在导游的带领下材料的筛选方法定量溶胶 - 凝胶蛋白芯片开发
August 26th, 2013
在导游的带领下物料的筛分方法来开发溶胶凝胶蛋白掺杂微阵列使用一个新兴的销印刷法制造。这种方法是通过发展的乙酰胆碱酯酶和的多激酶芯片，用于成本效益的小分子筛选证明。
该程序的总体目标是确定用于微阵列制造的新型基于 soul gel 的材料，并将其用于纳米体积酶测定。这是通过首先识别具有足够长的固化时间以避免在打印过程中在微阵列打印针中凝胶化的材料来实现的。第二步是评估长时间材料打印为微阵列的能力、重现性、抗开裂粘附质量、不良相分离性以及最终包埋酶的高活性。
接下来，使用最佳材料将目标酶打印为微阵列，并测试其覆盖检测溶液并产生可测量的酶反应的能力。最后一步是评估材料使用目标酶提供高度可重现的分析并生成定量数据的能力。然后选择用于阵列制造的最终材料。
最终，soul gel 衍生的蛋白质微阵列用于鉴定降低酶活性的小分子。与现有方法（如基于板的筛选）相比，这种方法的主要优点是，您可以使用少量试剂非常快速地系统地筛选大量材料。通常，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为材料可能会在打印针内凝胶化。
如果这些材料随后被正确清洁，将导致遗漏的斑点，这些斑点可能会被解释为不可打印的材料。首先，按照随附的文本协议中所述准备多种添加剂溶液。许多溶液可以预制并在正确条件下储存长达一个月或更长时间，但有些溶液必须在实验当天制作。
使用前立即混合硅酸钠基锯子，并确保将它们保存在冰上。SOS 必须在加水后 1 小时内使用，因为较长的等待时间会导致 DATION 时间减少和不一致。接下来，按照随附文本方案中的指示准备缓冲液、salans 聚合物和器官泳道的各种组合，以确定哪些组合可以用作扩张时间大于 2.5 小时的可打印材料。
确定多种组合后，将打印室内的湿度设置为低于 80% 的 80% 至 90% 湿度可能会导致样品蒸发和打印不一致，因为打印机的沉积量小。现在准备好了，使用 Chip Writer Pro 程序排列要打印的阵列图案。使用前面确定的锯状凝胶组合，将 XY 方向的行程设置为 10 毫米/秒，将 Z 方向的样品接近速度设置为 2 毫米/秒，样品加载时间为 2.5 秒。
通过组合通过预筛选过程确定的相应聚合物、有机泳道和小分子添加剂，制备 25 微升基础材料。将 pH 值为 8.0 的 50 毫摩尔堆放入 384 孔微量滴定板的单个孔中。然后在双蒸水中超声处理多达四个直径为 100 微米的开槽护套针。
15 分钟后，在氮气流下尝试它们。接下来，使用管道清洁器去除销钉支架内残留的水分，然后小心地将销钉放入接触针打印机器人的打印头中。未能去除残留的水分可能会阻碍销与支架一起自由移动，从而导致遗漏点。
然后在打印前将 25 微升相应的 SA 添加到孔中。使用上下移液动作混合溶液 用移液管混合时重复 50 次。尽量减少溶液中的空气量。
气泡会阻止样品完全加载到针内。接下来，通过将销钉降低到样品中来加载销钉。加载针脚后，开始打印过程并将样品打印到一个载玻片表面上。
在向后续源板添加盐之前暂停打印过程。好吧，在该过程暂停的情况下，使用磁铁取下打印销并在打印头中放置管道清洁器，以防止打印头中积聚水分。然后用双蒸水冲洗打印针，并在干净的双蒸水中超声处理 30 秒。
接下来，在氮气流下擦干打印针，然后将针放回打印头中。继续混合、打印和清洁源板内剩余的所有样品，单个载玻片上最多可沉积 12， 000 个点，直径为 100 微米。打印完成后，将阵列在打印室内湿度为 80% 至 90% 的打印室内老化至少 30 分钟，最多 24 小时。
在使用前准备 50 微升阳性对照，方法是将 25 微升 1 毫摩尔、乙酰胆碱碘化物和 0.14 微升 5 毫摩尔 bodi pi、FIL 半胱氨酸和 25 毫摩尔三在 pH 7.0 和 4% 甘油混合在 384 孔微量滴定板的孔中缓慢上下移液以混合而不产生气泡。接下来，将 0.14 微升 5 毫摩尔 boai PI FIL 半胱氨酸与 49.86 微升 25 毫摩尔 triss 在 pH 7.0 和 4% 甘油混合到 384 孔微量滴定板的另一个孔中，并在使用上一节中描述的相同过程将它们轻轻混合，将对照打印到老化的微阵列上。但是，您不是 100 微米直径的销钉，而是开槽直径为 235 微米的主销。
这确保了溶液完全覆盖先前沉积的点。由于乙酰胆碱的自动水解，斑点会在 80% 至 90% 的湿度下使阵列在室温下老化 1 小时。较长的孵育时间可能会因酶活性增强而导致假阳性。
确保 alpha innotech novo 阵列成像仪已打开并配备 478 加或负 17 纳米激发和 538 加或负 21 纳米发射滤光片，用于测量乙酰胆碱酯酶微阵列。然后将载玻片放入载玻片支架中，使点朝上。设置预览部分的数量，以便使用自动曝光以最小 4 微米的分辨率预览显微镜载玻片两侧的至少一个部分。
一旦发现参数可接受，则获取幻灯片图像并将其另存为 TIFF 文件。接下来，在图像 J 64 中打开获取的载玻片图像。单击 Oval Selection Tool 并选择每个点。
选择一个略大于观察到的点的区域，并确保在点之间使用一致的大小以减少图像的主观性 J.然后使用测量选项测量每个点的信号强度。在 analyze 选项卡下。将 25 个相似阳性对照点的强度平均，然后除以 25 个相似阴性对照点的平均强度，以获得各个材料成分的阳性对照与阴性对照比率。
此处显示的是使用这些方法制备的结果微阵列的动态范围示例。高控件会产生亮绿色区域，而低控件会导致更暗的点。图像 J 64 测量的强度显示，高对照平均约为 22， 000 个相对荧光单位，而低对照平均接近 8， 000 个。
虚线表示与平均值的三个标准差。以下是用于筛选鉴定为化合物 1 和化合物 2 的 ameral sier 生物碱的合成类似物的 Honor 阵列的示例微阵列。两个轴都表示由荧光信号确定的酶的百分比。
一式两份，点与对角线的接近代表高测定重现性。此处显示了两种不同潜在抑制剂的 IC 50 图。化合物 1 的 IC 50 水平为 16 微摩尔，而化合物 2 的 IC 50 为 21 微摩尔。上图显示了代表性斑点，以说明与抑制剂浓度成正比的信号差异。
此处显示的阵列用四种不同的激酶（P 38 图激酶、EGFR 和 GSK）打印，并用含有 A TP 的单独缓冲液和含有 A TP 和 starro sporin（酶活性抑制剂）的缓冲液进行包印。结果显示激酶抑制剂 starro sporin 基于此处描述的所得荧光强度具有显着效果。这里使用的 stor sporin 浓度的最大差异来自 P 38 点。
在这里，显示了 P 30 8：00 AM BP 微阵列的代表性点，这些点被不同浓度的 stor 孢子菌素过度点样。如图所示，该分子的 IC 50 被确定为一微摩尔，一旦掌握，如右图所示。如果按照此程序正确执行，该技术可以在几个小时内完成。
也可以使用其他方法，例如免疫测定或蛋白质相互作用测定来回答与诊断或小分子发现相关的其他问题。
概览
本文描述了一种引导式材料筛选方法，用于开发通过针式印刷法制造的溶胶-凝胶蛋白质掺杂微阵列。该方法通过创建乙酰胆碱酯酶和多激酶微阵列来实现高效的小分子筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物技术
- 微阵列技术
背景
- 微阵列对于高通量筛选生物分子至关重要。
- 溶胶-凝胶工艺允许开发用于微阵列制造的新型材料。
- 针式印刷方法能够精确地沉积样品。
- 识别合适的材料对于重复性和检测性能至关重要。
研究目的
- 开发一种系统的方法来筛选适用于微阵列应用的溶胶-凝胶材料。
- 优化酶检测的印刷过程。
- 评估蛋白质微阵列在识别小分子中的性能。
使用的方法
- 筛选长凝胶时间的材料以防止印刷过程中堵塞。
- 评估材料性质以确保重复性和酶活性。
- 使用优化的材料印刷酶微阵列。
- 评估检测性能和数据重复性。
主要结果
- 成功开发乙酰胆碱酯酶和多激酶微阵列。
- 识别出提供高活性和重复性的材料。
- 证明了该方法在筛选大量材料中的效率。
- 建立了准备和印刷微阵列的协议。
结论
- 引导式材料筛选方法增强了微阵列的制造。
- 溶胶-凝胶蛋白质微阵列对于小分子筛选有效。
- 该方法相比传统的板式筛选技术提供了优势。
常见问题
Executive Industry Relevance
This guided materials screening approach enables biopharma R&D teams to systematically evaluate sol-gel derived materials for high-density protein microarray fabrication, addressing a key bottleneck in assay development for enzyme-targeted small-molecule screening. By prioritizing materials that support both reproducible printing and retained enzymatic activity, the method enhances predictive confidence in target validation and lead identification campaigns. The approach directly supports early discovery workflows by generating quantitative, dose-dependent response data from nano-volume assays, reducing reagent consumption while increasing screening throughput.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of enzyme inhibition in a microarray format.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying materials that preserve enzyme function during array fabrication and assay execution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems ready for downstream compound screening with measurable enzymatic outputs.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled gelation times and humidity-dependent printing parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking of kinase and acetylcholinesterase targets through dose-response profiling of small-molecule inhibitors.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by generating IC50 data from array-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where array-based enzyme assays inform hit selection and optimization decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative assessment of enzyme activity modulation across material conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible microarray fabrication and stable enzyme entrapment in sol-gel matrices.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow signal-to-noise ratio calculations and IC50 determination for inhibitor profiling.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating enzyme inhibition data relevant to cancer and neurodegenerative pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable material screening platform applicable to diverse enzyme targets beyond acetylcholinesterase and kinases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through quantitative, reproducible enzyme activity measurements.
- Operational Value: Standardization and scalability of microarray production via pin-printing with defined material compatibility thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in lead identification by reducing false negatives from material-induced assay failure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of screening campaigns based on material-performance data linked to enzyme retention.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sol-gel chemistry, microarray printing, and enzyme assay optimization.
- Depends on contact pin printing robots, environmental chambers with humidity control, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of material preparation, printing protocols, and image analysis workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to new enzyme targets or alternative detection modalities.
- Includes practical limitations such as pin clogging from premature gelation and the need for precise humidity control to ensure spot uniformity.
