检测持久性病毒的DNA在神经组织中的荧光的基因组与成绩单原位杂交结合免疫组化染色
2014年1月23日
我们原位杂交协议建立一个荧光供于动物模型的组织切片中的持久DNA病毒基因组的检测。这个协议允许研究感染过程由codetection病毒基因组，它的RNA产物，以及单细胞内的病毒或细胞蛋白。
该程序的总体目标是通过荧光原位杂交检测潜伏感染小鼠三叉神经节切片中单纯疱疹病毒的基因组，1 型。这是通过首先将病毒接种在动物嘴唇中，然后是 28 天的潜伏期来实现的，在此期间病毒在三叉神经节中建立。接下来，收获、包埋和冷冻切片三叉神经节。
切片经过多次准备处理，包括在柠檬酸钠缓冲液中加热它们的关键步骤。最后，使用疱疹特异性荧光长袍进行荧光原位杂交。最终，结果可以通过使用共聚焦显微镜显示病毒基因组在个体感染神经元细胞核内的位置。
在许多情况下，研究各种生命周期需要使用动物模型。此处表示的技术的主要优点是它使用研究所流畅化方法提供单细胞级别的数据。HS 感染的皇家杀手模型再现了人类 HSV one 感染自然史的大部分方面。
这就是病毒的自然宿主。原发性感染发生在口腔组织中，然后病毒从嘴唇发展到两个神经节。那是人类 HS V 潜伏期的主要方面 结合两种免疫和染色。
这种方法可以帮助回答有关疱疹病毒潜伏期的关键问题，例如病毒如何与核成分相互作用，以及这些相互作用将如何影响潜伏期的维持并最终重新激活病毒。首先，使用麻醉的小鼠和 HSV one 病毒原液。重悬于不含酚红的培养基中。
使用双目立体镜，将针头插入皮肤粘膜边界左上唇的上皮下层。在 5 秒内注射 0.5 μL 病毒溶液，然后在同一部位进行第二次病毒注射。将鼠标转移到 37 摄氏度的培养箱或加热垫中，直到它醒来。
然后将其放入家笼中等待所需的恢复时间，然后根据文本协议进行 perfu 修复。在下颌的每一侧切割。然后在门牙后面切开鼻尖，露出鼻腔。
用剪刀将上颚切成两半，然后放在一边。三叉神经节位于上颚下方。它们是白色的长方形肿块，长 2 到 3 毫米，与三叉神经相连。
切开神经节两侧的三叉神经分支，将它们从脑干中释放出来。使用手术钳去除神经节并将其转移到 PBS 中的 20% 蔗糖中，让它们孵育 24 小时。第二天在室温下，将两个三叉神经节嵌入单个冷冻切片块中。
包埋培养基，在零下 80 摄氏度下冷冻块，直到在低温恒温器上切片。将三叉神经节纵向切成 10 微米的切片，并将它们收集在加热至 30 摄氏度的超级霜冻载玻片上。一张载玻片可以容纳 4 到 5 个部分。
为幻灯片提供多个序列标签可能很有用。如果计划进行多次下游应用，请让切片干燥 5 到 10 分钟，然后在零下 80 摄氏度下储存。对于该方案，通过NIC翻译用SI 3D CTP标记含有HSV one基因组的30 kb碱基部分的cosms来制备探针。
它沉淀并悬浮在去离子形式的酰胺中，由于在第一天掺入 S SI 3，它应该呈粉红色。将玻片放在室温下的玻片架上，让切片干燥 10 分钟。然后在一个 XPBS 中再水化切片 10 分钟。
接下来，在 1 个 XPBS 中用 0.5% Triton X 100 渗透组织 20 分钟。然后用两个 XSS 洗涤玻片 3 次，每次洗涤 10 分钟，并将它们保存在两个 XSSC 中，直到分离缓冲液被加热。为了揭开掩蔽，在微波炉中预热柠檬酸盐缓冲液，直到缓冲液沸腾。
这是通过在载玻片托盘中填充 200 毫升缓冲液来完成的。将托盘放入装满 500 毫升蒸馏水的较大容器中，并将缓冲液预热至沸腾。然后将玻片转移到托盘中。
验证它们在微波炉中是否完全被缓冲液覆盖。将玻片在缓冲液中加热约 20 秒，直到缓冲液沸腾。不要让缓冲液沸腾。
然后将玻片在室温下冷却 2 分钟，再重复加热循环 6 次。凭经验确定进食周期的数量和持续时间对于揭开掩蔽步骤的可重复性至关重要。微波炉、托盘、容器、托盘中的缓冲区体积。
容器中的水量应保持相同加热完成后。在通风橱下将玻片放入两个 XSSC 中转移 5 分钟，然后将玻片在 3 到 1 到 4 的甲醇、乙酸和 PBS 溶液中孵育 15 分钟。然后将玻片放入新鲜制备的 3：1 甲醇与乙酸混合物中孵育 15 分钟。
现在通过在 70% 乙醇中连续孵育 10 分钟，然后在纯乙醇中孵育两次 10 分钟，使切片脱水。让玻片在室温下干燥 10 分钟，以便为探针做好准备。将 80 微升探测溶液滴加于干燥切片上，并用盖玻片盖住。
检查探测溶液是否分布在盖玻片的整个表面上，并且没有气泡。然后用橡胶水泥密封盖玻片并晾干。通过将玻片在 80 摄氏度下孵育 5 分钟来进行变性。
然后将玻片快速转移到冰上的金属托盘上 5 分钟。然后第二天在 37 摄氏度下进行过夜杂交。用镊子去除橡胶粘接剂，将载玻片放在 37 摄氏度的加热块上。
用手术刀刀片的尖端轻轻取下盖玻片。接下来，用 SSC 反复清洗切片。现在，在一个 XPBS 中，用适当的染料（如 DAPI 或钩状 3 3 3 4 2）以 0.5 μg/mL 的浓度对样品进行染色 10 分钟。
然后用 1 个 XPBS 洗涤玻片 3 次，每次洗涤 10 分钟。第三次洗涤后，尽可能多地从载玻片中排出液体。然后在每张玻片的末端，涂抹 80 微升带有防褪色剂的封固剂。
用高光学质量的盖玻片缓慢覆盖介质，避免形成气泡。然后用指甲油密封载玻片，并将其存放在 4 摄氏度的黑暗中。在开发此协议时，测试了几种盐缓冲液的去掩码。
而 EDTA 缓冲液往往会损害组织。柠檬酸钠 tris、HCL 和蒸馏水适用于 HSV one 检测，以验证该方案是否适用于商业探针。使用从 Enzo Biochem 获得的 PAN HSV one 生物素化探针进行 HSV one 潜伏基因组检测，可以检测到 HSV one 基因组的单点和多点模式。
此外，在感染三种常用 HSV one 菌株的小鼠和兔子上测试了 DNA fish 方案。在所有情况下，HSV one 基因组都显示出亮度和强度可变的参差不齐的信号。此外，通过在经历一般疱疹感染的小鼠的组织上进行 DNA 鱼，在 HSV one 的复制周期中测试了该方案的适用性。
在这些动物中，在各种组织中检测到 HSV one 基因组的大而亮的聚集体，包括 DRG 眼睛和大脑。DNA fish 实验方案用途广泛。它允许共同检测 HSV、一个基因组以及病毒或细胞 RNA 和蛋白质。
例如，HSV one 基因组与 HSV one lat RNA 的共检测是可行的，HSV one 基因组与 Centro MERIC 蛋白 CE NPA A 等细胞蛋白的共检测利用 HSV one 与染色质和 PML 核小体的共检测。相关蛋白 A TRX 用三重染色显示红色 HSV 1D NA。它的 RNA 产物 lat 为蓝色，TRX 为绿色。
一旦建立了揭露，DNA fish 程序就非常稳健。它可以在不到 24 小时内分批 20 张或更多玻片完成。该技术的开发将使研究疱疹病毒和其他持久性病毒的研究人员能够在单细胞水平上探索细胞成分和核结构如何影响这些病毒的生物学特性。
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概述
本文介绍了一种荧光原位杂交协议，旨在检测来自潜伏感染小鼠的三叉神经节切片中的单纯疱疹病毒一型基因组。该方法允许在单个神经元中可视化病毒基因组及其RNA产物，从而提供对感染过程的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病毒学
- 细胞生物学
背景
- 单纯疱疹病毒一型可以在三叉神经节中建立潜伏。
- 了解病毒基因组的定位对研究其感染机制至关重要。
- 荧光原位杂交是一种在组织切片中可视化核酸的强大工具。
- 共聚焦显微镜允许对单个细胞进行详细成像。
研究目的
- 开发一种在组织切片中检测单纯疱疹病毒基因组的协议。
- 在感染的神经元中可视化病毒基因组及其RNA产物。
- 增强对细胞水平感染过程的理解。
使用的方法
- 在动物唇部接种病毒。
- 病毒在三叉神经节中建立的28天孵育期。
- 收获、包埋和冷冻切片三叉神经节。
- 使用疱疹特异性荧光探针进行荧光原位杂交。
主要结果
- 在组织切片中成功检测到单纯疱疹病毒基因组。
- 可视化病毒基因组在感染神经元核内的定位。
- 通过共聚焦显微镜展示该方法的有效性。
- 对单细胞水平感染过程的洞察。
结论
- 开发的协议对研究单纯疱疹病毒潜伏有效。
- 荧光原位杂交提供了有关病毒感染动态的宝贵信息。
- 该方法可应用于神经科学中的其他病毒研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables single-cell detection of persistent viral genomes in neuronal tissues, addressing a critical gap in virology research where low-copy viral reservoirs are difficult to visualize. By combining DNA-FISH with RNA-FISH and immunostaining, it provides mechanistic insights into virus-host interactions that inform target validation and antiviral screening strategies. The approach supports preclinical de-risking by clarifying viral latency mechanisms in relevant animal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral genome positioning relative to nuclear components to assess mechanisms of latency maintenance.
- Scientific Value: Supports functional validation of viral and host targets by co-detecting genomes, transcripts, and proteins in individual neurons.
- Scientific Value: Facilitates hypothesis testing about viral reactivation triggers through spatial correlation of viral and cellular signals.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Produces low-background, high-resolution signals compatible with confocal and wide-field microscopy for reliable readouts.
- Operational Value: Works with both custom and commercially available probes, enabling assay flexibility and reagent standardization.
- Operational Value: Accommodates a wide range of antibodies, supporting multiplexed screening of viral and cellular markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses a clinically relevant HSV-1 latency model in mice that mirrors human neuronal infection patterns.
- Translational Value: Enables longitudinal assessment of viral reservoir dynamics in tissues, informing predictive confidence in reactivation risk.
- Translational Value: Supports biomarker discovery by linking viral genome localization to cellular regulatory proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for neurotropic viruses where tissue-specific reservoir analysis is essential.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing how viral genomes interact with nuclear architecture during latency.
- Screening: Generates quantitative spatial data on viral genome copies per cell, enabling compound effect assessment in infection models.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (DNA, RNA, protein) that allow correlation of viral gene expression with host responses.
- Translational Research: Connects findings in rodent ganglia to human-relevant neuropathogenesis, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other persistent DNA viruses and tissue types, promoting platform reuse across virology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral persistence studies through direct visualization of viral nucleic acids.
- Operational Value: Enables reproducible tissue processing with heat-based unmasking that works across antibody and probe types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying reservoir biology that influences reactivation-driven pathogenesis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on latency-relevant mechanism data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, tissue sectioning, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to cryostat, hybridization oven, and confocal or wide-field fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of unmasking cycles and probe concentration across labs for consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to new tissue types may require optimization of permeabilization and antigen retrieval steps.
- Protocol duration of 2.5 days necessitates batch processing planning for high-throughput applications.
