毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测

这种方法可以帮助回答生物医学研究领域的关键问题，如生物标志物的发现、药物的发现、诊断以及药物或抗体的筛选。该技术的主要优点是高通量，能够以高度可重复的方式检测蛋白质等构形式。这种技术的影响延伸到许多疾病的诊断，因为它可以测量受影响的蛋白质或其异构体。

虽然这种方法可以提供细胞信号通路洞察，它也可以应用于需要分析特定蛋白质的其他系统。此方法的可视化演示至关重要，因为检测步骤由于去除气泡、装载板等技巧而难以学习。首先，在47微升样品稀释剂中加入一微升的DMSO抑制剂混合物和两个微升蛋白酶抑制剂，制备样品稀释剂混合物，使DMSO和蛋白酶抑制剂的最终浓度为X. 稀释以前分离的蛋白质酸盐，使用样品稀释剂混合物获得所需的浓度。

接下来，在137.675微升的麻醉剂预混中加入3.325微升标准梯、6个蛋白酶抑制剂微升和3微升DMSO抑制剂。旋转样品至少15秒，并保持在冰上。将两种准备好的溶液以一比三的比例混合，使DMSO蛋白酶抑制剂和等电点标准梯的最终浓度为一 X，毛细管中的蛋白质达到最终所需的浓度。

将蛋白质添加到样品混合物中后，所有步骤都将在冰上或四摄氏度下执行。在冰上放置一个384井的盘子。根据采用自动西式印迹系统软件设计的测定模板布局，将样品的10微升混合到合适的板材井中。

在此之后，用抗体稀释剂稀释初级抗体和次级抗体。然后，移液器将10微升的初级抗体和15个微升的二级抗体进入每个井。接下来，将发光醇和过氧化物 XDR 混合在一对一的比例中。

移液器 15 微升的过氧化光混合到每个井中。将样品和罐板添加到板中后，在 2500 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以旋转液体并清除气泡。如果气泡仍然存在，请使用薄移液器尖端手动清除气泡。

打开自动西方印迹系统软件，然后从文件菜单中单击"新"。转到布局窗格，并分配 384 井板中里根和样品的位置。通过单击块中任意位置的井来执行里根任务。

选择一排块，每个井有 12 个孔。接下来，转到布局窗格工具栏并插入示例、主、辅助或发光行块。转到协议窗格，并在板中选择一个里根位置。

然后，单击示例列中的单元格，然后从下拉菜单中选择里根。以相同的方式，为每个周期选择主、辅助和发光的里根位置。在初级抗体或二级抗体列中一次单击一个细胞，如有必要，更改孵育时间。

然后，通过单击协议部分中的"添加"按钮来添加周期。在模板窗格中，输入与样本相关的信息，例如初级抗体和二级抗体的身份、其目录号和稀释。保存新的检测文件。

在单击"开始"按钮之前，请快速检查布局以确保一切正确。现在，单击"开始"开始运行。该软件将提示用户清除废物，重新填充水和毛细管盒，添加酒精和脂肪到资源托盘，添加洗涤缓冲液，并将板装入冷却样品托盘。

运行开始几分钟后，计算机屏幕上将显示一个仪器状态栏。单击运行摘要屏幕以查看状态和分离窗格。要观察毛细管中的电泳分离，请通过单击所需的循环，然后单击控制面板中的播放按钮来播放该毛细管的分离影片。

打开运行文件并选择分析屏幕选项卡。单击"编辑"，然后分析"以更改等电点范围。应用适当的等电点标准。

添加峰值拟合，并添加峰值名称。最后，选择要在峰值选项卡中使用的数据并导出数据以进行进一步分析。此处显示了血管内皮生长因子刺激解酶的磷酸化细胞外信号调节激酶的电谱图。

有非常高的诱导磷酸化蛋白质观察到与血管内皮生长因子。插图显示了内源载荷控制 HSP 70，表示未处理和经过处理的样品的样品负载相似。在传统的免疫blot中，只有两个波段被检测到，即使通过毛细管等电聚焦分析将磷酸化细胞外信号调节激酶蛋白解析为四个峰值。

此处显示了血管内皮生长因子刺激的细胞外信号调节激酶的电谱图。插图显示并行使用的相同加载控件。传统的免疫blot只显示两个对应于细胞外信号调节激酶1和细胞外信号调节激酶2的波段。

而与毛细管等电聚焦，细胞外信号调节激酶蛋白被分解成六个峰，对应于所有四个不同的磷酸化峰和两个非磷酸化峰。掌握后，如果执行得当，此技术可以在几个小时内完成，具体取决于周期数。在尝试此程序时，重要的是要记住使用比传统免疫布洛茨更高的抗体浓度。

这种方法的视觉演示至关重要，因为检测步骤由于技巧（如去除气泡、加载板板等）而难以学习。看完此视频后，您应该对如何设计分析、准备样品、运行分析以及分析数据以观察蛋白质的不同异构形式有充分的了解。