Name: 隔离细胞脂滴:两个纯化技术从酵母细胞与人类的胎盘开始 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习利用密度梯度离心技术从酵母细胞与人类胎盘组织中分离纯化细胞脂滴的方法，并通过荧光显微镜与蛋白质免疫印迹分析验证其纯度，为脂质代谢研究提供可靠的实验基础。

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本工作由美国心脏协会资助项目（P.D.，编号13SDG14500046）及可持续能源教育项目支持 &amp;#38; 研究中心奖（田纳西大学）授予 P.D.，以及医师医学教育与研究基金会（田纳西大学）奖项授予 J.M。作者感谢 Caroline Leplante（耶鲁大学）提供裂殖酵母转化为原生质球的实验方案；感谢 Eric T. Boder（田纳西大学）提供摇床培养箱、台式离心机和 Western Blot 分析设备的使用；感谢田纳西大学环境生物技术中心提供超速离心机的使用；感谢 Günther Daum（奥地利格拉茨工业大学）提供酵母抗体；感谢田纳西大学医学中心妇产科部门工作人员提供的技术协助。

1. 从（裂殖）酵母细胞中分离脂滴
从模式生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中分离液滴的步骤与以下方案几乎完全相同6。制备过程中的差异已予以注明。
1.&#160;培养酵母细胞
<ol>
	<li>准备培养基。在玻璃瓶或培养瓶中，按每升去离子水（dH2O）加入36 g&#160;YE5S粉末的比例配制。共需约2 L&#160;培养基。将培养基在121 °C条件下高压灭菌20分钟。待培养基冷却至室温。对于S. cerevisiae，用YPD替代YE5S。</li>
	<li>使用无菌操作技术，将10–20 ml冷却后的YE5S培养基加入250&#160;ml培养瓶中。用无菌木棒或等效工具，从琼脂平板上取少量酵母细胞接种至培养基中。在30 °C下培养细胞至所需光密度。使用分光光度计在595 nm波长下测定光密度。</li>
	<li>将剩余培养基分装至2.8&#160;L培养瓶中。每个2.8&#160;L培养瓶中培养基体积不超过1 L，以确保在摇床培养箱中细胞生长期间充分混合。最终湿细胞产量应约为10 g&#160;，以保证获得足够量的脂滴用于蛋白质组学和脂质组学分析。</li>
	<li>将步骤1.2中培养的细胞接种至步骤1.1中已准备好的、每瓶含1 L培养基的2.8&#160;L培养瓶中。</li>
	<li>在30 °C下将细胞培养至所需密度。</li>
	<li>确认细胞内含有脂滴。保留1 ml细胞样品。测定样品的光密度（O.D.）。每单位光密度的细胞中加入0.1 ml浓度为100 mM的BODIPY 493/503乙醇储备液。取3 μl&#160;样品置于载玻片与盖玻片之间。使用GFP滤光片在荧光显微镜下观察（图1A）。</li>
	<li>在4 °C、3,800 × g条件下离心10分钟，收集步骤1.5中的细胞。根据离心管容量分批操作。</li>
	<li>倒掉YE5S培养基，并用含600 mM山梨醇的EMM缓冲液洗涤细胞。山梨醇提供渗透支持。</li>
	<li>将细胞转移至无菌的50&#160;ml&#160;离心管中，在4 °C、2,000 × g条件下离心10分钟收集细胞。弃去上清液。称量湿细胞重量。按每克细胞加入2 ml（EMM + 600 mM山梨醇）缓冲液的比例重悬细胞。</li>
</ol>
2.&#160;将裂殖酵母细胞转化为原生质球并进行后续裂解
<ol>
	<li>每克步骤 1.9 中称重的湿细胞，加入 5 mg 的 1）酵母裂解酶和 2）来自Trichoderma harzianum的酵母裂解酶。对于S. cerevisiae，需额外添加等量的Zymolyase。</li>
	<li>在 30 °C 下，以 100 rpm 轻柔振荡培养细胞 60 分钟。</li>
	<li>检查确认原生质球是否含有脂滴。可通过重复步骤 1.6 进行（图 1B）。</li>
</ol>
3.&#160;密度梯度离心
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 2,000 × g 离心 5 分钟，沉淀球形体。</li>
	<li>使用塑料移液管小心移除上清液。</li>
	<li>用预冷的 10 mM Tris-HCl、600 mM 山梨醇和 200 μM EDTA 缓冲液轻柔重悬沉淀的球形体。注意球形体非常脆弱。</li>
	<li>再次以步骤 3.1 相同的条件离心收集球形体。小心移除上清液，并用塑料移液管将球形体重悬于 12% Ficoll、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液中，浓度为每克细胞 2 ml。</li>
	<li>将重悬的球形体转移至玻璃匀浆器中，在冰上用松配合的研杵轻柔匀浆 20–30 次。</li>
	<li>将裂解后的球形体转移至离心管中，并在其上覆盖等体积的 12% Ficoll、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液。选择合适的离心管数量，使每管约填充至三分之二满。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用 SW28 转子或等效转子以 100,000 × g 离心 1.5 小时&#160;。让转子自然减速至停止（转子减速度 = 0）。</li>
	<li>使用移液器或弯曲的巴斯德移液管，小心转移顶部漂浮的白色层（图 2A），该层含有脂滴，并将其转移至新的离心管中。向样品中加入足量的 12% Ficoll、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液，使液体体积约占离心管体积的三分之一。</li>
	<li>向新离心管中的样品顶部加入等体积的 8% Ficoll、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液。加入该缓冲液后，离心管应约填充至三分之二满。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用 SW28 转子或等效转子以 100,000 × g 离心 1 小时。让转子自然减速至停止（转子减速度 = 0）。</li>
	<li>使用移液器或弯曲的巴斯德移液管，小心转移顶部漂浮的白色层（图 2B），该层将含有脂滴，并将其转移至新的离心管中。向样品中加入 600 mM 山梨醇、8% Ficoll、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液，使液体体积约占离心管体积的三分之一。</li>
	<li>向新离心管中的样品顶部加入等体积的 250 mM 山梨醇、10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液。加入该缓冲液后，离心管应约填充至三分之二满。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用 SW28 转子或等效转子以 100,000 × g 离心 1 小时。让转子自然减速至停止（转子减速度 = 0）。</li>
	<li>将顶部白色层（图 2C）转移至透析袋中，该层应仅含有脂滴及其结合蛋白，然后在 10 mM Tris-HCl 和 200 μM EDTA 缓冲液中透析过夜，以去除 Ficoll。</li>
</ol>
2.&#160;从人胎盘绒毛细胞中分离脂滴
胎盘采集自足月单胎妊娠、在自然临产前接受择期剖宫产的健康女性。受试者均已签署书面知情同意书，同意其胎盘用于采集。胎盘的采集及后续使用均获得田纳西大学和田纳西大学医学研究生院诺克斯维尔分校机构审查委员会的批准（批准编号分别为#8757B和#3338）。
1.&#160;分离人胎盘绒毛细胞
本方案的第1部分是对Petroff等人et al.26早前发表方案的修改
准备以下溶液：
<ul>
	<li>NaCl（1 L）：将 9 g NaCl（分子量 58.4 g/mol）溶于 dH2O 中，定容至 1 L。过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。</li>
	<li>10 倍浓度&#160;Hank’s 平衡盐溶液（10×&#160;HBSS）（1 L）：4 g KCl（分子量 74.5 g/mol）；0.6 g KH2PO4（分子量 136.086 g/mol）；80 g NaCl（分子量 58.44 g/mol）；Na2HPO4（分子量 141.96 g/mol）；10 g D-葡萄糖（分子量 180.16 g/mol）。将各组分分别溶于 dH2O 中，定容至 1 L。过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。</li>
	<li>酶消化缓冲液（0.6 ml）：取 70 ml 10×&#160;HBSS，加入 3.3 ml 7.5% 碳酸氢钠、17.5 ml 1 M HEPES 和 266.1 ml dH2O，混匀后过滤除菌（0.2 μm 滤膜）。4 °C 保存。</li>
	<li>DNase I：使用前，向一瓶 DNase 中加入 5 ml 无菌 0.9% NaCl。使用前置于冰上，或于 -20 °C 保存。</li>
</ul>
<ol>
	<li>准备胎盘以进行解剖
	<ol>
		<li>获取人类胎盘，并尽可能在分娩后立即处理。使用密封容器（如保温箱）运输胎盘。处理人类生物材料时务必格外小心。</li>
		<li>在生物安全柜中，将胎盘转移至无菌可高压灭菌的容器内，用无菌0.9% NaCl（生理盐水）溶液小心冲洗胎盘及膜表面的血液。将含血的生理盐水作为液体生物废弃物弃置于1&#160;L烧杯中。</li>
		<li>将胎盘置于无菌操作区域，使带有脐带的光滑面朝上。使用锋利的细头剪刀和镊子去除胎膜和脐带。</li>
		<li>将胎盘翻转，使母体面（粗糙面）朝上。去除覆盖于表面的基底层组织，深度约为3 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖胎盘
	<ol>
		<li>逐个解剖小叶，避免损伤绒毛膜板。将绒毛组织收集至含生理盐水的250&#160;mL烧杯中。</li>
		<li>在另一个烧杯中用0.9% NaCl溶液多次冲洗组织，使用镊子轻轻搅动，液体废弃物收集至1&#160;L烧杯中。</li>
		<li>将每个小叶依次转移至150&#160;mm培养皿中，用镊子固定，用刀片从培养皿上的血管处刮取组织。将刮下的组织放入另一含有0.9% NaCl溶液的烧杯中。对所有组织块重复此步骤。</li>
		<li>将少量组织转移至细胞分离筛，用0.9% NaCl溶液充分冲洗，直至滤出液澄清。对所有组织重复此操作。</li>
		<li>在细胞分离筛中冲洗刮取的组织后，沥干多余液体并称重。 
		此时可将组织在DMEM中于4 °C条件下，在无菌锥形瓶中过夜保存&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胎盘组织的酶消化
	<ol>
		<li>配制组织消化混合液：100 mL预热的酶稀释缓冲液、1 mL DNase I 和 20 mL 2.5% 10x&#160;胰蛋白酶。</li>
		<li>将组织分批处理，从总收集组织中（通常约为250–300 g）取60 g转移至500&#160;mL无菌锥形瓶中。</li>
		<li>将组织消化混合液加入含有组织的锥形瓶中，于37 °C、150 rpm条件下在摇床中孵育45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集解离的细胞
	<ol>
		<li>首次消化45分钟后，将消化瓶倾斜放置，待组织沉淀。</li>
		<li>收集上清液，注意避免收集未解离的组织。向收集的上清液中加入等体积的HBSS，并转移至无菌15&#160;mL离心管中。对于剩余未解离的组织，从步骤3.2&#160;开始重复操作。</li>
		<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>每批样品离心后，小心吸除上清液，勿扰动沉淀。胎盘绒毛细胞主要位于沉淀的白色部分，覆盖在红细胞之上。</li>
		<li>将绒毛细胞（沉淀的白色部分）转移至无菌50&#160;mL锥形离心管中，并置于冰上保存。</li>
		<li>在完成三轮消化后的细胞收集后，使用插入无菌50&#160;mL锥形离心管顶部的100 μm尼龙细胞滤器过滤细胞悬液。若细胞悬液过滤速度变慢，可向上提起滤器，使管内形成负压以加速过滤。</li>
		<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心10分钟。小心去除上清液，勿扰动沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 匀浆化胎盘绒毛细胞
<ol>
	<li>开始分离过程之前，配制 50 ml 含有 20 mM Tris-HCl（pH 7.4）和 1 mM EDTA 的低渗裂解液（HLM）。使用前立即向 HLM 中加入蛋白酶抑制剂，并将该溶液置于冰上保存。</li>
	<li>在生物安全柜中，向细胞中加入相当于细胞沉淀体积 4 倍的预冷 HLM。使用 10&#160;ml 移液器反复吹打，轻柔且充分地重悬细胞。</li>
	<li>将重悬的细胞置于冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>将细胞转移至预冷的玻璃匀浆器（Dounce homogenizer）中。使用松配合的研杵缓慢匀浆，进行 20–25 次轻柔研磨。</li>
	<li>将细胞裂解液在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 10 分钟，以去除未破裂的细胞、细胞碎片和细胞核。</li>
	<li>收集上清液并转移至 SW28&#160;离心管（或可承受 25,000 × g 离心力的替代管）。在 4 °C 下以 25,000 × g 离心 20 分钟，以去除线粒体。</li>
</ol>
3. 通过超速离心分离脂滴
<ol>
	<li>配制 50 ml 的 100 mM 碳酸钠（分子量 106 g/mol）缓冲液（pH 11.5）和 50 ml 的 60% 蔗糖（w/w）溶液。使用前立即向碳酸钠缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，并置于冰上保存。</li>
	<li>将步骤 2.6 中的上清液收集至一个 50&#160;ml 离心管中，调节蔗糖浓度至 20%，然后转移至适用于 SW28 转子或等效转子的超速离心管底部。在密度调整后的上清液上方覆盖约 10 ml 冰冷的 100 mM 碳酸钠缓冲液（pH 11.5）和 0.5–1 ml 冰冷的 HLM，以充满离心管。</li>
	<li>使用 SW28 摆桶转子在 4 °C 下以 130,000 × g 离心 45 分钟。让转子自由减速至停止（转子减速度 = 0）。</li>
	<li>收集漂浮层，调节蔗糖浓度至 10%，并转移至适用于 SW41Ti 转子或等效转子的 13.2&#160;ml 超速离心管底部。在密度调整后的上清液上方覆盖约 5 ml 冰冷的 100 mM 碳酸钠缓冲液（pH 11.5）和 0.5 ml 冰冷的 HLM。</li>
	<li>使用 SW41Ti 摆桶转子在 4 °C 下以 274,000 × g 离心 60 分钟。让转子自由减速至停止（转子减速度 = 0），以尽量减少对脂滴层的扰动。</li>
	<li>用 1&#160;ml 移液器小心收集含有脂滴的顶部漂浮层（图 2D），并重复步骤 3.4。</li>
	<li>使用 SW41Ti 摆桶转子在 4 °C 下以 274,000 × g 离心 30 分钟。让转子自由减速至停止（转子减速度 = 0）。</li>
	<li>用弯头巴斯德移液器小心收集含有脂滴的顶部白色漂浮层，分装至三个含有 100 μl HLM 的 1.5&#160;ml 离心管中。</li>
</ol>
脂滴组分的表征（方案1和方案2）
脂滴组分的回收率和纯度可通过蛋白质印迹法结合光学显微镜或电子显微镜进行验证。此外，可在不同离心步骤后收集并保留等分试样，用于测定纯化效率。在蛋白质印迹分析中，将代表全细胞裂解液等量样品的脂滴组分体积进行比较，比基于总蛋白含量将脂滴与其他膜组分进行比较更为合适24。

<ol><li>Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid-based+model+for+the+creation+of+an+escape+hatch+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum.</a> Nature. 448, 435-438 (2007).</li>
<li>Herker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).</li>
<li>Ding, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).</li>
<li>Kalscheuer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+isolation+of+lipid+inclusions+from+Rhodococcus+opacus+and+Rhodococcus+rubber+and+identification+of+granule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins.</a> Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).</li>
<li>Low, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+are+involved+in+the+biosynthesis+and+hydrolysis+of+triacylglycerol+in+mycobacterium+bovis+bacillus+calmette-guerin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin.</a> J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).</li>
<li>Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lipid+particles+of+the+yeast%2C+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 10, 1421-1428 (1994).</li>
<li>Grillitsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+particles%2Fdroplets+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+revisitied%3A+lipidome+meets+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome.</a> Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).</li>
<li>Binns, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intimate+collaboration+between+peroxisomes+and+lipid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies.</a> J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).</li>
<li>Ivashov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidome+and+proteome+of+lipid+droplets+from+the+methylotropic+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).</li>
<li>Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConnerth%2C+M+%22Lipidomics%3A+Vol.+1%3A+Methods+and+Protocols%22">Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols</a>. 579, 359-374 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).</li>
<li>Jolivet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+oil+bodies+in+Arabidopsis+thaliana+ecotype+WS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS.</a> Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).</li>
<li>Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+lipid+composition+analysis+of+oil+bodies+from+two+Brassica+napus+cultivers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers.</a> Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+study+and+marker+protein+identification+of+Caenorhabditis+elegans+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).</li>
<li>Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+correlation+profiles+identify+lipid+droplet+proteins+with+high+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence.</a> Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).</li>
<li>Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid-droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein-storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot.</a> Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).</li>
<li>Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinese+hamster+ovary+K2+cell+lipid+droplets+appear+to+be+metabolic+organelles+involved+in+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic.</a> J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).</li>
<li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+major+proteins+in+the+lipid+droplet-enriched+fraction+isolated+from+the+human+hepatocyte+cell+line+HuH7%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7.</a> Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> J. Biochem. 139, 921-930 (2006).</li>
<li>Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+stomatin+with+lipid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of stomatin with lipid bodies.</a> J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).</li>
<li>Zhang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+skeletal+muscle+lipid+droplet+reveals+association+with+mitochondria+and+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I.</a> J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+droplets+from+cells+by+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic. 13, 705-714 (2012).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Cho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+Prp19p+as+a+lipid+droplet-associated+protein+and+its+possible+involvement+in+the+biogenesis+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets.</a> J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).</li>
<li>Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet-associated+proteins+in+primary+adipocytes+of+normal+and+obese+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse.</a> Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).</li>
<li>Jagerstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+interact+with+mitochondria+using+SNAP23%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23.</a> Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).</li>
<li>Xu, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FATP1-DGAT2+complex+facilitates+lipid+droplet+expansion+at+the+ER-lipid+droplet+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface.</a> J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).</li>
<li>Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+localizes+to+lipid+droplets+and+induces+their+close+apposition+to+the+endoplasmic+reticulum-derived+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane.</a> J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).</li>
<li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+size+of+lipid+droplets%3A+lipid+and+protein+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).</li>
<li>Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactomic+study+on+interaction+between+lipid+droplets+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria.</a> Protein Cell. 2, 487-496 (2011).</li>
<li>Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li>
<li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gregarious+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li>
<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+fat%3A+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案中的关键步骤
培养细胞时，务必保持培养基和细胞密度的一致性。 细胞内的脂滴具有独特性，其相关蛋白高度依赖于细胞培养的环境17。因此，在细胞裂解前应严格监控细胞培养所用的培养基及细胞密度。
脂滴的蛋白质组成与酵母细胞的生长阶段有关。与静止期相比，对数生长期的细胞中结合到脂滴上的蛋白质较少。此外，原生质球制备效率也取决于酵母细胞的生长阶段。处于对数生长期的细胞比处于静止期的细胞能产生更高的原生质球得率，因为后者对酶处理更具抗性。


务必使用温和的方法破碎细胞。 优先选择通过酶消化降解酵母细胞壁的方法，而非通过外力破坏细胞壁的技术。后者可能破坏脂滴的结构完整性，导致结合的蛋白质或脂质丢失。
...

细胞脂滴是细胞中具有多种功能的动态细胞器。它们是中性脂质的储存中心，这些脂质可被转化为能量或用于磷脂合成。脂滴在包括动脉粥样硬化、肥胖及相关代谢性疾病以及感染性疾病在内的生理和病理过程中发挥核心作用1,2。此外，它们也是生物柴油燃料的潜在来源。

关于脂滴在细胞中功能的大量信息，均来自对从多种生物体中分离纯化的脂滴进行的蛋白质组学和脂质组学分析3。这些生物体包括细菌4,5、酵母6-11、植物12,13、线虫14以及果蝇15,16。鉴于人们对脂滴在人类代谢性疾病中作用的兴趣，研究人员也已从培养的动物细胞和动物组织中分离出脂滴。所使用的培养细胞系包括3T3-L1脂肪细胞17、中国仓鼠卵巢（CHO）K2细胞18、人肝细胞19,20以及上皮细胞系21。已成功分离脂滴的动物组织包括小鼠骨骼肌22、肝脏23和乳腺组织23。如上所述，大多数脂滴分离研究的目标是对结合在脂滴上的蛋白质进行蛋白质组学分析，以及对中性脂质和磷脂进行脂质组学分析。
由于中性脂质——脂滴中最丰富的组分——的密度低于大多数其他细胞物质，因此传统上采用密度梯度离心法来分离脂滴。该技术是本文所介绍的两种制备方法的核心。本文将先前的技术6,24&#160;进行了整合与改进，并以可视化方式展示从培养的裂殖酵母细胞以及从胎盘组织获取的非培养人源细胞中分离脂滴的过程。本方法旨在通过选用两种截然不同的细胞类型作为脂滴分离的起始材料，展示该技术的广泛适用性。该技术应适用于希望从大多数生物体中分离脂滴的研究人员。
方案1描述了从裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中分离脂滴的方法，该酵母已被用作观察真核细胞分裂过程中脂滴形成的模型25。出芽酵母Saccharomyces cerevisiae则被广泛用作研究脂滴生物学的模式生物。方案1适用于这两种生物，文中同时指出了样品制备过程中的差异。

方案2描述了从胎盘绒毛细胞中分离脂滴的方法，这些绒毛细胞来源于人类足月胎盘。收集足月胎盘为安全且符合伦理地获取200-250 g&#160;易于获得的人体组织26提供了独特的机会，该组织中含有大量脂滴。这与大多数高等真核生物中脂滴分离的研究不同，后者通常使用培养细胞作为脂滴来源。在那些研究中，常向培养体系中添加脂肪酸以促进中性脂质的合成，从而促进脂滴的生长。而本研究中的脂滴是在胎盘组织的天然条件下形成的。

通过使用细胞器标志物抗体进行蛋白质印迹分析，确定脂滴组分的纯度。这两种方案所获得的脂滴组分适用于后续的蛋白质组学和脂质组学分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;方案 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1. 酵母细胞培养及原生质体制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>爱丁堡最小培养基（EMM）</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>含5种补充物的酵母提取物培养基（YE5S）</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S 培养基含每种补充物 225 mg/ml：腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、尿嘧啶。对应芽殖酵母的等效培养基为 YPD。</td></tr><tr><td>YPD 粉末</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>用于 &lt;i&gt;S. cerevisiae&lt;/i&gt;</td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>酵母裂解酶</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>来自哈茨木霉的溶壁酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>用于 &lt;i&gt;S. cerevisiae&lt;/i&gt;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>1 L 玻璃瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.8 L 锥形瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 酵母脂滴分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por 透析膜</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管 25 mm × 89 mm（用于 SW28）</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por 透析膜</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>温控摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR 离心机</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>摆动桶式离心转子</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100y 固定角转子</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 超速离心转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1. 胎盘绒毛细胞分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性垫巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌盆（容器），3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀，尖头，直刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>伦敦镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>1108002</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 筛杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 目筛网&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 细胞过滤器 100 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，II 型，来自牛胰腺</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 锥形瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 从绒毛胎盘细胞中分离脂滴&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管 25 mm × 89 mm（用于 SW28）</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管 14 mm × 89 mm（用于 SW41）</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温控摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR 离心机</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>摆动桶式离心转子</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 超速离心转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti 超速离心转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western blot&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 山羊抗兔 IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>稀释比例 1:15,000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案 1 所用一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>由 G. Daum 博士惠赠</td><td>奥地利格拉茨工业大学</td><td>稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>由 G. Daum 博士惠赠</td><td>奥地利格拉茨工业大学</td><td>稀释比例 1:5,000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>由 G. Daum 博士惠赠</td><td>奥地利格拉茨工业大学</td><td>稀释比例 1:10,000</td></tr><tr><td>Vma1p（抗 ATP6V1A）</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方案 2 所用一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2（抗 ADFP）</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>稀释比例 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>稀释比例 1:50</td></tr></tbody></table>

从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

脂滴是存在于大多数真核细胞及某些原核细胞中的动态细胞器。从结构上看，脂滴由中性脂质核心构成，外周包裹一层磷脂单分子层。在研究脂滴细胞功能的过程中，蛋白质组学鉴定其结合蛋白是一项极为有用的技术，这些结合蛋白可随脂滴一同被分离出来。本文介绍了两种用于分离脂滴及其结合蛋白的方法，分别适用于两类差异较大的真核细胞：裂殖酵母和人胎盘绒毛细胞。尽管这两种方法存在差异，其主要步骤均基于密度梯度离心法。&#160;两种制备方法均具备这一特点，表明所介绍的液滴分离技术具有广泛的适用性。

在第一个实验方案中，通过酶解消化酵母细胞的细胞壁，将其转化为原生质球。随后，使用间隙较松的匀浆器轻柔裂解所得的原生质球。向裂解液中加入蔗糖密度梯度介质Ficoll，混合物共进行三次离心。第一次离心后，脂滴与内质网（ER）、质膜以及液泡共同位于离心管中呈白色浮层的部分。接下来的两次离心用于去除其余这三种细胞器。最终获得仅含有脂滴及其结合蛋白的组分层。

在第二个实验方案中，通过胰蛋白酶和DNase I酶消化法从人足月胎盘中分离出胎盘绒毛细胞。使用松配合的匀浆器对细胞进行匀浆。采用低速和中速离心步骤去除未破碎的细胞、细胞碎片、细胞核和线粒体。向匀浆液中加入蔗糖以形成密度梯度，然后通过离心将脂滴与其他细胞组分分离。

通过蛋白质印迹分析证实了两种方案中脂滴的纯度。两种制备方法所得的脂滴组分均适用于后续的蛋白质组学和脂质组学分析。

如果密度梯度离心按预期进行，浮起的层应含有脂滴，并在整个高速离心过程中基本不含其他细胞器。
对于方案1，使用脂滴标志物抗体（Erg6p）以及已发现与酵母中脂滴相互作用的细胞器标志物抗体进行Western印迹分析，包括内质网（Dpm1p）、线粒体（Por1p）、质膜（Pma1p）和液泡（Vma1p）。
分别收集三次离心（步骤 3.7、3.10 和 3.13）后各样品上清层的等体积部分，用三氯乙酸（终浓度 15%）沉淀，并溶于水中。取 13 µL 细胞裂解液（图 3A，“Lys”）以及三次离心所得的蛋白质样品（图 3A，“Spin1”、“Spin2”和“Spin3”），在 12% SDS-PAGE 凝胶上进行分离，随后转至硝酸纤维素膜，并用细胞器特异性抗体进行免疫印迹分析。结果符合预期：脂滴标志蛋白 Erg6p 在三次离心后的上清层中均存在（图 3A）；Por1p 在第一次离心（Spin1）后的上清层中不存在（图 ...

介绍了两种分离细胞脂滴的方法，分别来自1）酵母细胞和2）人胎盘。这两种方法的核心步骤均为密度梯度离心，其中含有脂滴的上浮层可通过肉眼清晰观察，随后可被提取，并通过蛋白质印迹分析检测其纯度。

脂滴是存在于大多数真核细胞和某些原核细胞中的动态细胞器。结构上，脂滴由一个核心组成，该核心……

本实验的总体目标是从组织中分离脂滴。首先解剖并分离胎盘组织，然后对油粒细胞进行匀浆处理。然后通过多步离心分离细胞器。最后收集含有脂滴的上浮层，并对脂滴进行表征。最终，采用荧光显微镜和蛋白质印迹分析来验证脂滴组分的纯度。该技术的主要优势在于能够从大多数主动脉细胞中分离出脂滴。需注意的是，在某些组织中，脂滴的数量可能较少，从而降低漂浮的 G 层以及可收集的脂滴数量。胎盘样本采集自足月妊娠、在自发临产开始前接受择期剖宫产手术的健康单胎孕妇，所有受试者均签署了书面知情同意书，同意采集其胎盘用于研究。胎盘的采集及后续使用已获得诺克斯维尔田纳西大学及田纳西大学医学研究生院的批准。在生物安全柜内，将胎盘转移至无菌可高压灭菌的容器中，并使用无菌生理盐水仔细清洗胎盘及膜上的血液。将含有血液的生理盐水作为液体生物废弃物，弃置于1升烧杯中。将胎盘放置于无菌操作台上，使带有脐带的光滑面朝上，使用锋利的精细剪刀和镊子。去除脐带和胎儿膜。接着，将胎盘翻转，使母体面朝上。然后从表面去除约三毫米的覆盖基底层组织。每次解剖一条COTA导联，避免接触绒毛膜板，并将绒毛组织收集到含有生理盐水的250毫升烧杯中。接着使用0.9%无菌生理盐水和镊子，在另一个烧杯中通过涡旋冲洗组织数次，并将废液倒入1升烧杯中。每次将一个胚胎干细胞系转移至150毫米的培养皿中。用镊子夹住组织，使用剃刀刀片将血管上的组织刮入培养皿中。将刮下的组织放入另一个含有0.9%无菌生理盐水的烧杯中。对所有组织块重复此操作。用细胞解离缓冲液冲洗刮取的组织后，去除多余液体并称重以消化胎盘组织。配制好组织消化液后，将采集的全部组织中60克转移至一个500毫升无菌赫氏梅耶烧瓶中。将组织消化混合液加入含有组织的烧瓶中，在37摄氏度下以150转/分钟的振荡速度孵育45分钟。孵育结束后，倾斜烧瓶使组织沉淀，收集上清液。注意不要收集未解离的组织。在将上清液转移至无菌的15毫升离心管之前，加入等体积的HBSS。每批样品在1000 × g离心后，对剩余的未解离组织部分重复进行解离和上清液收集。在4摄氏度下离心15分钟，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。胎盘绒毛细胞主要位于沉淀物的白色部分，覆盖于红细胞之上。将沉淀物白色部分中的绒毛细胞转移至无菌的50毫升锥形离心管中，并置于冰上保存。在收集全部三个消化阶段的细胞后，将一个孔径为100微米的尼龙细胞筛置于无菌50毫升锥形离心管顶部，过滤细胞悬液。若细胞悬液过滤速度变慢，可将滤器向上提起以产生负压，使液体流入管中。随后在4摄氏度、1000倍重力条件下离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。在生物安全柜中使用新配制的低渗裂解液（HLM）对胎盘绒毛细胞进行均质化处理时，向细胞沉淀中加入相当于其体积四倍的预冷HLM。使用10毫升移液管轻柔且充分地重悬细胞。通过上下吹打混悬细胞。将细胞在冰上孵育10分钟后，转移至预冷的玻璃-玻璃匀浆器中，用松配合的研杵缓慢匀浆，轻轻研磨20至25次。将裂解液在 3000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，以去除未破碎的细胞。然后将上清液收集到新管中，再在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。为通过超速离心分离脂滴并去除线粒体，将上清液收集至 50 mL 离心管中。调节至20%蔗糖，转移至用于S SW 28转子或等效转子的超速离心管底部，加入约10毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5至1毫升冰浴的HLM，以装满离心管。使用S SW 28水平转子离心机，在4°C、130,000 × g条件下离心45分钟。随后收集上浮层，调节至10%蔗糖，转移至用于SW 41 TI转子或等效转子的13.2毫升超速离心管底部，在密度调节后的上清液上覆盖约5毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5毫升冰浴的HLM，于SW 41 TI转子中在4°C、274,000 × g条件下离心60分钟。随后，使用1毫升移液器小心收集顶部含有脂滴的上浮层。将体积调整至含10%蔗糖，再次转移至13.2毫升超速离心管中，然后在上层覆盖5毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5毫升冰浴HLM。离心30分钟后，使用弯头PE吸管小心收集顶部白色漂浮层（含脂滴）至三个含有100微升HLM的1.5毫升离心管中。根据本图所示文本方案对脂滴进行表征，通过使用特异性结合中性脂质的荧光染料BODIPY 493/503染色，并利用荧光显微镜观察，证实了从人足月胎盘绒毛细胞中分离出的脂滴的存在。如图所示，通过使用标记蛋白进行蛋白质印迹（Western blotting）来评估分离的脂滴组分的纯度，所用标记蛋白包括脂滴标志物 perilipin、内质网标志物 calnexin、高尔基体标志物 GM130、线粒体和质膜标志物 COX IV，以及 MEK1。脂滴经冷丙酮脱脂后提取蛋白质，各组分随后进行抗 perilipin 的蛋白质印迹分析。其次，脂滴蛋白在核上清液以及含有脂滴的分离出的白色漂浮层中均被检测到。在漂浮层下方的第四次和第五次离心所得各层中，脂滴组分内均未检测到质膜特异性蛋白，如MK1和GM130。如先前报道所述，在脂滴组分的其他部分中检测到了内质网蛋白钙联蛋白（calnexin）以及线粒体膜蛋白COX4的微弱信号。这些结果与早期的报道一致，表明脂滴在哺乳动物细胞中与线粒体以及内质网（ER）存在相互作用。在完成该实验步骤后，可进一步采用蛋白质组学和脂质组学等方法，以研究其他相关问题，例如有哪些因子结合在脂滴上。

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