内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白
2016年3月3日
在这里，我们报告了检测人类细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的方案，并通过使用固定（多聚甲醛、丙酮或甲醇固定）的间接免疫荧光染色来定量着丝粒-着丝粒的这些蛋白质水平。
这种间接免疫荧光测定的总体目标是优化人细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的定位和定量，包括着丝粒蛋白 A 和 flag 标记的外源性 CENP-A 蛋白。该方法可以帮助回答有关如何识别和定量着丝粒-着丝粒蛋白的关键问题。该技术的主要优点是，它可用于根据所选的目标后期定量不同水平的着丝粒-着丝粒表达。
接种后 18 小时，用 PBS 洗涤培养的细胞一次，并向 6 孔聚苯乙烯培养板的每个孔中加入 500 微升还原血清培养基。接下来，用新鲜制备的 A 和 B 混合物溶液转染每个孔中的细胞，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物。四个半小时后，将补充有 FBS 和抗生素的中高葡萄糖 DMEM 更换为高葡萄糖，并将板放回细胞培养箱中。
48 至 72 小时后，吸出细胞培养基并用 PBS 冲洗细胞一次，沿培养孔侧面加入盐水，以避免干扰细胞。然后用 4% 多聚甲醛在 4 摄氏度下固定细胞 30 分钟。固定期结束时，用 Kb2 缓冲液冲洗细胞 2 次，并在室温下在 Kb1 缓冲液中透化样品 30 分钟。
然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞一次，并加入新鲜的 Kb2 缓冲液阻断任何非特异性结合。在室温下 5 分钟后，用镊子从每个孔中取出带种子的盖玻片，并使用疏水屏障笔在每个盖玻片样品周围绘制疏水屏障。将盖玻片转移到新的六孔聚苯乙烯板中，将样品在 37 °C 下浸入适当的一抗中 1 小时。
然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞 3 次，并用适当的二抗在 37 摄氏度下再标记一小时。孵育结束时，在 Kb2 缓冲液中洗涤 5 次 6 分钟，冲洗样品。然后用含有 DapE 的 Kb3 缓冲液在室温下标记细胞核 5 分钟，然后在 Kb2 缓冲液中洗涤 1 至 2 次，并用 Kb2 缓冲液重新填充孔。
现在，将一滴封固剂滴在每个细胞盖玻片的显微镜载玻片的中心，并去除细胞样品中的所有液体。最后，小心地将每个样品放在其中一个准备好的显微镜载玻片的中心，并用纸巾去除任何多余的封固剂。如本代表性实验所示，CUL4A siRNA 转染细胞总细胞裂解物中内源性 CENP-A 蛋白表达水平与荧光素酶 siRNA 转染细胞中 CENP-A 表达水平相似。
此外，RBX1 siRNA 转染细胞总细胞裂解物中内源性 CENP-A 的蛋白水平与荧光素酶 siRNA 转染细胞的内源性 CENP-A 水平相似，表明 CUL4A RBX1 E3 连接酶是 CENP-A 定位到着丝粒所必需的。CENP-A 赖氨酸突变体失去了在着丝粒内定位的能力，表明 CENP-A K124 泛素化对于 CENP-A 定位到着丝粒至关重要。重要的是，CENP-A 蛋白的外源单泛素融合挽救了离位 CENP-A K124R 突变体，使该蛋白返回到其着丝粒位置。
一旦掌握，如果作得当，细胞固定和免疫荧光染色程序可以在 5 到 6 小时内完成。请记住将所有溶液轻轻涂抹在孔的侧面，这样在冲洗或浸入样品时细胞就不会从盖玻片上脱落。不要忘记，在通风的房间外使用加热的多聚甲醛或靠近火源的易燃材料可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。
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概述
本研究提出了使用间接免疫荧光染色检测和定量人类细胞中着丝粒-动粒蛋白的方法。这些方法涉及多种固定技术，以优化这些蛋白的定位。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 蛋白质分析
背景
- 着丝粒-动粒蛋白在细胞分裂中起着至关重要的作用。
- 了解它们的定位和表达水平对细胞生物学研究至关重要。
- 间接免疫荧光染色是研究这些蛋白的常用技术。
- 不同的固定方法可能影响这些蛋白的检测。
研究目的
- 优化内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的定位。
- 定量人类细胞中着丝粒-动粒蛋白的水平。
- 为该领域的研究人员提供可靠的实验方案。
使用的方法
- 间接免疫荧光染色技术。
- 使用甲醛、丙酮或甲醇固定方法。
- 用特定蛋白质构建体转染培养细胞。
- 孵育和更换培养基以优化蛋白表达。
主要结果
- 成功定位着丝粒蛋白A和带标签的CENP-A蛋白。
- 在不同的后期阶段定量蛋白水平。
- 证明了各种固定方法的有效性。
- 提供了可以适应不同实验需求的方案。
结论
- 该研究为研究着丝粒-动粒蛋白提供了一种可靠的方法。
- 研究结果可以增进对细胞分裂过程中蛋白动力学的理解。
- 这些实验方案可用于未来的细胞生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative immunofluorescence analysis of centromere-kinetochore proteins enables precise interrogation of chromosome segregation mechanisms, a critical inflection point in cell division research. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for discovery-stage programs focused on mitotic regulation. Robust localization and quantification workflows for endogenous and exogenous proteins facilitate portfolio decisions in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of centromere-kinetochore protein localization in human cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic or chemical perturbations on protein targeting.
- Facilitates functional validation of candidate targets involved in chromosome segregation fidelity.
- Provides quantitative benchmarks for pathway interrogation and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immunofluorescence protocols adaptable for high-content screening of mitotic regulators.
- Ensures reproducible detection of both endogenous and exogenous protein variants across experimental conditions.
- Enables quantitative readouts suitable for comparative analysis in compound or genetic screens.
- Supports assay standardization for cross-laboratory and cross-platform studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling detection of protein mislocalization linked to chromosomal instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting biomarker quantification in engineered cell systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative protein localization data.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development for lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of centromere-kinetochore protein function and localization.
- Screening: Provides quantitative, reproducible immunofluorescence readouts for screening campaigns targeting mitotic pathways.
- Analytics: Supports statistical comparison of protein localization and expression across experimental groups.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by quantifying protein mislocalization relevant to chromosomal instability syndromes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in mitotic pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable protocols for reproducible immunofluorescence analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and programs based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to validated antibodies and high-quality imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of fixation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for specific protein tags or fixation chemistries.
- Careful handling of hazardous reagents and adherence to safety protocols are essential.
