隔离细胞脂滴:两个纯化技术从酵母细胞与人类的胎盘开始
2014年4月1日
两种技术从1分离细胞的脂滴），酵母细胞和2）人类胎盘介绍。这两个程序的核心是密度梯度离心法，在这里可以用肉眼很容易地可视化含有液滴产生的浮层，提取，并通过Western印迹分析纯度量化。
该程序的总体目标是从组织中分离脂滴。这是通过首先解剖和分离胎盘组织来实现的。接下来，油酸蛋白的细胞被匀浆。
然后通过几个离心步骤分离细胞器。最后，收集含有脂滴的浮层并表征脂滴。最终，荧光显微镜和蛋白质血液分析用于显示脂滴分数的纯度。
该技术的主要优点是可以从大多数主动脉细胞中分离脂滴。请注意，在某些组织中，液滴的数量可能低于减少浮动 G 层和液滴数量的液滴数量。胎盘是从足月自然分娩前接受择期剖宫产的单胎妊娠健康妇女中收集的，受试者对收集胎盘给予书面知情同意。
胎盘的收集和随后的使用是在田纳西大学和诺克斯维尔的田纳西大学医学研究生院的批准下进行的。机构审查委员会在生物安全罩中，将胎盘转移到无菌可高压灭菌容器中，并使用无菌生理盐水小心清洗胎盘和胎膜上的血液。将带血的盐水作为液体生物废物丢弃在 1 升烧杯中。
将胎盘放在无菌区域上，这个光滑的表面带有脐带，用锋利的细剪刀和镊子朝上。去除脐带和胎膜。接下来，将胎盘翻转过来，使母体表面朝上。
然后从表面约 3 毫米处去除覆盖的基底板组织。一次解剖一个 COTA 铅蛋白，避开绒毛膜板，并将绒毛组织收集到装有盐水的 250 毫升烧杯中。然后使用 0.9% 无菌盐水和镊子在单独的烧杯中冲洗组织数次，方法是使用 1 升液体废液烧杯旋转。
一次将一个 codi 铅蛋白转移到 150 毫米培养皿中。用镊子握住，用剃须刀片将组织从血管刮到培养皿上。将刮下的纸巾放入含有 0.9% 无菌盐水的单独烧杯中。
对所有组织块重复此作。在细胞解离腔中冲洗刮擦的组织后，将其排出多余的液体和重量以消化胎盘组织。制备组织消化混合物后，将组织从收集的总组织中转移 60 克到 500 毫升无菌 Helen Meyer 烧瓶中。
将组织消化混合物添加到装有组织的培养瓶中，并在 37 摄氏度下在摇床中孵育 45 分钟。以 150 RPM 的速度收集孵育后解离的细胞，并倾斜培养瓶以使组织沉淀。收集 super natin。
注意不要收集 UND 分离的组织。在转移到无菌的 15 ml 离心管中之前，向上清液中加入等量的 HBSS。离心 1000 次后，每批用 UND 相关组织的剩余部分重复解离和上清液收集。
在 4 摄氏度下重力 15 分钟，吸出上清液，而不会干扰沉淀。胎盘绒毛细胞主要位于红细胞上方的颗粒的白色部分。将沉淀白色部分的绒毛细胞转移到无菌的 50 ml 锥形离心管中，并保持在冰上。
从所有三个消化阶段收集细胞后，使用插入无菌 50 毫升锥形离心管顶部的 100 微米尼龙细胞过滤器过滤悬浮液。如果细胞悬液的过滤速度减慢，则向上提升过滤器以在管内抽取真空，在 4 摄氏度和 1000 倍重力下离心 10 分钟。小心去除上清液，在不干扰沉淀的情况下，使用新鲜制备的低渗裂解培养基或生物安全罩中的 HLM 匀浆胎盘绒毛细胞，向细胞中加入四倍于冰冷 HLM 的细胞沉淀体积。
使用 10 毫升移液器轻柔彻底地复苏。通过上下移液来悬浮细胞。将细胞在冰上孵育 10 分钟后，将它们转移到冰冷的匀浆器中，然后用松散的研杵轻轻敲击 20 至 25 次，缓慢匀浆细胞。
将裂解物在 3000 倍重力和 4 摄氏度下旋转 10 分钟，以去除未破碎的细胞。然后将上清液收集到新试管中，然后在 25， 000 倍重力和 4 摄氏度下再次旋转 20 分钟。要通过超速离心去除线粒体以分离脂滴，请将超级纳丁收集在 50 毫升离心管中。
调整至 20% 蔗糖并转移到超速离心管底部，用于 S SW 28 转子或等效物，将密度调整后的超级纳丁与约 10 毫升冰冷的、100 毫摩尔的碳酸钠缓冲液和 0.5 至 1 毫升冰冷的 HLM 叠加在一起，使用 S SW 28 水平吊篮转子离心机以 130 度填充试管， 000 倍重力和 4 摄氏度，持续 45 分钟。然后收集漂浮层，调整至 10% 蔗糖，并将其转移到 SW 41 TI 转子或等效物的 13.2 毫升超速离心管底部，在 274 离心后，将密度调整后的上清液与约 5 毫升冰冷的 100 毫摩尔碳酸钠缓冲液和 0.5 毫升冰冷的 HLM 叠加在一起， 000 倍重力和 4 摄氏度，持续 60 分钟。在 SW 41 TI 转头中，使用 1 mL 移液器小心收集含有脂滴的顶部浮层。
将体积调节至 10% 蔗糖，然后再次转移到 13.2 毫升超速离心管中，然后叠加 5 毫升冰冷的 100 毫摩尔碳酸钠缓冲液和 0.5 毫升冰冷的 HLM。离心 30 分钟后，使用弯曲的 PE 移液器小心地将含有脂滴的顶部白色漂浮层收集到三个装有 100 μL HLM 的 1.5 mL试管中。根据文本方案表征脂滴，如图所示，通过用中性脂质特异性荧光染料 boda P 4 93 5 0 3 染色来验证从人胎盘绒毛细胞中分离的脂滴的存在，并使用荧光显微镜进行可视化。
此处显示，通过蛋白质印迹和脂滴标记蛋白评估分离的脂滴组分的纯度，包括用于 er 的 para lippin 两个钙联蛋白、goi 标记物、用于线粒体和质膜的 GM one 30 CO X 4、MEK one。破损后，脂滴与冷丙酮并提取蛋白质。对馏分进行 para lipin 的 Western 印迹。
二、在核后上清液和含有脂滴的分离白色漂浮层中检测到脂滴蛋白。在旋转 4 和旋转 5 的浮动层下方任一层的脂滴级分中均未检测到对质膜具有特异性的蛋白质，例如 MK one 和 GM one 30。如前所述，在脂滴分数的其他位置检测到蛋白钙联蛋白和线粒体膜蛋白 CO X 4 的弱染色。
这些结果与早期的报告一致，表明脂滴与哺乳动物细胞中的线粒体和 ER r 相互作用。按照此程序，可以执行其他方法，如蛋白质组学和脂质组学方法，以研究其他问题，例如哪些因子与液滴结合。
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概述
本文介绍了使用密度梯度离心法从酵母细胞和人类胎盘中分离细胞脂质滴的技术。所得到的含有滴状物质的漂浮层可以通过Western Blot分析轻松可视化、提取和定量其纯度。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物化学
- 神经科学
背景
- 脂质滴是参与脂质储存和代谢的重要细胞器。
- 分离技术对于研究脂质滴的功能和组成至关重要。
- 密度梯度离心是分离细胞组分的常用方法。
- 荧光显微镜和Western Blot分析用于评估纯度。
研究目的
- 从胎盘组织和酵母细胞中分离脂质滴。
- 对分离的脂质滴进行表征以便进行进一步研究。
- 展示密度梯度离心在此过程中的有效性。
所用方法
- 胎盘组织的解剖和分离。
- 油脂细胞的均质化。
- 通过多次离心步骤分离细胞器。
- 收集和表征漂浮的脂质滴层。
主要结果
- 成功从酵母和人类胎盘组织中分离了脂质滴。
- 使用Western Blot分析确认了脂质滴分数的纯度。
- 荧光显微镜提供了脂质滴的视觉确认。
- 所用方法在脂质滴分离中表现出可重复性和有效性。
结论
- 所介绍的技术对于从各种组织中分离脂质滴是有效的。
- 密度梯度离心是一种可靠的方法。
- 进一步的研究可以利用这些分离的脂质滴进行代谢研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of lipid droplets enables mechanistic de-risking in target validation by providing purified organelles for proteomic and lipidomic analysis. This supports predictive confidence in early discovery by clarifying lipid metabolism pathways and associated protein interactions. The technique offers translational continuity from yeast models to human placental systems, facilitating cross-species target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet-associated proteins to clarify functional roles in lipid storage and metabolism pathways.
- Operational Value: Provides purified lipid droplet fractions suitable for downstream proteomic and lipidomic profiling.
- Strategic Value: Supports target de-risking by isolating organelles for hypothesis testing in metabolic disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lipid droplet preparations for consistent assay readouts in compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible isolation across yeast and human cell systems, enabling platform transfer.
- Strategic Value: Supports assay standardization for lipid-modulating compound evaluation in metabolic disease programs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by enabling lipid droplet analysis in disease-relevant human placental models.
- Operational Value: Provides continuity from yeast-based mechanistic studies to human tissue validation.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in lipid-targeted therapeutic development through cross-system validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by supplying purified lipid droplets for functional analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid droplet proteome composition and lipid-protein interactions.
- Screening: Enables assay-ready lipid droplet preparations for evaluating compound effects on lipid storage.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs via Western Blot and fluorescence microscopy for purity assessment and comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast model findings to human placental systems for metabolic pathway validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol applicable across diverse eukaryotic systems for metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in lipid droplet-associated protein identification.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through density gradient centrifugation across model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in lipid metabolism programs by providing reliable organelle isolation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated lipid droplet proteomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell fractionation, density gradient centrifugation, and organelle isolation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation equipment and compatible rotors (SW 28, SW 41 TI) for sucrose or Ficoll gradient separation.
- Necessitates standardization of homogenization and centrifugation parameters across yeast and human tissue preparations.
- Involves adaptation considerations for different cell types based on lipid droplet abundance and organelle contamination profiles.
- Relies on Western Blot and fluorescence microscopy for purity validation, requiring antibody availability and imaging infrastructure.
