内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白

在这里，我们报告了检测人类细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的方案，并通过使用固定（多聚甲醛、丙酮或甲醇固定）的间接免疫荧光染色来定量着丝粒-着丝粒的这些蛋白质水平。

这种间接免疫荧光测定的总体目标是优化人细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的定位和定量，包括着丝粒蛋白 A 和 flag 标记的外源性 CENP-A 蛋白。该方法可以帮助回答有关如何识别和定量着丝粒-着丝粒蛋白的关键问题。该技术的主要优点是，它可用于根据所选的目标后期定量不同水平的着丝粒-着丝粒表达。

接种后 18 小时，用 PBS 洗涤培养的细胞一次，并向 6 孔聚苯乙烯培养板的每个孔中加入 500 微升还原血清培养基。接下来，用新鲜制备的 A 和 B 混合物溶液转染每个孔中的细胞，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物。四个半小时后，将补充有 FBS 和抗生素的中高葡萄糖 DMEM 更换为高葡萄糖，并将板放回细胞培养箱中。

48 至 72 小时后，吸出细胞培养基并用 PBS 冲洗细胞一次，沿培养孔侧面加入盐水，以避免干扰细胞。然后用 4% 多聚甲醛在 4 摄氏度下固定细胞 30 分钟。固定期结束时，用 Kb2 缓冲液冲洗细胞 2 次，并在室温下在 Kb1 缓冲液中透化样品 30 分钟。

然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞一次，并加入新鲜的 Kb2 缓冲液阻断任何非特异性结合。在室温下 5 分钟后，用镊子从每个孔中取出带种子的盖玻片，并使用疏水屏障笔在每个盖玻片样品周围绘制疏水屏障。将盖玻片转移到新的六孔聚苯乙烯板中，将样品在 37 °C 下浸入适当的一抗中 1 小时。

然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞 3 次，并用适当的二抗在 37 摄氏度下再标记一小时。孵育结束时，在 Kb2 缓冲液中洗涤 5 次 6 分钟，冲洗样品。然后用含有 DapE 的 Kb3 缓冲液在室温下标记细胞核 5 分钟，然后在 Kb2 缓冲液中洗涤 1 至 2 次，并用 Kb2 缓冲液重新填充孔。

现在，将一滴封固剂滴在每个细胞盖玻片的显微镜载玻片的中心，并去除细胞样品中的所有液体。最后，小心地将每个样品放在其中一个准备好的显微镜载玻片的中心，并用纸巾去除任何多余的封固剂。如本代表性实验所示，CUL4A siRNA 转染细胞总细胞裂解物中内源性 CENP-A 蛋白表达水平与荧光素酶 siRNA 转染细胞中 CENP-A 表达水平相似。

此外，RBX1 siRNA 转染细胞总细胞裂解物中内源性 CENP-A 的蛋白水平与荧光素酶 siRNA 转染细胞的内源性 CENP-A 水平相似，表明 CUL4A RBX1 E3 连接酶是 CENP-A 定位到着丝粒所必需的。CENP-A 赖氨酸突变体失去了在着丝粒内定位的能力，表明 CENP-A K124 泛素化对于 CENP-A 定位到着丝粒至关重要。重要的是，CENP-A 蛋白的外源单泛素融合挽救了离位 CENP-A K124R 突变体，使该蛋白返回到其着丝粒位置。

一旦掌握，如果作得当，细胞固定和免疫荧光染色程序可以在 5 到 6 小时内完成。请记住将所有溶液轻轻涂抹在孔的侧面，这样在冲洗或浸入样品时细胞就不会从盖玻片上脱落。不要忘记，在通风的房间外使用加热的多聚甲醛或靠近火源的易燃材料可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。