Name: 毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习毛细管等电聚焦技术用于蛋白质亚型的高灵敏度定量检测。该方法具有高通量、可重复性强的特点，适用于生物标志物发现、药物筛选和疾病诊断研究。

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作者感谢瑞典乌普萨拉大学的Lena Claesson-Welsh教授对本项目开发提供的支持。此外，作者感谢乌普萨拉大学的Ross Smith和Lena Claesson-Welsh对稿件提出的审阅意见和改进建议。

1. 细胞培养、刺激与裂解
注意：该方法可与多种细胞类型联用。为说明该方法，本文以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为例进行描述。
<ol>
	<li>在明胶包被的10 cm培养皿中，使用添加了适当补充剂的基础内皮细胞培养基（参见材料表），并含有5%胎牛血清（FCS）、表皮生长因子（5 ng/mL）、血管内皮生长因子（VEGF：0.5 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子（20 ng/mL）、氢化可的松（0.2 µg/mL）和抗坏血酸（1 µg/mL），培养HUVECs细胞。</li>
	<li>使用添加1% FCS但不含生长因子补充剂的基础内皮细胞培养基对细胞进行过夜饥饿处理。</li>
	<li>吸除全部培养基，在一个培养皿中加入2 mL不含生长因子的内皮细胞培养基（饥饿培养基）作为对照；在另一培养皿中加入含50 ng/mL VEGF的2 mL饥饿培养基，作用7分钟。</li>
	<li>吸除培养基，并用10 mL室温PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>确保培养皿置于冰上，并从本步骤起始终保持在冰上操作。</li>
	<li>向每个10 cm培养皿中加入250–400 µL预冷的裂解缓冲液（Bicine/CHAPS；参见材料表），其中包含水溶性蛋白酶抑制剂混合物和DMSO抑制剂混合物（磷酸酶抑制剂；参见材料表）。轻轻晃动培养皿以确保充分覆盖，冰上孵育10分钟。 
	注：蛋白酶抑制剂混合物和DMSO抑制剂混合物的终浓度应为1x。</li>
	<li>用细胞刮刀刮下细胞，转移至预冷的微量离心管中，上下吹打5次以裂解细胞。</li>
	<li>在4 °C下短暂超声处理细胞。设定超声仪参数如下：循环次数 = 5，功率 = 低，开启时间 = 5秒，关闭时间 = 30秒。此步骤旨在降解核酸，而非进一步裂解细胞。 
	注：超声处理应温和，以防止蛋白质变性。</li>
	<li>涡旋振荡管子，每次2秒，共3次（总时长不超过5秒），然后置于冰上。</li>
	<li>在4 °C下以14,000 × g离心15分钟澄清裂解液，立即小心转移上清液至洁净的预冷微量离心管中。</li>
	<li>使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度4。</li>
	<li>将样品分装为每份10 µL，置于干冰或液氮中速冻，随后储存在-80 °C直至使用。</li>
</ol>
2. 样品混合液的制备（150 µL 样品混合液的计算）
<ol>
	<li>首先，通过将1 µL DMSO抑制剂混合液（50倍储存液）和2 µL蛋白酶抑制剂（25倍储存液）加入47 µL样品稀释液中，制备样品稀释液混合液（参见 材料表），使DMSO抑制剂和蛋白酶抑制剂的终浓度为1×。接着，使用样品稀释液混合物稀释蛋白裂解液，以获得所需的浓度（见步骤2.3）。</li>
	<li>通过添加 3.325 µL 标准分子量标记物（参见 材料表；60倍储存液），6 µL 蛋白酶抑制剂（25倍），3 µL DMSO（50倍）抑制剂加入137.675 µL 两性电解质预混液中（参见 材料表). 涡旋振荡管至少15秒，每次5秒，重复3-4次，并置于冰上。</li>
	<li>将步骤 2.1 和 2.2 的溶液按 1:3 的比例混合，使 DMSO、蛋白酶抑制剂和等电点标准蛋白梯度的终浓度均为 1X，毛细管中的蛋白质达到最终所需浓度（例如，使用了50 µg/mL 图2). 
	注意：毛细管和孔中的蛋白质浓度相同。</li>
	<li>根据384孔板检测模板布局，将10 µL样品混合物加入相应的孔中（参见步骤3和 图1并将培养板置于冰上。</li>
	<li>用抗体稀释液稀释一抗（pERK1/2，1:50；ERK1/2，1:100；HSP 70，1:500）和二抗（1:300）（参见 材料表加入10 µL一抗和15 µL二抗至各孔中。 
	注意：与常规的蛋白质印迹法相比，cIEF 分析通常需要更高浓度的抗体。</li>
	<li>混合Luminol与过氧化物XDR（1:1比例；参见 材料表将两者混合后，每孔加入15 µL。 
	注意：每次使用前需新鲜配制这些溶液，并置于冰上保存。</li>
	<li>将样本和所有试剂加入孔板后，于4 °C条件下以2,500 × g离心10分钟，使液体沉降至管底并去除气泡。若仍有气泡残留，可用细小的移液枪头手动去除。 
	注意：每个孔中加入的样品或试剂体积不得超过 20 µL，否则仪器的移液针无法正常清洗。请严格按照试剂生产商提供的说明书配制所有试剂。</li>
</ol>
3. 使用系统软件设计新的检测模板（图1）
<ol>
	<li>打开系统软件并点击 &#34;新&#34; 从“文件”菜单中。</li>
	<li>转到布局面板，在384孔板中为试剂和样本分配位置。每块384孔板最多使用96个孔。</li>
	<li>通过点击任意一个孔来分配试剂。选择每行包含12个孔的孔板区域。孔， 例如默认情况下，编号从1-12或13-24的组会作为一个整体进行分配。</li>
	<li>转到布局窗格工具栏，插入一个空行块，或样本、一抗、二抗或鲁米诺行块。每个块分配有不同的颜色，便于区分。 
	注意：单击某个孔时，可在面板中看到新块将插入位置的周围出现黑色边框。行块也可被删除。</li>
	<li>转到方案面板，选择板上的试剂位置。然后点击样本列中的一个单元格，从下拉菜单中选择试剂。</li>
	<li>以相同方式，为每个循环选择一抗、二抗和鲁米诺的试剂位置。</li>
	<li>依次点击主要或次要抗体列中的细胞，如有必要，更改孵育时间。 
	注意：也可为每个周期添加备注。</li>
	<li>通过点击方案部分的“添加”按钮来增加循环次数。可选择添加1个循环、4个循环或全部循环&#160;（最多可向该方案中添加8个循环）。 
	注意：在此步骤中，可以复制并粘贴循环信息：选择一个循环，进入编辑，进行复制和粘贴。</li>
	<li>输入与样品相关的信息，例如一抗和二抗的名称、货号及稀释比例， 等等。，位于模板窗格中。此步骤为可选，但在运行后分析期间非常有用。</li>
	<li>保存新的检测文件。在单击“开始”按钮之前，快速检查布局，确保所有设置均正确无误。</li>
</ol>
4. cIEF 仪器设置方案
<ol>
	<li>设置毛细管等电聚焦电泳分离条件。功率应为15,000 µW，时间为40分钟，紫外光固定时间为80秒。然而，紫外光固定时间可在80–140秒范围内设置，可能需要根据目标蛋白进行优化。 
	注意：每个循环可设置一个紫外光固定时间点，但不能针对每根毛细管单独设置。</li>
	<li>设置洗涤1步骤为1–2次洗涤，每次150秒（默认），一抗孵育时间为120分钟。</li>
	<li>设置洗涤2步骤为2次洗涤，每次150秒（默认），二抗孵育时间为60分钟。</li>
	<li>设置洗涤3步骤，应为2次洗涤，每次150秒（默认）。</li>
	<li>设置化学发光检测时的曝光时间，分别为30、60、120、240、490和960秒。所有步骤（1–8）将在同一根毛细管中完成。</li>
</ol>
5. 运行检测文件
<ol>
	<li>一切准备就绪后，单击“开始”以启动运行。软件将提示您移除废液，重新加注水和毛细管盒，向试剂资源托盘中添加阳极液和阴极液，加入洗涤缓冲液，最后将样品板装入冷却的样品托盘中。 
	注意：请取下毛细管盒的盖子，但不要取下检测板的盖子。检测板的盖子可在必要时由仪器自动移除。这有助于防止试剂蒸发。</li>
	<li>运行开始几分钟后，计算机屏幕上将显示仪器状态栏。可看到对应于仪器当前阶段的状态信息和进度条。 
	注意：初始阶段，仪器会首先检查所有设置是否正确，然后继续将阳极液和阴极液移取至分离托盘，拾取第一组12根毛细管，移除样品板盖子，将样品从样品板转移至毛细管中，最后将样品送入分离室进行电泳。</li>
	<li>单击运行摘要界面，可看到两个窗格：状态和分离。用户可查看运行进度，且在每个循环的电泳步骤完成后，可保存该循环的分离过程视频（包含12根毛细管）。如需观察某根毛细管中的电泳分离过程，请在控制面板中选择相应的循环编号，然后单击播放按钮以播放该毛细管的分离视频。</li>
	<li>运行结束后，运行文件将自动保存。</li>
</ol>
6. 分析数据（图 S1）
<ol>
	<li>打开运行文件并选择分析界面选项卡。在 图 S1A，样本图中显示的数据（峰）来自所选毛细管即, 4th 毛细管（来自第1个循环）。</li>
	<li>点击编辑，然后选择分析（图 S1B在此阶段，用户可更改等电点（pI）范围，应用适合特定实验的pI标准，添加峰拟合，并命名峰。 
	注意：当使用pH 5-8两性电解质预混液（如此处所示）时，推荐使用的标准蛋白梯度标记物为含有等电点（pI）分别为4.9、6.0、6.4、7.0和7.3的荧光标记肽段；当使用pH 3-10预混液时，推荐的梯度标记物其pI值分别为4.0、4.9、6.0、6.4和7.3。2</li>
	<li>结果在“峰”选项卡中显示；样品显示的数值包括峰位置、等电点（pI）、峰高和峰面积、峰面积百分比（% Area）、峰宽以及信噪比（S/N）图 S1C）。选择要使用哪些数据，并导出数据以进行进一步分析。 
	注意：只有在标记峰之后才能导出数据图 S1C).</li>
</ol>

<ol><li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li>
<li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li>
<li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li>
<li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li>
<li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li>
<li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li>
<li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6(2016).</li>
<li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994(2016).</li>
<li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li>
</ol>

作者无披露信息。

蛋白质的灵敏度和分辨率对于生物样本的蛋白质组学研究至关重要。能够检测细胞中微量存在的蛋白质具有重要意义。毛细管等电聚焦电泳（cIEF）可提高蛋白质及其亚型检测的灵敏度和分辨率4。
该技术已成功应用于多项蛋白质组学研究报告中5,6,7。然而，该技术仍存在一些局限性，例如，并非所有在传统免疫印迹中表现良好的一抗均能产生信号。由于该技术较新，目前尚无经过验证、确认可在cIEF中有效工作的抗体列表。最后，仪器每次运行的样本数量不能少于12个，也不能超过96个。
毛细管等电聚焦电泳（cIEF）是传统免疫印迹法的一种替代技术，但其结果可能与后者不完全相同。研究表明，cIEF 在灵敏度和分辨率方面显著优于传统免疫印迹法。此外，cIEF 具有高通量、稳定性好、自动化、机器人化以及高灵敏度等优点，根据不同分析的蛋...

毛细管等电聚焦（cIEF）是一种基于毛细管的自动化免疫分析方法，可根据蛋白质的电荷特性对其进行分离1,2,3。该方法具有高度可重复性，能够快速、定量地分辨蛋白质及其翻译后修饰的异构体，为传统方法（如蛋白质印迹法）提供了一种替代选择。尽管蛋白质印迹法在检测易获取样本中高丰度蛋白质的存在方面表现良好，但在分析生物组织样本时，其变异性、耗时性以及准确定量等方面仍存在挑战。事实上，蛋白质印迹法本身存在固有的变异性问题，因其涉及多个操作步骤，包括SDS-PAGE凝胶的上样与电泳、蛋白质向膜上的转印、与多种试剂（例如，一抗和二抗、ECL）的孵育，以及在X射线胶片上的显影4。目前，随着化学发光信号的数字化记录技术（数字印迹法）的应用，蛋白质印迹技术正在不断改进。最近已开发出一种自动化蛋白质印迹系统，即毛细管印迹系统（capillary western），该系统无需手动操作且无需凝胶。整个检测过程在将样品板（包含所有必要试剂的样品）加载至系统后即可自动完成3,4。仪器将自动执行所有步骤，包括蛋白质分离、蛋白质在毛细管壁上的固定、抗体孵育、各步骤间的洗涤，以及化学发光信号的显影与定量。因此，本文所介绍的cIEF方法具有更高的分辨率和灵敏度。
该方法具有高灵敏度，可从皮克级别的蛋白质中产生并量化信号1。其高灵敏度和优异的重复性使该技术在临床样本分析中极具应用价值。该技术不仅能够检测蛋白质，还可区分其翻译后修饰（例如，不同磷酸化形式的蛋白质亚型）。该技术已成功应用于解析多种信号通路4,5，在旨在开发癌症新疗法的临床研究中发挥了重要作用3，并在蛋白质生物标志物发现和药物研发方面展现出巨大潜力。

<table><tbody><tr><td>NanoPro 1000</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 5&amp;ndash;8（嵌套）分离梯度Premix G2，pH 2&amp;ndash;4插塞</td><td>ProteinSimple</td><td>040-972</td><td>两性电解质预混液</td></tr><tr><td>DMSO抑制剂混合液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-510</td><td>磷酸酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:50</td></tr><tr><td>水相抑制剂混合液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-482</td><td>蛋白酶抑制剂；用于cIEF，使用时稀释1:25</td></tr><tr><td>pI标准梯度3</td><td>ProteinSimple</td><td>040-646</td><td>用于cIEF，使用时稀释1:60</td></tr><tr><td>样品稀释液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-649</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释液&amp;nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>040-309</td><td></td></tr><tr><td>洗涤浓缩液</td><td>ProteinSimple</td><td>041-108</td><td></td></tr><tr><td>阳极液补充液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-337</td><td></td></tr><tr><td>阴极液补充液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-338</td><td></td></tr><tr><td>过氧化物XDR</td><td>ProteinSimple</td><td>041-084</td><td></td></tr><tr><td>鲁米诺</td><td>ProteinSimple</td><td>040-652</td><td></td></tr><tr><td>Bicine/CHAPS裂解缓冲液</td><td>ProteinSimple</td><td>040-764</td><td></td></tr><tr><td>电荷分离毛细管（1包）用于&amp;nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>CBS700</td><td></td></tr><tr><td>检测板/盖板套件</td><td>ProteinSimple</td><td>040-663</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>711-035-152</td><td>用于cIEF（1:300）</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>715-035-150</td><td>用于cIEF（1:300）</td></tr><tr><td>磷酸化Erk 1/2一抗</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td>用于cIEF（1:50）</td></tr><tr><td>总Erk一抗</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td>用于cIEF（1:100）</td></tr><tr><td>Compass软件</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-010</td><td></td></tr><tr><td>MV2（EBM-2）</td><td>PromoCell</td><td>&amp;nbsp;C-22221</td><td>内皮细胞基础培养基</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基MV2补充剂套装</td><td>PromoCell</td><td>C-39221</td><td>用于上述MV2培养基的补充</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Long R3 IGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85580C/I1146</td><td>类胰岛素生长因子</td></tr><tr><td>Bioruptor（超声破碎仪）</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（20X）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE转移缓冲液（20X）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0006</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机用微量滴定板适配器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

免疫印迹已成为许多实验室从生物样品中进行蛋白质表征的常规技术。以下方案提供了一种替代策略——毛细管等电聚焦（cIEF），相较于传统的免疫印迹具有诸多优势。该方法基于抗体检测，是一种自动化、快速且可定量的技术，整个蛋白质印迹过程均在超细毛细管内完成。该技术无需使用凝胶和转膜、无需洗脱抗体、也无需X光胶片，而这些通常是传统免疫印迹所必需的步骤。在此方法中，蛋白质根据其电荷（等电点；pI）进行分离，仅需不到1微升（400 nL）的总蛋白裂解液。电泳完成后，蛋白质通过紫外光处理固定在毛细管内壁上，随后依次与一抗和二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记）孵育，通过增强型化学发光（ECL）检测抗体结合情况，产生可被电荷耦合器件（CCD）相机捕获并记录的光信号。所得数字图像可通过软件进行分析和定量（峰面积）。该高通量方法可同时处理96个样品，灵敏度极高，可检测皮克（pg）级别的蛋白质，并因自动化操作而具有高度可重复性。当样品数量有限（例如，组织样本和活检样本）时，这些优势尤为突出。该技术还具有更广泛的应用前景，包括药物或抗体筛选、生物标志物发现以及诊断用途。

新检测方法的设计：检测板布局如图1A所示。在384孔板中，最多可使用96个孔，每12个孔组成一个区块，用于每个实验条件（抗体）。每个12孔区块可从A1-A12或A13-A24开始。通过颜色编码的行可区分不同的样品或试剂。图1B所示的检测模板中可存储该特定检测的相关信息，供后续结果分析阶段使用。图1C展示了实验流程的概要。
检测经 VEGF 刺激的 HUVEC 裂解液中磷酸化与非磷酸化细胞外调节激酶（pERK1/2 和 ERK1/2）蛋白：通常，翻译后修饰蛋白（如磷酸化蛋白）由于含量低、存在时间短暂以及特异性抗体缺乏，难以被检测。在血清饥饿后经血管内皮生长因子（VEGF）刺激，可激活受体酪氨酸激酶（VEGFR2...

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的超灵敏、高通量技术，能够从极微量的生物样品中对蛋白质及其亚型进行详细表征。以下描述了一种自动化和机器人化检测与定量特定蛋白质及其亚型的实验方案。

免疫印迹已成为许多实验室从生物样品中进行蛋白质表征的常规技术。以下方案提供……

该方法有助于回答生物医学研究领域中的关键问题，例如生物标志物发现、药物研发、诊断以及药物或抗体的筛选。该技术的主要优势在于其高通量特性，能够以高度可重复的方式检测蛋白质异构体。该技术的应用前景广泛，可用于多种疾病的诊断，因为它能够检测受疾病影响的蛋白质或其异构体。尽管该方法可用于研究细胞信号通路，但也可应用于其他需要分析特定蛋白质的系统。由于实验步骤中包含去除气泡、加样到孔板等技巧，难以掌握，因此对该方法的可视化演示至关重要。首先，通过将1微升DMSO抑制剂混合液和2微升蛋白酶抑制剂加入47微升样品稀释液中，配制样品稀释液混合液，使DMSO和蛋白酶抑制剂的终浓度为1 X。使用该样品稀释液混合液稀释先前分离的蛋白裂解液，以获得所需的蛋白浓度。接下来，将 3.325 µL 的等电点标准品梯度、6 µL 蛋白酶抑制剂和 3 µL DMSO 抑制剂加入 137.675 µL 的 Antholite 预混液中。涡旋混匀样品至少 15 秒，并置于冰上保存。将上述两种制备好的溶液按 1:3 的比例混合，使 DMSO 蛋白酶抑制剂和等电点标准品梯度的终浓度均为 1×，同时使毛细管中的蛋白质达到预期的最终浓度。加入蛋白质到样品混合物后，所有步骤均需在冰上或4摄氏度条件下进行。将一块384孔板放置在冰上。根据自动Western印迹系统软件设计的检测模板布局，向板中的相应孔加入10 µL样品混合物。随后，用抗体稀释液稀释一抗和二抗。然后，向每个孔中加入10 µL一抗和15 µL二抗。接下来，将发光剂（luminol）和过氧化物XDR按1:1的比例混合。向每个孔中加入15微升鲁米诺过氧化物混合液。待样品和试剂加入到板中后，在4摄氏度、2500 × g条件下离心10分钟，以沉淀液体并去除气泡。若仍有气泡存在，可用细小的移液器吸头手动去除。打开全自动 Western 杂交系统软件，从文件菜单中点击“新建”。进入布局面板，在 384 孔板中为试剂和样品指定位置。通过单击任意一个孔块中的孔来完成试剂的分配。选择一个包含12个孔的行区块。接着，转到布局窗格工具栏，插入一个样本、一抗、二抗或鲁米诺行区块。进入方案窗格，选择试剂在板上的位置。然后，点击样本列中的单元格，并从下拉菜单中选择试剂。以相同方式，为每个循环选择一抗、二抗和鲁米诺的试剂位置。依次点击一抗或二抗列中的各个单元格，并根据需要修改孵育时间。然后，在方案部分点击“添加”按钮以增加循环步骤。在模板窗格中，输入与样品相关的信息，例如一抗和二抗的名称、目录编号及其稀释比例。保存新的检测文件。点击“开始”按钮前，请快速检查布局，确保所有设置正确无误。现在，点击“开始”以启动运行。软件将提示用户移除废液，重新加注水和毛细管盒，向试剂槽中添加阳极液和阴极液，加入洗涤缓冲液，并将微孔板加载到冷却的样品托盘中。运行开始几分钟后，计算机屏幕上将显示仪器状态栏。单击运行摘要界面以查看状态和分离窗格。要观察毛细管中的电泳分离过程，请在控制面板中先单击选择所需的循环，然后单击播放按钮，播放该毛细管的分离动画。打开运行文件，选择分析界面选项卡。点击“编辑”，然后选择“分析”以更改等电点范围。应用相应的等电点标准。添加峰拟合，并命名峰。最后，在峰标签中选择要使用的数据，并导出数据以进行进一步分析。此处显示的是经血管内皮生长因子刺激的裂解液中磷酸化细胞外信号调节激酶的电泳图谱。使用血管内皮生长因子处理后，观察到磷酸化蛋白的诱导水平非常高。插图显示了内源性上样对照 HSP 70，表明未处理和处理样本的上样量相似。在传统的免疫印迹实验中，仅检测到两条条带，而毛细管等电聚焦分析则将磷酸化的细胞外信号调节激酶蛋白分离为四个峰。此处显示的是经血管内皮生长因子刺激的裂解液中细胞外信号调节激酶的电泳图谱。插图显示了平行实验中使用的相同上样对照。传统的免疫印迹仅显示两条条带，分别对应于细胞外信号调节激酶1和细胞外信号调节激酶2。采用毛细管等电聚焦技术时，细胞外信号调节激酶蛋白被分离为六个峰，分别对应四种不同的磷酸化形式峰和两种非磷酸化形式峰。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数小时内完成，具体时间取决于循环次数。在进行该实验时，需注意使用比常规免疫印迹更高的抗体浓度。该方法的可视化演示至关重要，因为实验步骤中包含一些技巧（例如去除气泡、加样到孔板等），难以通过文字描述掌握。观看本视频后，您将能够充分理解如何设计实验、准备样品、运行检测以及分析数据，从而观察目标蛋白的不同亚型。

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毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

本视频演示了一种毛细管电泳免疫分析方案，用于检测人血小板中与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的蛋白质生物标志物。通过基于分子大小对血小板蛋白进行分离，随后进行化学发光检测，从而确认ALS生物标志物蛋白的存在。...

一种用于蛋白质生物标志物检测的毛细管电泳免疫分析法

本文介绍了一种全面的毛细管区带电泳方案，用于评估单克隆抗体作为质量属性的内在理化异质性。...

使用中性毛细管进行单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

介绍了一种基于毛细管的免疫分析方法，利用商业平台从总蛋白样品中检测目标蛋白。此外，针对细胞培养模型系统，优化了曝光时间、蛋白浓度和抗体稀释度等分析参数。...

基于自动化毛细管电泳免疫分析方法的实验步骤与关键优化策略

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。...

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

本研究的目的是利用液相等电聚焦（IEF）方法，从复杂的植物提取物中分离和纯化具有生物活性的小分子化合物、多肽，以及从病原微生物中分离蛋白质。随后对分离得到的分子进行鉴定，并验证其生物活性。...

通过制备型等电聚焦（IEF）方法分离天然来源的生物活性小分子、多肽及微生物蛋白

本文描述了一种用于对哺乳动物细胞提取物中的肌醇焦磷酸盐进行绝对定量的毛细管电泳-电喷雾电离质谱分析方法。...

毛细管电泳电喷雾电离质谱法对肌醇焦磷酸的绝对定量

本方案描述了使用定制的便携式FRET分析仪对荧光共振能量转移（FRET）传感器数据进行快速且高灵敏度定量的方法。该设备用于在可最大化检测灵敏度的关键温度范围内检测麦芽糖，从而实现对糖含量的实用且高效的评估。...

高灵敏度快速荧光检测结合便携式FRET分析仪

我们已成功建立了一种从富含油脂、蛋白质和多酚的植物种子中分离RNA的方法，这些成分会抑制高纯度RNA的提取。本方法适用于检测种子中低丰度转录本基因的表达。...

一种高效分离高纯度种子RNA用于定量转录组分析的方法

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

学习毛细管等电聚焦技术用于蛋白质亚型的高灵敏度定量检测。该方法具有高通量、可重复性强的特点，适用于生物标志物发现、药物筛选和疾病诊断研究。

通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

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