Name: 内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 学习利用间接免疫荧光染色技术检测和定量分析人类细胞中的内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白，包括着丝粒蛋白A和Flag标记的CENP-A蛋白，优化不同固定方法以获得最佳定位效果。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM68418 支持。

1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>将一块盖玻片（22 mm × 22 mm）放入6孔聚苯乙烯板中。可选步骤：用0.1%（w/v）水溶液的多聚-L-赖氨酸（见材料与设备列表）包被盖玻片，以确保有丝分裂细胞在后续步骤中牢固附着于盖玻片上。 
	注：每种细胞系和应用都必须确定最佳条件。
	<ol>
		<li>无菌条件下，用0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸水溶液对培养表面进行包被（每孔0.4 ml，适用于6孔聚苯乙烯培养板）。轻柔摇动以确保培养表面均匀覆盖。</li>
		<li>5分钟后，吸除溶液，并用无菌组织培养级水彻底冲洗表面。</li>
		<li>在接种细胞和培养基前，至少干燥 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种HeLa细胞17 或 HeLa Tet-Off 细胞17,22 在6孔聚苯乙烯板中的盖玻片（22 mm × 22 mm）上接种细胞。检查细胞密度是否为5.4 × 105 每孔。使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养细胞。 
	注意：为获得最佳结果，需通过实验确定接种时所用的细胞密度。</li>
	<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在5% CO的环境中2 18 小时。 
	注意：对于 HeLa Tet-Off 细胞，外源基因的转录在无诱导剂存在时处于活跃状态即，四环素/多西环素），因此在无四环素/多西环素的培养基中培养细胞，并瞬时转染 pTRM4 过表达载体（表2），其转录受TRE启动子调控（见下文）。</li>
	<li>接种后18小时，按如下步骤转染细胞：
	<ol>
		<li>通过混合制备溶液A 1.5 µl siRNA 寡核苷酸（20 µM 退火储备液； 表1）和/或 2.0 µg 质粒表2) 在 50 µl 低血清培养基（见材料/设备列表），于室温孵育 5 分钟。 
		注意：在此分析中，CA-UTR siRNA（5' 和 3' UTR siRNA 的混合物）； 表1）在方案3和方案4中共同转染使用（见讨论部分）。</li>
		<li>通过混合制备溶液B 0.75 µl 转染试剂 I（参见材料与设备列表） 50 µl 低血清培养基，室温孵育5分钟。 
		注意：可选步骤是添加 1.0 µl 转染试剂II（参见材料/设备列表）</li>
		<li>将溶液A与溶液B混合，室温孵育15分钟。</li>
		<li>用 PBS 清洗培养的细胞一次，然后加入 500 µl 向6孔聚苯乙烯板的每个孔中加入低血清培养基。加入溶液A和溶液B的混合物（即，将RNA和/或DNA-脂质复合物直接加入每个孔中。 
		注意：终浓度为 3.3 µg/ml （质粒）；50 nM（siRNA）</li>
		<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在5% CO₂的环境中2 孵育4.5小时后，更换为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基。</li>
		<li>在37°C、5% CO₂培养箱中孵育细胞 37 °C 在5% CO的环境中2 转染后48-72小时。 
		注意：为获得最佳结果，固定前细胞生长的孵育时间需通过实验经验确定，并通过Western blot分析确认蛋白质的耗竭和/或表达（参见方案6）。</li>
		<li>如果需要进行有丝分裂细胞分析，在固定前24小时向培养细胞中加入紫杉醇（10 nM），或加入TN16（0.5 µM在固定前 2.5 小时向培养的细胞中加入。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测内源性着丝粒-动粒蛋白的细胞固定与免疫荧光染色（多聚甲醛固定）
<ol>
	<li>固定剂、缓冲液和试剂的制备
	<ol>
		<li>在 PBS（pH 7.4）中新鲜配制 50 ml 的 4% 多聚甲醛溶液。
		<ol>
			<li>在通风橱内的搅拌器上，将 40 ml 1× PBS 加入玻璃烧杯中，边搅拌边加热至约 60 °C加入2 g多聚甲醛粉末至加热的PBS中。</li>
			<li>通过逐滴加入共1 ml的1 N NaOH，缓慢调节pH，因为粉末不会立即溶解。 
			注意：加入 NaOH 后溶液会变澄清。</li>
			<li>一旦甲醛溶解后，冷却并过滤溶液。</li>
			<li>用1 N HCl将pH值调节至7.4，并用1× PBS将溶液定容至50 ml。 
			注意：该溶液的等分试样可冷冻保存或置于 2-8 °C 长达1周。溶液应保持冰冻或储存于 4 °C 直到使用时为止。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 50 ml KB1 缓冲液，包含 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5% BSA 和 0.5% Triton X-100。 
		注意：BSA 应新鲜添加。 
		注：KB系列缓冲液基于此前报道中描述的KB缓冲液。1,2,4</li>
		<li>准备 50 ml KB2 缓冲液，其成分为 10 mM Tris-HCl，pH 7.5；150 mM NaCl；以及 0.5% BSA。 
		注意：BSA 应 freshly 添加。</li>
		<li>准备1 ml含DAPI（50 ng/ml）的KB3缓冲液。</li>
		<li>配制100 ml封片液，其中包含1 mg/ml对苯二胺、10% PBS和90%甘油。
		<ol>
			<li>用 1 N NaOH 将 1× PBS 的 pH 调至 9.8，加入对苯二胺（p-phenylenediamine）溶解，然后加入甘油。</li>
			<li>将1 ml分装样品储存在-80 °C避光。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在转染后48-72小时（见方案1）通过抽吸去除培养基，用于细胞固定。用PBS洗涤细胞一次。沿培养孔壁加入PBS，避免扰动细胞表面。 
	注意：细胞固定的最适时间点需通过实验确定。</li>
	<li>在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛，于室温固定细胞 30 分钟 4 °C用缓冲液KB2冲洗细胞两次，以充分去除残留的4%多聚甲醛。</li>
	<li>在室温下用缓冲液KB1孵育样本30分钟以进行透化处理。用缓冲液KB2洗涤细胞一次，随后加入缓冲液KB2，在室温下孵育5分钟，以封闭非特异性结合位点。 
	注意：缓冲液KB1在阻断中也起到重要作用。</li>
	<li>用镊子从6孔聚苯乙烯板中取出盖玻片（22 mm × 22 mm）。使用疏水屏障笔（见材料与设备清单），在每张盖玻片周围绘制浅绿色的方形或圆形，形成疏水屏障。绘制时避免接触细胞或过于靠近细胞。将盖玻片转移至新的6孔聚苯乙烯板中。</li>
	<li>用 KB2 缓冲液稀释针对着丝粒或动粒蛋白的一抗（稀释比例为 1:100 至 1:200；参见材料与设备列表），同时稀释抗 CENP-B 抗体（稀释比例为 1:400）或抗着丝粒抗体（ACA）（稀释比例为 1:2,000）作为着丝粒定位标记。 
	注意：为获得最佳结果，该溶液中一抗的终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积（约 30 µl) 稀释后的一抗溶液以浸没细胞样本。将细胞样本在室温下孵育1小时 37 °C. 用缓冲液 KB2 清洗细胞 3 次。</li>
	<li>使用 KB2 缓冲液将针对每种一抗的荧光标记二抗稀释（稀释比例为 1:100 至 1:200）。 
	注意：为了获得最佳结果，该溶液中二抗的最终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积（一滴） 约 30 µl 在盖玻片上加入稀释的二抗以浸没细胞样本，在室温下孵育细胞样本1小时 37 °C用缓冲液 KB2 在 30 分钟内冲洗细胞 5 次（每次 6 分钟，共 5 次）。 
	注意：为了获得最佳结果（即，为尽量减少细胞损失，最佳洗涤条件需通过实验确定。</li>
	<li>加入足量含DAPI（50 ng/ml）的KB3缓冲液，浸没细胞样本，在室温下孵育5分钟。用KB2缓冲液冲洗细胞1–2次。</li>
	<li>将含有细胞样本的盖玻片安装到载玻片上。
	<ol>
		<li>在载玻片中央滴加一滴封片介质。</li>
		<li>从细胞样品中移除液体，并用手或镊子将样品置于显微载玻片中央，避免产生气泡。</li>
		<li>用纸巾吸去多余的封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. C端Flag标签CENP-A蛋白的细胞固定与免疫荧光染色（丙酮固定法）
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>配制预冷的75%丙酮。</li>
		<li>现配 50 ml 含 0.5% 脱脂奶粉和 0.5% BSA 的 PBS（pH 7.4）。</li>
		<li>新鲜配制含 0.1% 脱脂奶粉和 0.1% BSA 的 50 ml PBS（pH 7.4）。</li>
		<li>配制 1 ml 含 DAPI（50–100 ng/ml）的 PBS（pH 7.4）。</li>
		<li>按照 2.1.5 节所述方法制备 100 ml 封片介质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在转染后48–72小时，通过抽吸去除培养基（参见方案1），用于细胞固定。用PBS洗涤细胞一次。沿培养孔侧壁加入PBS，避免扰动细胞表面。 
	注意：细胞固定的最适时间点需通过实验确定。</li>
	<li>用预冷的75%丙酮固定细胞，并在-20°C孵育10分钟20 °C在室温下，于通风橱中将盖玻片上的细胞干燥30-60分钟。 
	注意：为了获得最佳结果，固定和细胞干燥所需的时间长度必须通过实验经验确定。</li>
	<li>使用疏水屏障笔（见材料/设备列表），在每块盖玻片样品周围绘制浅绿色的方形或圆形，以形成疏水屏障。操作时避免触碰细胞或过于接近细胞。</li>
	<li>通过加入含0.5%脱脂奶粉和0.5% BSA的PBS，室温孵育5 min，以封闭细胞上的非特异性结合位点。</li>
	<li>使用含0.1%脱脂奶粉和0.1% BSA的PBS缓冲液，将抗Flag抗体（1:1,000稀释比例）与抗CENP-B抗体（1:200稀释比例）或ACA（1:2,000稀释比例）共同稀释，作为着丝粒定位标记。 
	注意：为获得最佳结果，该溶液中一抗的终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积（约 30 µl) 稀释后的一抗溶液浸没细胞样本，在室温下孵育1小时 37 °C用封闭缓冲液冲洗细胞5次，持续30分钟。 
	注意：可用 PBS 冲洗细胞。为获得最佳结果（即为避免细胞损失，最佳洗涤条件必须通过实验经验确定。</li>
	<li>将针对每种一抗的荧光标记二抗用含0.1%脱脂奶粉和0.1% BSA的PBS稀释（稀释比例为1:100至1:200）。 
	注意：为了获得最佳结果，该溶液中二抗的最终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积（约 30 µl) 加入稀释后的二抗以浸没细胞样本，在室温下孵育细胞样本1小时 37 °C用含有0.1%脱脂奶粉和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤细胞2次。 
	注意：也可使用 PBS 单独洗涤细胞。</li>
	<li>加入足量含DAPI（50-100 ng/ml）的PBS，浸没细胞样品。室温孵育5分钟。用PBS清洗细胞1-2次。</li>
	<li>将含有细胞样本的盖玻片按照2.11节所述方法安装到载玻片上。</li>
</ol>
4. N端Flag标签CENP-A蛋白的细胞固定与免疫荧光染色（甲醇固定法）
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>准备预冷的甲醇。</li>
		<li>配制含4%山羊血清的TBS（pH 7.4）。</li>
		<li>配制含 DAPI（50–100 ng/ml）的 1 ml TBS（pH 7.4）。</li>
		<li>按照 2.1.5 节所述方法制备 100 ml 封片介质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在转染后48–72小时（见方案1）通过抽吸去除培养基，用于细胞固定。用TBS冲洗细胞一次。将TBS沿培养孔壁加入，避免扰动细胞表面。 
	注：细胞固定的最适时间点需通过实验确定。</li>
	<li>用预冷的甲醇固定细胞，并在 -20 °C 下孵育 6 分钟20 °C用 TBS 清洗细胞两次，以充分去除残留的甲醇。</li>
	<li>使用疏水屏障笔（见材料/设备列表），在每块盖玻片样本周围绘制浅绿色的方形或圆形，以形成疏水屏障。切勿用疏水屏障笔接触或过于靠近细胞。</li>
	<li>通过加入含4% goat serum的TBS封闭细胞上的非特异性结合位点，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>在含4%山羊血清的TBS中，将抗Flag抗体（1:1,000稀释）与抗CENP-B抗体（1:200稀释）或ACA（1:2,000稀释）作为着丝粒定位标记物进行稀释。 
	注意：为获得最佳结果，该溶液中一抗的终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积的（约 30 µl)稀释的一抗溶液浸没细胞样本，在室温下孵育1小时 37 °C. 用封闭缓冲液冲洗细胞5次，持续30分钟。为获得最佳结果（即，细胞损失最少），最佳洗涤条件必须通过实验确定。</li>
	<li>将针对每种一抗的荧光标记二抗用含4%小牛血清的TBS稀释（稀释比例为1:100至1:200）。 
	注意：为了获得最佳结果，该溶液中二抗的最终浓度必须通过实验确定。</li>
	<li>加入足够体积（约 30 µl) 加入稀释后的二抗以浸没细胞样本，在室温下孵育细胞样本 1 小时 37 °C用封闭缓冲液将细胞冲洗3次。</li>
	<li>加入足量含 DAPI（50-100 ng/ml）的 TBS 溶液，完全浸没细胞样本。室温孵育 5 分钟。用 TBS 溶液冲洗细胞 1-2 次。</li>
	<li>将含有细胞样品的盖玻片按照2.11步骤所述方法安装到载玻片上。</li>
</ol>
5. 免疫荧光图像观察、采集、定量与分析
<ol>
	<li>通过配备 63X 和 100X 油镜、外部紧凑型光源以及数字 CCD 相机的电动荧光显微镜观察细胞样本。</li>
	<li>使用软件 A，或软件 B1 和 B2（参见材料/设备清单）进行图像采集与处理，包括去卷积。有关软件 A 使用的所有命令，请参见补充代码文件（5.2.1）；有关软件 B1 和 B2 使用的所有命令，请参见补充代码文件（5.2.2）。</li>
	<li>采用先前报道的方法23-25，对着丝粒-动粒蛋白（例如，着丝粒处 CENP-A 的残留信号）的信号进行定量，具体步骤如下述微小修改：
	<ol>
		<li>按以下方式选择着丝粒-动粒蛋白区域和背景区域：
		<ol>
			<li>有丝分裂细胞：（着丝粒-动粒区域）选择与 DAPI 染色染色体重叠的区域；（背景区域）选择染色体外但位于同一单个细胞内的区域（即，胞质区域）。</li>
			<li>间期细胞：（着丝粒-动粒区域）选择与 DAPI 染色染色质重叠的区域；（背景区域）选择染色质外但位于同一单个细胞内的区域（即，胞质区域）。 
			注：有关使用软件 A 或软件 B2 进行区域选择的详细信息，请参见补充代码文件（5.2.1.4.3）或（5.2.2.6.4）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用软件 A 或 B 定量着丝粒处残留信号的百分比。计算时使用以下公式： 
		着丝粒-动粒处着丝粒-动粒蛋白的残留信号 
		<img alt="色谱结果方程 ΣS_sample(n)−b(n)/r_sample，用于分析比较的示意图。" src="/files/ftp_upload/53732/53732equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1"> 
		其中 s 为选定区域的信号亮度，通过 ACA 或 CENP-B 染色确认；b 为背景信号亮度；rsample 为经 siRNA(s) 处理细胞的参考 ACA 或 CENP-B 信号；rctrl 为转染 Luc siRNA 细胞的参考 ACA 或 CENP-B 信号。 
		注：在本分析中，如先前报道所述17，CENP-B 信号被用作 CUL4A 和 RBX1 的参考信号。
		<ol>
			<li>将上述信号定量软件输出的原始数据复制粘贴至 Excel 文件中进行计算。详见补充代码文件：（5.2.1.4）和（5.2.2.6）。一个计算示例见表 3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每种测量条件下至少分析 20 个细胞，以消除染色和图像采集过程中的变异。可选地，使用每个分析细胞的“平均值”来比较不同着丝粒-动粒蛋白之间的残留着丝粒-动粒信号值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 总蛋白的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li> 用变性缓冲液 A（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；50 mM NaCl；0.5% Nonidet P-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.5% SDS；1 mM EDTA；以及不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞，26 将悬液进行超声处理和冻融处理，并按如下方法测定蛋白质浓度：
	<ol>
		<li>对于超声处理过程，加入 50 µl 向转染后48-72小时从6孔聚苯乙烯板的两个孔中收集的细胞加入缓冲液A（参见方案1）。使用配备破碎探头和微探针的超声波破碎仪（见材料与设备清单），对每个样品进行总时长15秒的间歇脉冲处理（占空比50%）。</li>
		<li>对于冻融过程，使用液氮冷冻细胞，并在室温下解冻细胞。</li>
		<li>使用商用蛋白检测试剂 I 或 II 测定蛋白浓度（参见材料与设备列表）。 
		注意：使用试剂 I 或 II 测定蛋白质浓度时，裂解液按 1:10 的比例稀释。在此稀释条件下，缓冲液 A 中的 SDS 对测定几乎无干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有20-的裂解液混合30 µg 总蛋白与2×或4× SDS-PAGE上样缓冲液混合。27 将样品煮沸5分钟，然后上样至12.0%-15.0%变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。</li>
	<li>采用先前所述的蛋白质印迹法，将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至PVDF膜上。17,24,27-31
	<ol>
		<li>用含5%脱脂奶粉的1× PBS封闭膜上的非特异性结合位点，随后在室温下与稀释的一抗溶液孵育1小时。有关详细信息，请参见材料与设备列表（例如， 每种一抗的稀释比例</li>
		<li>用 PBS-T 缓冲液（1× PBS 含 0.1% Tween-20）洗涤膜 3–4 次（每次 3 至 5 分钟，摇床孵育）后，将膜在以下混合物中于室温孵育 1 小时：近红外（IR）荧光染料标记的二抗（稀释比例 1:20,000）、DyLight 标记的二抗（稀释比例 1:20,000）和/或辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（用 PBS-T 稀释，稀释比例 1:10,000）。详细信息见材料与仪器列表例如， 每种二抗的稀释比例</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用红外成像系统和/或化学发光成像仪扫描膜以检测免疫印迹中的蛋白质（参见材料/设备列表），随后将膜洗涤3次。
	<ol>
		<li>有关红外成像系统的使用，请参见补充代码文件中的 (6.4.1)。</li>
		<li>有关化学发光成像仪的使用，请参见补充代码文件中的 (6.4.2)。本系统需使用超敏增强型化学发光底物（ECL）（见材料与设备清单）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

近年来，许多研究开发了针对固定细胞的不同定量显微检测方法。42 着丝粒-动粒生物学的进步通常需要理解特定蛋白质在亚细胞水平上的时空调控，这种调控反映了这些蛋白质在细胞周期中功能的动态变化。因此，本文建立了免疫荧光染色（IIF）方法以及一种定量IIF检测方法，用于特异性分析内源性和外源性CENP-A蛋白的相对水平，该方法可适用于不同处理的样本。目前，我们已成功使用本研究中的方案2对内源性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1和Ska1进行了IIF染色（参见Niikura 等.24 及未发表数据；有关抗体信息见材料与设备列表）。未来，研究人员可采用相同方法，通过选择特异性抗体来定量不同着丝粒-动粒蛋白（包括内源性蛋白和Flag标签的外源性蛋白）的水平。然而，我们的IIF方法不适用于活细胞或在整个细胞周期中对单个特定细胞进行检测。由于这些实验步骤需要将细胞固定并分别处理在不同的盖玻片上，我们引入了参考信号（例如，ACA或CENP-B），以实现不同样本间信号的公平比较，并提高检测的准确性。由于ACA可能包含内源性和/或外源性CENP-A信号，因此在定量分析C...

&#34;着丝粒&#34;在遗传学中传统上被定义为减数分裂重组受抑制的区域，随后被确认为有丝分裂染色体上的初级缢缩部位，在有丝分裂过程中染色体的准确分离中发挥关键作用。&#34;动粒&#34;最初通过电子显微镜观察被描述为在着丝粒表面结合微管的多层结构；&#34;动粒&#34;随后被定义为定位于有丝分裂染色体着丝粒区域的大型蛋白复合物。尽管脊椎动物的着丝粒DNA序列存在显著差异，动粒的结构和组成却高度保守。纺锤体微管与动粒之间的动态相互作用对于有丝分裂过程中染色体的忠实分离至关重要，着丝粒-动粒功能缺陷会导致非整倍性，从而引发癌症。
大多数真核生物的着丝粒没有明确的DNA序列，而是由重复的α卫星DNA（171 bp）组成的大片段阵列（0.3–5 Mb）构成。除芽殖酵母外，着丝粒的特性并非由DNA序列决定，而是取决于一种含有组蛋白H3变体CenH3（在人类中称为着丝粒蛋白A [CENP-A]）的特殊核小体的存在。5 CENP-A核小体定位于哺乳动物动粒的内板7，并结合171 bp的α卫星DNA。有活性的着丝粒需要含有CENP-A的核小体来介导组成型着丝粒相关网络（CCAN）和动粒蛋白的招募，这些蛋白共同调控染色体与有丝分裂纺锤体的连接以及通过纺锤体检查点的后续细胞周期进程。
根据上述证据，CENP-A 被认为是着丝粒的表观遗传标记8；然而，CENP-A 如何被整合到着丝粒 DNA 中，以及介导这一整合过程的相关因子，目前尚未被充分阐明。CENP-A 的组蛋白折叠区包含一个短的着丝粒靶向结构域（CATD），将 H3 中相应区域替换为 CATD 即足以引导 H3 定位于着丝粒9。多项研究提示 CENP-A 的翻译后修饰（PTM）具有功能作用12-16；然而，这些 CENP-A 翻译后修饰在着丝粒招募过程中的分子机制仍有待阐明。我们先前报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3 连接酶活性对于 CENP-A K124 位点的泛素化以及 CENP-A 在着丝粒上的定位至关重要17。
动粒蛋白的发现与表征加深了人们对染色体分离机制的理解。18 通过多种方法已在脊椎动物细胞中鉴定出100多种动粒组分。19,20 对动粒如何组装和发挥功能的认识，也来源于对每种着丝粒-动粒蛋白及其细胞内蛋白质-蛋白质相互作用网络的细胞功能的表征。19 荧光显微镜中的直接可视化和先进成像技术能够以极高的分辨率呈现着丝粒-动粒组分，从而实现对着丝粒和动粒中特定分子组分的直接观察。此外，利用特异性抗体进行间接免疫荧光（IIF）染色的方法对这些观察至关重要。然而，尽管已有大量关于IIF实验方案的报道，但极少有研究详细讨论针对特定着丝粒-动粒蛋白所面临的问题。1-4 因此，开发并报道用于特异性分析每种着丝粒-动粒蛋白的IIF染色方法及定量IIF检测技术具有极其重要的意义。在进行IIF染色时，应谨慎执行染色流程，以避免目标蛋白或细胞其他组分的丢失。然而，固定处理有时会破坏抗原位点，不同的抗体-抗原组合可能对某种固定剂效果不佳，但对另一种固定剂却表现良好。21 固定剂的选择在很大程度上取决于目标蛋白的性质。因此，在着丝粒-动粒蛋白的IIF染色中，采用不同的固定方法至关重要。
本文建立了用于间接免疫荧光（IIF）染色的优化方法，以及一种检测内源性着丝粒-动粒蛋白（包括CENP-A和Flag标签的外源性CENP-A蛋白）在人细胞中定位并对其进行定量的实验方案。这些方法可应用于其他物种着丝粒-动粒蛋白的分析。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>转染试剂 I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>转染试剂 II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>低血清培养基，使用前于 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>高葡萄糖 DMEM（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基）</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>高葡萄糖 DMEM，使用前于 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证、热灭活、源自美国</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS（胎牛血清）</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 溶液</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine，0.1% w/v，溶于水</td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>无菌组织培养级水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微盖玻片（22 mm × 22 mm）&amp;nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>盖玻片（22 mm × 22 mm）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6 孔聚苯乙烯培养板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，液体</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>PAP 笔&amp;nbsp;</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>疏水屏障笔（用于免疫荧光染色中形成拒水屏障）</td></tr><tr><td>紫杉醇（Taxol）</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>用于有丝分裂细胞分析的 Taxol</td></tr><tr><td>TN-16，微管抑制剂（TN16）</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>用于有丝分裂细胞分析的 TN16</td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>用于透化的去垢剂</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>用于细胞核染色</td></tr><tr><td>对苯二胺</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>用于封片剂</td></tr><tr><td>VWR 显微载玻片，磨砂</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>显微载玻片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗 CENP-A 抗体</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF），1:5000（WB）</td></tr><tr><td>抗 CENP-B 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF，甲醇/丙酮固定）至 1:400（IIF，多聚甲醛固定）</td></tr><tr><td>抗 CENP-B 抗体&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF，甲醇/丙酮固定）至 1:400（IIF，多聚甲醛固定）</td></tr><tr><td>抗着丝粒抗体（ACA）</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>人着丝粒抗血清；稀释比例为 1:2000（IIF）</td></tr><tr><td>抗 CENP-H 抗体</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF）</td></tr><tr><td>抗 CENP-H 抗体</td><td>BD</td><td>612142</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF）</td></tr><tr><td>抗 CENP-I 抗体</td><td>N/A，Katusmi Kitagawa 博士</td><td>N/A，Katusmi Kitagawa 博士</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF）；Niikura 等，Oncogene，4133-4146（2006）</td></tr><tr><td>抗 KNL1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF）</td></tr><tr><td>抗 Hec1 抗体</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF）</td></tr><tr><td>抗 Hec1 抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF）</td></tr><tr><td>抗 Ska1 抗体</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF）</td></tr><tr><td>抗 Flag 抗体</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF），1:5000（WB）</td></tr><tr><td>抗 Flag 抗体</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF），1:5000（WB）</td></tr><tr><td>抗 CUL4A 抗体</td><td>N/A，Pradip Raychaudhuri 博士</td><td>N/A，Pradip Raychaudhuri 博士</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:3000（WB）；Shiyanov 等，《生物化学杂志》，35309-35312（1999）</td></tr><tr><td>抗 RBX1 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>兔多克隆抗体；稀释比例为 1:2000（WB）</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:5000（WB）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）</td></tr><tr><td>脱脂奶粉（可替代 Carnation 奶粉）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871（再订购号 190915；批号 90629）</td><td>脱脂奶粉</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 电动荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>电动荧光显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 油镜</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X 油浸物镜</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 油镜</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X 油浸物镜</td></tr><tr><td>Leica EL6000 紧凑型光源</td><td>Leica</td><td></td><td>用于荧光激发的外部紧凑型光源</td></tr><tr><td>ORCA-R2 数字 CCD 相机&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>数字 CCD 相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>用于图像观察、采集、定量和分析</td></tr><tr><td>Velocity 版本 6.1.1 3D 图像分析软件&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>用于图像观察、采集、定量和分析</td></tr><tr><td>完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>蛋白酶抑制剂混合物片剂</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D 定量试剂盒</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>用于蛋白质浓度测定的商用蛋白检测试剂 I（兼容 2% SDS）</td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>用于蛋白质浓度测定的商用蛋白检测试剂 II（兼容 0.1% SDS）</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>用于转膜的 PVDF 膜</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF）</td></tr><tr><td>IRDye 680 山羊抗兔 IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF）</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF）</td></tr><tr><td>山羊抗兔 DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF）</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>HRP 偶联的二抗，DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:10000（IIF）</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>HRP 偶联的二抗，DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:10000（IIF）</td></tr><tr><td>Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件&amp;nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>软件 A</td></tr><tr><td>Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition）</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>软件 B1</td></tr><tr><td>Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification）</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>软件 B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>超声破碎仪</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，阶梯型，实心，螺纹 9.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&amp;nbsp;33995-325</td><td>用于超声破碎的破碎探头</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，锥形 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&amp;nbsp;33996-185</td><td>用于超声破碎的微探头</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 红外成像系统&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>用于免疫印迹检测的红外成像系统</td></tr><tr><td>Image Studio 分析软件版本 4.0&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>软件 C</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于免疫印迹检测的化学发光成像仪</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 分析软件&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>软件 D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>超敏增强型化学发光（ECL）底物</td></tr></tbody></table>

内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

“着丝粒”和“动粒”是指染色体在细胞分裂过程中与纺锤体结合的位点。在整个细胞周期中对着丝粒-动粒蛋白进行直接可视化观察，仍是研究这些蛋白作用机制的基本工具。荧光显微镜的先进成像方法可实现对着丝粒-动粒组分的高分辨率成像，从而能够直接观察着丝粒和动粒的特定分子组分。此外，利用特异性抗体进行间接免疫荧光（IIF）染色的方法对这些观察至关重要。然而，尽管已有大量关于IIF实验方案的报道，但极少有文献详细讨论特定着丝粒-动粒蛋白的相关问题1-4。本文报道了利用多聚甲醛固定结合间接免疫荧光染色法标记人细胞内源性着丝粒-动粒蛋白的优化实验方案。同时，本文还报道了对经丙酮或甲醇固定的细胞中Flag标签外源性CENP-A蛋白进行检测的实验方案。这些方法可用于检测和定量人细胞中的内源性着丝粒-动粒蛋白以及Flag标签的CENP-A蛋白。

内源性 CENP-A 的免疫荧光分析支持 CUL4A-E3 连接酶对 CENP-A 定位于着丝粒所必需的假说 
我们近期的研究表明，CUL4A-RBX1-COPS8 E3 连接酶活性对于 CENP-A 赖氨酸 124（K124）的泛素化以及 CENP-A 在着丝粒上的定位是必需的17。最初，通过抗 CENP-A 的天然染色质免疫沉淀法分离得到了间期着丝粒复合物（ICEN）32-34，并推测部分 ICEN 蛋白可能在介导 CENP-A 定位于着丝粒的过程中发挥作用。因此，我们进行了 siRNA 沉默实验，以筛选那些表达缺失会导致 CENP-A 在着丝粒上失定位的蛋白17（数据未显示）：将不同步生长的 HeLa 细胞分别转染 Cullin 4A（CUL4A）siRNA 或 RBX1 siRNA，并在达到最佳蛋白耗竭所需的时间（CUL4A 为 48 小时，RBX1 为 72 小时）后进行分析。转染 CUL4A siRNA 的细胞显示出 CENP-A 在着丝粒上显著的失定位现...

本文报道了在人类细胞中检测内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的实验方案，并通过间接免疫荧光染色方法（采用固定剂如多聚甲醛、丙酮或甲醇进行固定）对这些蛋白在着丝粒-动粒上的水平进行定量分析。

“着丝粒”和“动粒”指染色体在细胞分裂过程中与纺锤体结合的位点。直接观察……

本间接免疫荧光实验的总体目标是优化人细胞中内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白（包括着丝粒蛋白A和带Flag标签的外源CENP-A蛋白）的定位与定量分析。该方法有助于解答如何鉴定和定量着丝粒-动粒蛋白的关键问题。该技术的主要优势在于，可根据所选的特定后期阶段，用于量化不同水平的着丝粒-动粒蛋白表达。接种后18小时，用PBS洗涤培养的细胞一次，然后向六孔聚苯乙烯培养板的每孔中加入500微升低血清培养基。接着，用新鲜配制的A和B混合溶液转染每孔中的细胞，并将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。4.5小时后，更换为含FBS和抗生素的高糖DMEM培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养。48至72小时后，吸除细胞培养基，用PBS洗涤细胞一次，加入生理盐水时沿培养孔壁缓慢加入，避免扰动细胞。随后在4摄氏度条件下，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。固定结束后，用Kb2缓冲液洗涤细胞两次，再于室温下用Kb1缓冲液对样本透化处理30分钟。然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞一次，并加入新鲜的 Kb2 缓冲液以封闭非特异性结合位点。室温孵育 5 分钟后，用镊子将接种了细胞的盖玻片从各孔中取出，使用疏水屏障笔在每张盖玻片样本周围绘制疏水屏障。将盖玻片转移至新的六孔聚苯乙烯板中，并在 37 摄氏度下用适当的一抗溶液浸泡样本 1 小时。然后用 Kb2 缓冲液将细胞冲洗三次，并在 37 摄氏度下用相应的二抗孵育一小时。孵育结束后，用 Kb2 缓冲液对样品进行五次、每次 6 分钟的洗涤。随后，在室温下用含有 DapE 的 Kb3 缓冲液对细胞核进行染色 5 分钟，接着用 Kb2 缓冲液洗涤一至两次，并用 Kb2 缓冲液重新填充孔板。现在，在每张细胞盖玻片对应的载玻片中央滴加一滴封片介质，并去除细胞样本上的任何液体。最后，小心地将每份样本置于已准备好的载玻片中央，并用纸巾吸去多余的封片介质。如本代表性实验所示，CUL4A siRNA 转染细胞的全细胞裂解液中内源性 CENP-A 蛋白表达水平与萤光素酶 siRNA 转染细胞中的 CENP-A 表达水平相似。此外，RBX1 siRNA 转染细胞总裂解液中内源性 CENP-A 的蛋白水平与萤光素酶 siRNA 转染细胞中的内源性 CENP-A 水平相似，表明 CUL4A-RBX1 E3 连接酶对于 CENP-A 定位于着丝粒是必需的。CENP-A 赖氨酸突变体丧失了在着丝粒内定位的能力，提示 CENP-A K124 位点的泛素化对于其定位于着丝粒至关重要。重要的是，外源性单泛素融合的 CENP-A 蛋白能够挽救 CENP-A K124R 突变体的错位表型，使其重新定位于着丝粒区域。一旦掌握，若操作得当，细胞固定和免疫荧光染色步骤可在五到六小时内完成。请记住，在向孔板侧壁添加所有溶液时应轻柔操作，以免在冲洗或浸没样本时使细胞从盖玻片上脱落。切勿忘记，在通风不良的环境中使用加热的多聚甲醛，或在火源附近使用易燃材料均可能带来极大危险，因此在进行该操作时务必采取适当的安全防护措施。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白

本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA...

结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

在果蝇睾丸中成像中心体

在此，开发了一种新型的定量荧光检测方法，通过将特定蛋白在中心体处的荧光强度归一化至适当的内参标准荧光强度，从而定量检测该蛋白在中心体局部水平的变化。...

定量免疫荧光测定法用于测量中心体蛋白水平的变化

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

我们开发了一种策略，可用于纯化并成像大量处于不同取向的中心粒，适用于超分辨率显微镜和单颗粒平均法分析。...

衣藻中心粒的单颗粒重构分离与荧光成像

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。...

利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae

减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis...

活体成像表征雄性减数分裂前期着丝粒的运动 拟南芥

学习利用间接免疫荧光染色技术检测和定量分析人类细胞中的内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白，包括着丝粒蛋白A和Flag标记的CENP-A蛋白，优化不同固定方法以获得最佳定位效果。

内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

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