从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

本实验的总体目标是从组织中分离脂滴。首先解剖并分离胎盘组织，然后对油粒细胞进行匀浆处理。

然后通过多步离心分离细胞器。最后收集含有脂滴的上浮层，并对脂滴进行表征。最终，采用荧光显微镜和蛋白质印迹分析来验证脂滴组分的纯度。

该技术的主要优势在于能够从大多数主动脉细胞中分离出脂滴。需注意的是，在某些组织中，脂滴的数量可能较少，从而降低漂浮的 G 层以及可收集的脂滴数量。胎盘样本采集自足月妊娠、在自发临产开始前接受择期剖宫产手术的健康单胎孕妇，所有受试者均签署了书面知情同意书，同意采集其胎盘用于研究。

胎盘的采集及后续使用已获得诺克斯维尔田纳西大学及田纳西大学医学研究生院的批准。在生物安全柜内，将胎盘转移至无菌可高压灭菌的容器中，并使用无菌生理盐水仔细清洗胎盘及膜上的血液。将含有血液的生理盐水作为液体生物废弃物，弃置于1升烧杯中。

将胎盘放置于无菌操作台上，使带有脐带的光滑面朝上，使用锋利的精细剪刀和镊子。去除脐带和胎儿膜。接着，将胎盘翻转，使母体面朝上。

然后从表面去除约三毫米的覆盖基底层组织。每次解剖一条COTA导联，避免接触绒毛膜板，并将绒毛组织收集到含有生理盐水的250毫升烧杯中。接着使用0.9%无菌生理盐水和镊子，在另一个烧杯中通过涡旋冲洗组织数次，并将废液倒入1升烧杯中。

每次将一个胚胎干细胞系转移至150毫米的培养皿中。用镊子夹住组织，使用剃刀刀片将血管上的组织刮入培养皿中。将刮下的组织放入另一个含有0.9%无菌生理盐水的烧杯中。

对所有组织块重复此操作。用细胞解离缓冲液冲洗刮取的组织后，去除多余液体并称重以消化胎盘组织。配制好组织消化液后，将采集的全部组织中60克转移至一个500毫升无菌赫氏梅耶烧瓶中。

将组织消化混合液加入含有组织的烧瓶中，在37摄氏度下以150转/分钟的振荡速度孵育45分钟。孵育结束后，倾斜烧瓶使组织沉淀，收集上清液。

注意不要收集未解离的组织。在将上清液转移至无菌的15毫升离心管之前，加入等体积的HBSS。每批样品在1000 × g离心后，对剩余的未解离组织部分重复进行解离和上清液收集。

在4摄氏度下离心15分钟，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。胎盘绒毛细胞主要位于沉淀物的白色部分，覆盖于红细胞之上。将沉淀物白色部分中的绒毛细胞转移至无菌的50毫升锥形离心管中，并置于冰上保存。

在收集全部三个消化阶段的细胞后，将一个孔径为100微米的尼龙细胞筛置于无菌50毫升锥形离心管顶部，过滤细胞悬液。若细胞悬液过滤速度变慢，可将滤器向上提起以产生负压，使液体流入管中。随后在4摄氏度、1000倍重力条件下离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。在生物安全柜中使用新配制的低渗裂解液（HLM）对胎盘绒毛细胞进行均质化处理时，向细胞沉淀中加入相当于其体积四倍的预冷HLM。

使用10毫升移液管轻柔且充分地重悬细胞。通过上下吹打混悬细胞。将细胞在冰上孵育10分钟后，转移至预冷的玻璃-玻璃匀浆器中，用松配合的研杵缓慢匀浆，轻轻研磨20至25次。

将裂解液在 3000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，以去除未破碎的细胞。然后将上清液收集到新管中，再在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。为通过超速离心分离脂滴并去除线粒体，将上清液收集至 50 mL 离心管中。

调节至20%蔗糖，转移至用于S SW 28转子或等效转子的超速离心管底部，加入约10毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5至1毫升冰浴的HLM，以装满离心管。使用S SW 28水平转子离心机，在4°C、130,000 × g条件下离心45分钟。随后收集上浮层，调节至10%蔗糖，转移至用于SW 41 TI转子或等效转子的13.2毫升超速离心管底部，在密度调节后的上清液上覆盖约5毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5毫升冰浴的HLM，于SW 41 TI转子中在4°C、274,000 × g条件下离心60分钟。随后，使用1毫升移液器小心收集顶部含有脂滴的上浮层。

将体积调整至含10%蔗糖，再次转移至13.2毫升超速离心管中，然后在上层覆盖5毫升冰浴的100毫摩尔/升碳酸钠缓冲液和0.5毫升冰浴HLM。离心30分钟后，使用弯头PE吸管小心收集顶部白色漂浮层（含脂滴）至三个含有100微升HLM的1.5毫升离心管中。根据本图所示文本方案对脂滴进行表征，通过使用特异性结合中性脂质的荧光染料BODIPY 493/503染色，并利用荧光显微镜观察，证实了从人足月胎盘绒毛细胞中分离出的脂滴的存在。

如图所示，通过使用标记蛋白进行蛋白质印迹（Western blotting）来评估分离的脂滴组分的纯度，所用标记蛋白包括脂滴标志物 perilipin、内质网标志物 calnexin、高尔基体标志物 GM130、线粒体和质膜标志物 COX IV，以及 MEK1。脂滴经冷丙酮脱脂后提取蛋白质，各组分随后进行抗 perilipin 的蛋白质印迹分析。

其次，脂滴蛋白在核上清液以及含有脂滴的分离出的白色漂浮层中均被检测到。在漂浮层下方的第四次和第五次离心所得各层中，脂滴组分内均未检测到质膜特异性蛋白，如MK1和GM130。如先前报道所述，在脂滴组分的其他部分中检测到了内质网蛋白钙联蛋白（calnexin）以及线粒体膜蛋白COX4的微弱信号。

这些结果与早期的报道一致，表明脂滴在哺乳动物细胞中与线粒体以及内质网（ER）存在相互作用。在完成该实验步骤后，可进一步采用蛋白质组学和脂质组学等方法，以研究其他相关问题，例如有哪些因子结合在脂滴上。