫细胞系统通常也比哺乳动物细胞系需要更少的资源和更少的维护时间与精力4,5杆状病毒表达系统就是一种基于昆虫细胞的系统，现已被广泛应用于多个领域，包括用于蛋白质表征和治疗用途的重组蛋白生产、用于疫苗制备的外源肽段和病毒蛋白的免疫原性呈递、多蛋白复合物的合成以及糖基化蛋白的生产。 等等.1,2,4,6然而，在某些情况下，杆状病毒表达系统可能不适用3,7，且使用非裂解性且瞬时的昆虫表达系统可能更为合适。具体而言，瞬时昆虫细胞表达系统能够实现重组蛋白的快速合成，所需开发与维护工作较少，不涉及病毒诱导的细胞裂解，并可为研究蛋白质合成过程中的细胞内转运提供有效手段7,8,9,10.
本方案描述了利用两步重叠延伸PCR（OE-PCR）11 快速构建表达载体，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行质粒DNA的标准克隆。质粒用于共转染 commercially available 培养的昆虫细胞，以表达代表性蛋白。本方案介绍了两种不同荧光标记的亚细胞标志蛋白的制备与应用，并展示了其与烟粉虱（Bemisia tabaci）中两种水通道蛋白的共定位。以下方案提供了OE-PCR、昆虫细胞培养与转染，以及目标蛋白细胞定位荧光显微镜观察的基本方法。

<table><tbody><tr><td>KOD DNA 聚合酶</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>用于重叠延伸 PCR 产物 PCR 扩增的高保真 DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>ExTaq DNA 聚合酶</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>用于 PCR 产物 A 尾修饰的 DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA 聚合酶预混液</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>用于细菌菌落 PCR 的 DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>Biometra TProfessional Gradient 梯度 PCR 仪</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montage DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA 表达试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>包含克隆重叠延伸 PCR 产物所需的组分，包括线性化且经拓扑异构酶 I 激活的 pIB/V5-His-TOPO 载体、One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 以及盐溶液</td></tr><tr><td>QIAprep Spin 质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube 自动化核酸纯化工作站</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Purifier 垂直式洁净工作台</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni 培养昆虫细胞系</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 培养昆虫细胞系</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>无血清昆虫细胞培养基</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH 昆虫培养基</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 昆虫培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II 转染试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm 一次性细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>带双位刀片的细胞刮刀</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (T25) 带透气滤膜盖的组织培养瓶</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>无菌 50 mL 生物反应管</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy 移液器辅助器</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 刻度移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 平盖 PCR 管</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯生物危害高压灭菌袋</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1.5 玻底培养皿</td><td>Matsunami Glass</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>培养皿直径 35 mm，玻璃直径 14 mm，玻璃厚度 1.5 mm，未包被</td></tr><tr><td>培养箱，型号 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 细胞计数仪</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数载玻片（含 0.4% 台盼蓝试剂）</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 质粒 DNA</td><td>transOMIC Technologies</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry 载体</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

异源蛋白表达系统可用于重组蛋白的生产、细胞内运输/定位的解析，以及在亚个体水平上确定蛋白质的生化功能。尽管杆状病毒表达系统在众多生物技术、制药和工业应用中正被越来越广泛地用于蛋白生产，但不涉及病毒感染的非裂解表达系统具有明显优势，却常常被忽视和未被充分利用。本文介绍一种构建非裂解表达载体及实现瞬时重组蛋白表达的方法。该方案可高效实现重组蛋白的细胞定位，适用于快速分析蛋白在细胞内的运输过程。我们展示了在一种 commercially available 昆虫细胞系中表达四种&#160;重组蛋白，包括来自昆虫烟粉虱（Bemisia tabaci）的两种水通道蛋白，以及分别特异性标记细胞质膜和细胞内溶酶体的亚细胞器标记蛋白。所有重组蛋白均在其羧基末端与荧光蛋白标记物构建成融合蛋白，从而实现对重组蛋白的直接检测。通过将含有目的基因构建体的质粒与已知亚细胞定位标记物的质粒共转染细胞，可实现活细胞成像，并更有效地验证蛋白在细胞内的定位。

重叠延伸聚合酶链式反应
OE-PCR 可实现嵌合 DNA 产物的合成，该产物插入表达载体后，可表达出与任何目标测试基因及荧光标记蛋白相对应的重组嵌合蛋白。 图1 代表含有pIB表达载体的通用制备方案 B. tabaci 水通道蛋白编码序列（BtDrip1 和 BtDrip2_v1）与荧光蛋白标记物 EGFP 保持读码框一致。在此情况下，产生了两种在羧基末端携带 EGFP 的 BtDrip 嵌合蛋白。本方案还展示了开发两种昆虫亚细胞标记蛋白 DmSPR 和 PLA2G15 的方法。图1），在其羧基末端与mCherry融合形成嵌合体。选择EGFP和mCherry是因为它们的发射光谱具有足够差异，可实现对测试蛋白信号的独立检测与共定位例如., BtDrip-EGFP）以及DmSPR和PLA2G15-mCherry标记蛋白。所有PCR反应均扩增出...

非裂解型昆虫细胞表达系统在蛋白质生产、细胞内运输/定位以及重组蛋白功能分析方面尚未得到充分利用。本文介绍了在商业可得的鳞翅目细胞系中构建表达载体并进行瞬时蛋白表达的方法。同时展示了烟粉虱（Bemisia tabaci）水通道蛋白与亚细胞荧光标记蛋白的共定位分析。

异源蛋白表达系统用于重组蛋白的生产、细胞转运/定位的解析，以及……

本实验的总体目标是在市售昆虫细胞中表达带有荧光标记的目的蛋白，以更清晰地阐明蛋白质功能及蛋白质的细胞内转运过程。该方法有助于解答与蛋白质功能、蛋白质相互作用以及蛋白质亚细胞定位相关的关键细胞生物学和生物化学问题。该技术的主要优势在于，可在无需使用杆状病毒表达系统的情况下，快速构建表达载体并在活细胞中对表达的蛋白质进行功能性评估，避免了杆状病毒表达可能带来的不利影响，从而提高实验通量。尽管该方法可用于昆虫蛋白质的研究，但也适用于任何需要研究蛋白质功能或细胞定位的系统。我实验室的技术员Danni LeRoy将演示昆虫细胞培养与转染的操作过程。开始该操作时，从-80摄氏度冰箱中取出冻存的SF9和Tni细胞小瓶，置于37摄氏度水浴中使其解冻。解冻后，用70%乙醇对冻存管进行去污染处理，并将其置于冰上。所有需要打开冻存管和组织培养瓶的细胞操作都必须在超净工作台内进行，以保持无菌条件。向一个新的T25培养瓶中加入4 mL无血清昆虫细胞培养基，向另一个T25培养瓶中加入4 mL TNM-FH培养基。将1毫升解冻的Tni细胞转移至含有无血清昆虫培养基的培养瓶中，将1毫升解冻的SF9细胞转移至含有TNM-FH培养基的培养瓶中。将培养瓶置于28°C非湿润培养箱中，使细胞贴壁30至45分钟。随后用5毫升相应的培养基替换接种培养基。将培养瓶放回28°C非湿化培养箱中。每天监测细胞汇合度。当细胞达到90%汇合度时进行传代，如这些代表性图像所示。将含有融合细胞的培养瓶倾斜，使培养基流向远离细胞单层的一角，用一支无菌的5毫升血清移液管小心吸除培养基，避免扰动细胞。对于Tni细胞，使用一支新的无菌5毫升血清移液管，轻柔地将4毫升无血清昆虫培养基加入融合的单层细胞中。移动移液管枪头在培养瓶内缓慢冲洗，以去除松散贴附在培养瓶底部的细胞。为检查细胞是否充分脱离，移除所有培养基，将培养瓶倒置，观察培养瓶底部是否变得透明。对于贴壁更紧密的SF9细胞，加入4 mL新鲜TNM-FH培养基，并使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。用5 mL血清移液管轻轻吹打，混匀细胞并减少细胞团块。消化细胞后，将每种细胞与培养基混合物约 0.1 毫升转移至 1.5 毫升微量离心管中。另取 0.5 毫升微量离心管，向其中加入 10 微升细胞与培养基混合物和 10 微升台盼蓝。从包装中取出细胞计数板，将 10 微升细胞培养基与台盼蓝的混合液分别加入计数板两侧。将细胞悬液插入自动细胞计数仪，测定细胞密度和活率。取约1×10⁶至1.5×10⁶个细胞转移至含新鲜培养基的T25培养瓶中。在培养瓶上标记细胞系名称、日期、所用培养基、接种细胞数量及传代次数。将培养瓶置于28摄氏度培养箱中培养，最长72小时。昆虫细胞转染操作也必须在层流罩内进行。在适当的昆虫细胞培养基中接种T25培养瓶，加入最多1 × 10⁶个Tni或SF9细胞。本实验使用Tni细胞。将细胞在18摄氏度下培养72小时至完全汇合。72小时后，移除并弃去旧培养基，用四毫升新鲜无血清昆虫培养基重悬Tni细胞，操作如前所述。该实验步骤中最困难的部分是在转染过程中获得附着于玻璃底培养皿上合适密度的细胞。每个培养皿中加入的细胞数量不应超过 7 × 10⁵ 个。使用自动细胞计数仪估算细胞密度后，通过轻轻颠倒离心管的方式充分而温和地混匀细胞悬液，并向各个 35 毫米玻璃底培养皿中加入约 7 × 10⁵ 个细胞。在28摄氏度下孵育20至25分钟，使细胞贴壁。每次转染时，在无菌的1.5毫升微量离心管中，将2微克质粒DNA加入0.1毫升不含FBS的无血清昆虫细胞培养基中。在另一管中，将8微升转染试剂与0.1毫升无血清昆虫细胞培养基混合。然后将溶液转移至含有目的质粒DNA的离心管中。轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育20至30分钟。接着，用0.8毫升无血清昆虫细胞培养基稀释质粒转染混合物，使总体积达到1毫升。小心移除含有贴壁细胞的玻璃培养皿中的培养基，加入稀释后的质粒转染培养基覆盖贴壁细胞。于28摄氏度孵育细胞5小时。转染5小时后，移除并弃去转染培养基，用1毫升无血清昆虫细胞培养基轻轻洗涤细胞，注意避免细胞脱落。加入2毫升新鲜的无血清昆虫细胞培养基，在28摄氏度下培养48至72小时。昆虫细胞转染后48至72小时，用1毫升IPL-41昆虫细胞培养基洗涤细胞一次，然后加入2毫升IPL-41培养基覆盖细胞，用于成像。向培养基中加入四滴 Hoechst 活细胞染色试剂，在 28 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟。将 35 毫米培养皿放入自带封闭系统的激光扫描共聚焦显微镜中。尽管市面上有多种玻璃培养皿可供选择，但重要的是确保其能够适配显微镜载物台，可能需要通过实验确定哪种玻璃器皿最有利于细胞贴附。调整显微镜以满足Hoechst、EGFP和mCherry的观察条件。Hoechst的激发波长为359纳米，发射波长为461纳米。EGFP的激发波长为489纳米，发射波长为510纳米。mCherry 的激发波长为 580 纳米，发射波长为 610 纳米。使用 10X 物镜进行初步扫描，以确认荧光表达。随后，切换至 60X 相差水浸物镜，进入扫描模式。调节激光功率、检测器灵敏度、扫描速度、Z轴深度和数字放大倍数，以优化图像对比度和分辨率。以1.5倍数字放大倍数对细胞成像，总放大倍数为90倍。将原始数据保存并导出为TIFF图像文件，用于后续分析。Tni细胞被转染了指定的质粒，并通过共聚焦荧光显微镜观察重组蛋白的表达。重组BtDrip1-EGFP成功转染和表达的证据是细胞表面存在绿色荧光。转染了BtDrip2版本一EGFP的细胞显示内部有绿色荧光，表明BtDrip2版本一在细胞内表达。同样，转染了PIB DmSPR-mCherry或PIB PLA2G15-mCherry的细胞显示出红色荧光，表明相应融合蛋白的表达。在合并图像中，橙色或黄色区域表示EGFP和mCherry同时表达，提示这些蛋白共定位于相同的亚细胞结构中。对共转染PIB BtDrip1-EGFP和PIB DmSPR-mCherry的细胞进行叠加成像，表明BtDrip1-EGFP与DmSPR-mCherry在细胞表面存在共定位。共转染了 BtDrip2 版本一 EGFP 和 PIB DmSPR-mCherry 的细胞中，绿色和红色荧光信号的共定位较少，证实了 BtDrip2 版本一的细胞内表达。相反，PIB BtDrip2 版本一 EGFP 与溶酶体标记物 PIB PLA2G15-mCherry 共表达时，细胞质中的绿色和红色荧光信号显示出显著重叠。这强烈表明 BtDrip2 会转运至细胞内溶酶体。观看本视频后，您应能够充分理解如何在培养的昆虫细胞中表达荧光蛋白嵌合体。该系统可实现蛋白质合成中的快速载体构建，避免了基于病毒表达系统的难题，并为观察细胞内蛋白质转运提供了可靠手段。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

瞬时表达和重组蛋白的细胞定位在培养的昆虫细胞

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可穿透细胞的蛋白质的构建

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。...

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

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高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶...

在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。...

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本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。...

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。...

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本方案描述了一种热激诱导的蛋白表达系统（pDHsp/V5-His/sf9细胞系统），可用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，或评估外源蛋白及其截短氨基酸序列的抗凋亡活性。...

在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。...

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

学习在培养的昆虫细胞中进行瞬时表达和荧光标记蛋白定位的方法。该技术可快速构建载体并在活细胞中评估蛋白质功能，无需杆状病毒表达系统的有害影响，适用于研究蛋白质相互作用和亚细胞定位。

培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

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