通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

本实验的总体目标是通过荧光原位杂交技术，检测潜伏感染小鼠三叉神经节切片中单纯疱疹病毒1型的基因组。首先将病毒接种至动物唇部，随后经过28天的孵育期，使病毒在三叉神经节中建立潜伏感染。接着，采集三叉神经节组织，进行包埋和冷冻切片。

切片需经过一系列预处理步骤，包括在柠檬酸钠缓冲液中加热的关键步骤。最后，使用特异性针对疱疹病毒的荧光探针进行荧光原位杂交。最终，通过共聚焦显微镜观察，可显示单个感染神经元细胞核内病毒基因组的定位情况。

在许多情况下，对各种生命周期的研究需要使用动物模型。本技术的主要优势在于，它采用机构荧光标记方法，能够在单细胞水平上提供数据。HSV感染的皇家杀伤模型可重现人类HSV-1感染自然史的大部分特征。

这是该病毒的自然宿主。原发感染发生在口腔组织中，随后病毒从嘴唇传播至两个神经节。这是人类 HSV 潜伏感染的主要部位。结合免疫和染色技术。

该方法有助于解答有关疱疹病毒潜伏感染的关键问题，例如病毒如何与细胞核组分相互作用，以及这些相互作用如何影响潜伏状态的维持及病毒最终的再激活。实验开始前，准备一只已麻醉的小鼠和一份HSV-1病毒储备液，用不含酚红的培养基重悬病毒。

使用双目立体显微镜，将针头插入左侧上唇黏膜与皮肤交界处的上皮下层。在五秒内注射 0.5 µL 病毒溶液，然后在同一位置进行第二次病毒注射。将小鼠转移至 37 °C 的培养箱或加热垫上，直至其苏醒。

然后将其放回饲养笼中，按照文本方案规定的恢复时间进行恢复，再进行灌流固定。在下颌两侧分别剪开，接着在门齿后方剪除鼻尖部分，以暴露鼻腔。

用剪刀将腭部从中间剪开，然后将其移至一侧。三叉神经节位于腭部下方，呈白色椭圆形团块，长约2至3毫米，与三叉神经相连。

切断两侧三叉神经节的神经分支，使其从脑干上分离。使用手术钳取出神经节，并将其转移至含20%蔗糖的PBS溶液中，于室温孵育24小时。次日室温下，将两个三叉神经节共同包埋于一个冷冻切片包埋块中。

将包埋介质在负80摄氏度下冷冻，直至在恒冷切片机上进行切片。将三叉神经节纵向切成10微米厚的切片，并收集到预热至30摄氏度的超粘附载玻片上。每张载玻片可容纳4至5个切片。

为载玻片设置多个系列标签可能非常有用。如果计划进行多项后续应用，则在将切片于负80摄氏度保存前，让其干燥5至10分钟。在本方案中，探针的制备是通过使用SI 3D CTP对含有HSV-1基因组30千碱基片段的cosmid进行NIC体外转录标记来完成的。

沉淀物以去离子形式的酰胺悬浮，由于第一天掺入了S SI三价离子，应呈现粉红色。将切片置于室温下的载片架上，让切片干燥10分钟。然后在1倍PBS中重新水化切片10分钟。

接着，用含0.5% Triton X-100 的1×PBS处理组织，持续20分钟。然后用2×SSC缓冲液洗涤切片三次，每次10分钟，并将切片置于2×SSC中直至去封闭缓冲液加热完成。为进行抗原修复，将柠檬酸盐缓冲液在微波炉中预热至沸腾。

通过向玻璃载玻片托盘中加入 200 毫升缓冲液来完成此步骤。将该托盘放入一个较大的容器中，容器内装有 500 毫升蒸馏水，并将缓冲液预热至沸腾。然后将载玻片转移至该托盘中。

确保玻片在微波炉中被缓冲液完全覆盖。将玻片在缓冲液中加热约20秒，直至缓冲液达到沸腾。切勿让缓冲液沸腾溢出。

然后在室温下冷却载玻片两分钟，并重复加热循环六次。为确保抗原修复步骤的可重复性，必须通过实验确定加热循环的次数和持续时间。影响因素包括微波炉、托盘、容器以及托盘中缓冲液体积等。

加热结束后，容器中的水体积应保持相同。在通风橱中将载玻片转移至两倍浓度的XSSC溶液中浸泡五分钟，随后将载玻片在甲醇、乙酸与PBS按3:1:4比例配制的溶液中孵育15分钟。然后将载玻片在新配制的甲醇与乙酸按3:1比例混合的溶液中孵育15分钟。

现在将切片依次在70%乙醇中孵育10分钟进行脱水，随后在纯乙醇中进行两次每次10分钟的孵育。将载玻片在室温下干燥10分钟，以准备进行探针杂交。将80微升探针溶液逐滴加到干燥的切片上，并盖上盖玻片。

检查探针溶液是否已扩散至盖玻片的整个表面，并确保无气泡产生。然后用橡胶胶水封固盖玻片并使其干燥。接着进行变性步骤：将载玻片在80摄氏度下孵育5分钟。

然后迅速将载玻片转移至冰上的金属托盘中，放置五分钟。次日，在37摄氏度下进行过夜杂交。用镊子将载玻片置于37摄氏度的加热块上，去除橡胶胶水。

用手术刀刀尖轻轻取下盖玻片。接着，用 SSC 反复洗涤切片。然后，将样品置于含有适当染料（如 DAPI 或 Hoechst 33342）的 XPBS 中染色 10 分钟，染料浓度为每毫升 0.5 微克。

然后用1×PBS缓冲液洗涤载玻片三次，每次洗涤10分钟。第三次洗涤后，尽可能沥干载玻片上的液体。随后在每张载玻片的两端各加入80 µL含有抗荧光淬灭剂的封片介质。

缓慢地用高光学质量的盖玻片覆盖培养基，避免产生气泡。然后用指甲油密封载玻片，并在4摄氏度避光保存。在本实验方案的开发过程中，测试了多种盐缓冲液用于抗原修复。

尽管EDTA缓冲液容易对组织造成损伤，但柠檬酸钠-三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCL）和蒸馏水适用于HSV-1的检测，从而验证该方案可与商用探针兼容。HSV-1潜伏基因组的检测使用了购自Enzo Biochem的PAN HSV-1生物素化探针，可检测到HSV-1基因组的单个及多个斑点模式。

此外，DNA FISH 方案在感染了三种常用 HSV-1 毒株的小鼠和兔模型上进行了测试。在所有情况下，HSV-1 基因组均显示出亮度和强度可变的斑点状信号。另外，通过对患有全身性疱疹感染的小鼠组织进行 DNA FISH，验证了该方案在 HSV-1 复制周期中的适用性。

在这些动物中，可在多种组织（包括背根神经节、眼睛和脑）中检测到大量且明亮的单纯疱疹病毒一型基因组聚集体。DNA FISH 方案具有高度通用性，可实现单纯疱疹病毒一型基因组与病毒或细胞 RNA 及蛋白质的共检测。

例如，可同时检测 HSV-1 基因组与其 HSV-1 潜伏期 RNA；同时检测 HSV-1 基因组与细胞蛋白（如着丝粒蛋白 CENP-A）的方法也被应用；此外，还可对 HSV-1 与染色质及 PML 核小体进行共定位检测。相关蛋白 ATRX 通过三重染色法进行可视化，其中 HSV-1 DNA 显示为红色，其 RNA 产物 lat 显示为蓝色，ATRX 显示为绿色。

一旦完成去屏蔽设置，DNA FISH 实验流程非常稳定可靠。每批可同时处理 20 张或更多载玻片，且整个过程可在 24 小时内完成。该技术的发展将使研究疱疹病毒及其他持续性病毒的研究人员能够在单细胞水平上探究细胞组分和细胞核结构如何影响这些病毒的生物学特性。