Name: 检测持久性病毒的DNA在神经组织中的荧光的基因组与成绩单原位杂交结合免疫组化染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学习使用荧光原位杂交技术检测三叉神经节中单纯疱疹病毒一型基因组的方法。该技术可在单细胞水平可视化病毒基因组定位，为研究病毒潜伏机制提供重要工具。

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感谢 N. Sawtell（美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医学中心）、S. Efstathiou（英国剑桥大学）和 James Hill（美国路易斯安那州立大学健康科学中心，新奥尔良）分别提供了 HSV-1 感染的小鼠和兔子样本及相关试剂；感谢 H. Masumoto（日本千叶县香取 DNA 研究所）和 S. Khochbin（法国格勒诺布尔阿尔伯特·博尼奥特研究所）在研究讨论中提供的帮助。
本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）（ATIP项目，资助对象：PL，http://www.cnrs.fr）和法国国家研究局（ANR）（项目编号：ANR-05-MIIM-008-01，CENTROLAT）的资助项目支持。 <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a>），FINOVI基金会（<a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a>），里昂大学 LabEX DEVweCAN（ANR-10-LABX-61）项目 &#34;未来投资&#34; （由法国国家研究局ANR运营的ANR-11-IDEX-0007）<a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a>），法国癌症研究协会（ARC-7979 和 ARC-4910， <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a>），法国抗癌联盟（LNCC， <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a>）以及INCa（EPIPRO项目， <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e-cancer.fr</a>）。FC 和 PL 是法国国家科学研究中心（CNRS）的研究人员。

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文所述方案可用于检测小鼠神经组织切片中神经元内的HSV-1潜伏基因组。由于缺乏检测HSV-1基因组DNA的有效方法，目前对调控病毒基因表达通路的理解仍十分有限 原位 在神经组织内，基因组拷贝数及感染神经元比例的信息主要来源于对解离神经元的PCR分析11,12在阐明宿主细胞核结构在HSV-1潜伏感染中的作用时，我们旨在通过DNA-FISH技术确定潜伏感染小鼠神经元细胞核内HSV-1基因组的定位。我们测试了多种DNA-FISH实验方案及组织处理方法，发现基于加热的处理方式效果最佳。 &#34;表位去封闭&#34; 作为病毒DNA-FISH检测的关键步骤。该处理方法通常用于免疫组织化学中揭示石蜡包埋切片中的蛋白质表位。尽管该技术在病理学领域几乎被普遍采用，但在DNA-FISH中并未常规使用。尽管已有大量研究支持该技术可在光学显微镜水平保持组织形态，使用者仍应针对其特定的生物系统设置适当的对照以验证此点。38在我们的实验中，其他去封闭方法（如蛋白酶处理）均未能实现HSV-1 DNA的检测，而使用不同缓冲液进行基于加热的去封闭处理则 consistently 使HSV-1潜伏期基因组...

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种持续性的人类嗜神经病毒，可在周围神经系统三叉神经节（TG）的神经元中建立长期潜伏感染，并可周期性地被激活，进行复制和传播。HSV-1基因组为150 kb的双链DNA，定位于宿主神经元细胞核内，以多拷贝染色质化质粒的形式存在，不会整合到宿主细胞基因组中1,2。在潜伏期间，HSV-1的复制周期基因程序被强烈抑制，基因表达仅限于潜伏相关转录本（LAT）位点，从潜伏建立直至再激活启动阶段均如此3。LAT可产生一条长8.5 kb的非编码RNA，加工后形成一条主要的2 kb稳定套索结构RNA，并生成多个miRNA4-7。因此，HSV-1潜伏感染的特征是存在病毒基因组DNA和LAT RNA，而无可检测到的复制周期蛋白。
动物模型，主要是小鼠和兔，是可重现人类潜伏感染多种特征的实验模型。这些模型的主要优势在于，它们能够在免疫功能健全的宿主体内研究HSV-1潜伏期的生理学特性。在过去几十年中，已开发出多种实验工具，例如基因修饰病毒和基因修饰小鼠，用于从动物组织中研究HSV-1潜伏期的生理学、遗传学和细胞生物学特性。迄今为止，病毒基因组DNA通常通过Southern印迹法和定量PCR（qPCR）从分离的三叉神经节（TG）中检测和定量。然而，目前尚无可用的方法用于直接在组织中检测HSV-1基因组 原位 组织切片杂交8因此，通常通过RNA原位杂交检测组织切片中的LAT RNA来评估潜伏期 原位 杂交而非病毒基因组检测。由于无法根据病毒基因组的存在来鉴定被感染的细胞，这一技术局限性严重阻碍了对宿主-病毒相互作用多个方面的研究，例如病毒基因组与细胞及病毒基因表达之间的关系。&#160;或宿主细胞介导的免疫反应9,10.
最重要的是，潜伏感染的细胞间异质性仍相对缺乏研究，并已被证明是小鼠以及植入SCID小鼠体内的人类感觉神经节神经元中潜伏感染的关键特征11-17。通常通过qPCR显示，每个细胞中HSV-1基因组拷贝数从5到数百不等。尽管LAT被认为是调控潜伏和再激活的关键因子，但对分离神经元的qPCR分析以及原位PCR结果表明，仅有部分潜伏感染的神经元（低至30%）表达LAT基因座11,12,18-21。宿主细胞及其组织微环境如何影响病毒潜伏的建立及病毒基因表达，目前尚不明确。本文中，我们描述了一种可靠的荧光原位杂交（FISH）方法，可高效检测动物神经组织切片中低拷贝数的HSV-1基因组DNA。该方法由我们设计并使用，旨在获得高分辨率显微成像，从而研究病毒基因组与宿主细胞核内组分之间的相互作用22。此外，我们还描述了一种多重染色方法，可同时检测病毒DNA、RNA和蛋白质，这是描述调控病毒基因表达的病毒-宿主相互作用的独特工具。该方法也可广泛应用于需要检测HSV-1潜伏基因组的各类分析，例如在大量组织切片中定量感染的神经元。其中关键步骤是进行抗原修复处理，以使病毒DNA能够暴露并适用于杂交。因此，本方案也可能适用于其他目前无法通过传统DNA-FISH方法在动物组织中检测的双链DNA病毒的检测。

<table><tbody><tr><td>Balb/c 小鼠</td><td>Janvier，法国</td><td></td><td>6 周龄雌性</td></tr><tr><td>HSV-1 毒株</td><td>SC16 毒株（野生型）</td><td></td><td>详见 Labetoule, M. 等人 &lt;em&gt;Invest. Ophthalmol. Vis. Sci&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;44&lt;/strong&gt;, 217&amp;ndash;225 (2003)，了解 HSV-1 毒株及病毒储备液制备的详细信息。</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>腹腔注射含盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的溶液</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>将 4 g PFA 悬浮于 90 ml 水中。加入 50 &amp;micro;l 1N NaOH，并在 60 &amp;deg;C 水浴中搅拌加热。PFA 约 30 分钟内溶解。加入 10 ml 10x PBS。该溶液可预先配制，并分装于 5 ml 管中，于 -20 &amp;deg;C 保存。注意：应在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS，pH 7.4（无菌）</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>用 1x PBS 配制 20% 蔗糖溶液。</td></tr><tr><td>冷冻切片包埋介质 — Tissue-Tek OCT 化合物</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大容量质粒 DNA 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>用于纯化含 HSV-1 基因组的 Cosmid 或 BAC 载体，并于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>缺口平移试剂盒</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53021</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>G50 Mini 离心柱</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>鲑鱼精子 DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分子生物学级乙醇</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>配制 70% 溶液</td></tr><tr><td>鲑鱼精子 DNA</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分子生物学级甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>注意：应在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>HSV-1 生物素标记商用探针&amp;nbsp;</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-40838</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20x 柠檬酸钠盐溶液（SSC）</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 配制 2x SSC 溶液。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用蒸馏水配制 10% 储备液，4 &amp;deg;C 保存。使用前用 1x PBS 配制 0.5% 溶液。</td></tr><tr><td>10 mM 柠檬酸钠 pH 6.0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>配制 100 mM 储备液（10x）。称取 10.5 g 柠檬酸（分子量 210.14）。注意：具刺激性和毒性，需佩戴适当口罩和手套。用 1 N NaOH 调节 pH 至 6.0（注意：具刺激性，需戴手套）。用蒸馏水定容至 500 ml。使用前用蒸馏水稀释 10 倍。</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分子生物学级甲醇</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖 — 分子量 500,000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Denhardt 溶液（100x）</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>橡胶水泥 &quot;FixoGum&quot;</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒&amp;nbsp; — Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T7 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 转录试剂盒</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物素-16-UTP</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>11388908910</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNA 纯化微型柱</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>核糖核苷酸钒酸复合物</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>用蒸馏水配制 3% 溶液。4 &amp;deg;C 保存并避光。</td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>用无 RNA 酶水配制 10 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一抗</td><td>任意供应商</td><td></td><td>结果部分使用的一抗包括：抗小鼠 CENP-A（兔单克隆抗体 C51A7，Cell Signaling Technologies）和抗 ATRX H-300（Santa Cruz Biotechnology）</td></tr><tr><td>荧光标记二抗</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>本方案常规使用的荧光二抗为 Alexa Fluor 标记的山羊抗体（IgG H+L）。结果部分使用的抗体为 Alexa Fluor 488 标记的抗兔山羊抗体（货号 A11001）</td></tr><tr><td>酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 350（蓝色荧光）</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>TSA 试剂盒也可从 Perkin Elmer 购得</td></tr><tr><td>酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 488（绿色荧光）</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>使用前立即用 1x PBS 配制 0.5 &amp;micro;g/ml 溶液。剩余溶液应丢弃。</td></tr><tr><td>22 mm × 50 mm 盖玻片，n&amp;deg;1.5 玻璃</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-04</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含抗淬灭剂的封片介质 — VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>其他常规产品包括 Electron Microscopy Science 的 Fluoromount G</td></tr><tr><td>Superfrost 玻片</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>仪器/材料</td><td>公司</td><td>货号</td><td>备注</td></tr><tr><td>感染用针头</td><td></td><td></td><td>热拉制玻璃微量移液管，定制。</td></tr><tr><td>解剖器械</td><td>Moria，法国</td><td></td><td>显微手术剪和镊子</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>微量注射泵装置（Nano Pump）</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica France</td><td>CM 1510-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 冰箱</td><td>Sanyo</td><td></td><td>超低温 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>家用微波炉</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>干浴加热器</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>孵育板槽（Slide moat）</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coplin 染色缸</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>染色玻璃容器</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>结果部分图像使用 Zeiss AxioObserver 显微镜采集，物镜为 40X LD NeoFluor N.A 0.6 和 100X PlanApochromat N.A 1.3。滤光片组 #38、#43 和 #43。HXP 120 荧光光源。Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD 相机。信号在较新型的高效显微镜（如 Zeiss AxioImager/AxioObserver 系列、Nikon Ti-E/Ni-E 系列或 Leica DM/DMI6000 系列）上更容易观察到</td></tr></tbody></table>

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性dna病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

单个细胞中基因、其RNA产物及细胞调控蛋白的共检测对于研究基因表达调控至关重要。在病毒学领域，这是一项挑战，特别是对于那些需要动物模型进行研究的核内复制的持久性DNA病毒。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终生潜伏感染。潜伏病毒作为储存库，可被重新激活并引发新的疱疹发作。目前对HSV-1潜伏期的细胞生物学机制仍知之甚少，部分原因在于缺乏检测HSV-1基因组的有效方法 原位 在动物模型中。我们描述了一种DNA-荧光 原位 杂交（FISH）方法，可高效检测感染动物模型神经组织切片中低拷贝数的病毒基因组。该方法依赖于基于热处理的抗原修复，以及直接标记的自制DNA探针或商业化探针。我们建立了一种三重染色方法，将DNA-FISH与RNA-FISH相结合&#160;以及免疫荧光染色，采用基于过氧化物酶的信号放大方法以满足各种染色需求。主要改进在于能够在10 µm厚的组织切片中获得背景信号低的染色结果，并可通过共聚焦显微镜和宽场常规落射荧光显微镜进行高分辨率成像。此外，该三重染色法适用于多种针对细胞和病毒蛋白的抗体。完整实验流程共需2.5天，以确保抗体和探针充分渗透入组织。

经过数月的广泛测试，我们发现基于加热的化学去封闭处理可使潜伏的HSV-1基因组暴露，从而适用于荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization）。在此过程中，我们尝试了多种去封闭方法，但仅基于加热的处理（即在微波炉中将切片加热至接近沸腾的温度）显示出有效。随后，我们测试了多种常用于免疫组织化学（IHC）和电子显微镜中抗原表位修复的盐缓冲液31,32，包括0.01 M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（我们在所有研究中均使用该缓冲液）、1× PBS、1 mM EDTA、0.1 M Tris-HCl pH 7.4以及蒸馏水。尽管EDTA缓冲液倾向于损伤组织，但其余所有缓冲液均适用于HSV-1的检测，其信号表现为神经元细胞核内单个或多个斑点（图2A；需注意这些组织具有高度自发荧光，部分图像中表现为细胞质内的均匀信号）。在我们的实验条件下，柠檬酸盐缓冲液始终能在不损伤组织的前提下提供良好的信号，因此被选为常规实验方案中的首选缓冲液。
使用直接标记的Cy3-DNA探针（由克隆...

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

单个细胞中基因、其RNA产物及细胞调控蛋白的共检测对于研究基因表达调控至关重要。这是一个挑战……

本实验的总体目标是通过荧光原位杂交技术，检测潜伏感染小鼠三叉神经节切片中单纯疱疹病毒1型的基因组。首先将病毒接种至动物唇部，随后经过28天的孵育期，使病毒在三叉神经节中建立潜伏感染。接着，采集三叉神经节组织，进行包埋和冷冻切片。切片需经过一系列预处理步骤，包括在柠檬酸钠缓冲液中加热的关键步骤。最后，使用特异性针对疱疹病毒的荧光探针进行荧光原位杂交。最终，通过共聚焦显微镜观察，可显示单个感染神经元细胞核内病毒基因组的定位情况。在许多情况下，对各种生命周期的研究需要使用动物模型。本技术的主要优势在于，它采用机构荧光标记方法，能够在单细胞水平上提供数据。HSV感染的皇家杀伤模型可重现人类HSV-1感染自然史的大部分特征。这是该病毒的自然宿主。原发感染发生在口腔组织中，随后病毒从嘴唇传播至两个神经节。这是人类 HSV 潜伏感染的主要部位。结合免疫和染色技术。该方法有助于解答有关疱疹病毒潜伏感染的关键问题，例如病毒如何与细胞核组分相互作用，以及这些相互作用如何影响潜伏状态的维持及病毒最终的再激活。实验开始前，准备一只已麻醉的小鼠和一份HSV-1病毒储备液，用不含酚红的培养基重悬病毒。使用双目立体显微镜，将针头插入左侧上唇黏膜与皮肤交界处的上皮下层。在五秒内注射 0.5 µL 病毒溶液，然后在同一位置进行第二次病毒注射。将小鼠转移至 37 °C 的培养箱或加热垫上，直至其苏醒。然后将其放回饲养笼中，按照文本方案规定的恢复时间进行恢复，再进行灌流固定。在下颌两侧分别剪开，接着在门齿后方剪除鼻尖部分，以暴露鼻腔。用剪刀将腭部从中间剪开，然后将其移至一侧。三叉神经节位于腭部下方，呈白色椭圆形团块，长约2至3毫米，与三叉神经相连。切断两侧三叉神经节的神经分支，使其从脑干上分离。使用手术钳取出神经节，并将其转移至含20%蔗糖的PBS溶液中，于室温孵育24小时。次日室温下，将两个三叉神经节共同包埋于一个冷冻切片包埋块中。将包埋介质在负80摄氏度下冷冻，直至在恒冷切片机上进行切片。将三叉神经节纵向切成10微米厚的切片，并收集到预热至30摄氏度的超粘附载玻片上。每张载玻片可容纳4至5个切片。为载玻片设置多个系列标签可能非常有用。如果计划进行多项后续应用，则在将切片于负80摄氏度保存前，让其干燥5至10分钟。在本方案中，探针的制备是通过使用SI 3D CTP对含有HSV-1基因组30千碱基片段的cosmid进行NIC体外转录标记来完成的。沉淀物以去离子形式的酰胺悬浮，由于第一天掺入了S SI三价离子，应呈现粉红色。将切片置于室温下的载片架上，让切片干燥10分钟。然后在1倍PBS中重新水化切片10分钟。接着，用含0.5% Triton X-100 的1×PBS处理组织，持续20分钟。然后用2×SSC缓冲液洗涤切片三次，每次10分钟，并将切片置于2×SSC中直至去封闭缓冲液加热完成。为进行抗

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