Name: 隔离与人类心室肌细胞的功能研究从新鲜手术样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学习从新鲜手术样品中分离人源心室肌细胞并进行功能研究的方法。该技术采用定制消化装置和酶解方案，可获取具有活性的心肌细胞，用于电生理记录和药物测试，为研究肥厚型心肌病等心脏疾病提供重要工具。

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本工作得到了欧盟（STREP项目241577“BIG HEART”，第七个欧洲框架计划，CP）、美纳里尼国际运营卢森堡公司（AM）、特莱顿基金会GGP07133（CP）和吉利德科学公司（AM）的支持。

涉及人体组织的实验方案已获得卡雷吉大学医院伦理委员会批准（2006/0024713；2009年5月更新）。每位患者均签署了书面知情同意书。
1. 溶液与设备准备
溶液配方见表1。细胞分离流程的简化流程图见图1。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">溶液</td>
			<td>CP</td>
			<td>DB</td>
			<td>KB</td>
			<td>TB</td>
			<td>PS</td>
			<td>EB1</td>
			<td>EB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="23">试剂 (mM)</td>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>140</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mannitol</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>taurine</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td>113</td>
			<td></td>
			<td>136</td>
			<td></td>
			<td>113</td>
			<td>113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td>4.7</td>
			<td>85</td>
			<td>5.4</td>
			<td>25</td>
			<td>4.7</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.2</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>30</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM</td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHBA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>succinic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyruvic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>creatine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">酶 (U/ml)</td>
			<td>Collagenase Type V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Type XXIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td></td>
			<td>7.4 KOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
			<td>7.1 KOH</td>
			<td>7.35 NaOH</td>
			<td>7.2 KOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
			<td>7.3 NaOH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于标本采集、细胞分离及心肌细胞功能表征的溶液。 CP= 心肌停搏液；DB= 解离缓冲液；KB= Kraft-Brühe溶液；TB= 台氏液；PS= 灌流液；EB1= 酶缓冲液1；EB2= 酶缓冲液2。
<ol>
	<li>准备停跳液（CP 溶液）。CP 溶液可在 4℃ 保存 &#176;C，最长可保存1周。</li>
	<li>准备 Ca2+无钙解离缓冲液（DB）。该溶液应在当日内使用。</li>
	<li>配制 Kraft-Brühe (KB) 溶液。KB 溶液可在 4℃ 保存 &#176;C，最长可保存1周。</li>
	<li>准备 Ca2+无钙台氏液（TB）。该溶液应在当天使用。</li>
	<li>使用注射器滤器在使用前过滤所有溶液。</li>
	<li>准备消化装置（图&#160;2），一个由两个相对的硅酮弹性体刷子制成的刮取容器，其中一个刷子由电动马达驱动旋转。该消化装置为定制设备。有关消化装置的详细信息见于 图&#160;8；该设备的图像位于 图2C 和 二维用70%乙醇和水清洗组织培养皿。</li>
</ol>
2. 心肌样本的采集与处理
<ol>
	<li>将40 ml停搏液（CP溶液）倒入50 ml离心管中，置于冰上，用于将标本从手术室运输至细胞分离实验室。</li>
	<li>从手术室获取切除的室壁心肌标本后立即收集，用冰冻的CP溶液冲洗，并储存于试管中。使用开放心脏手术期间从室间隔上部切除的内心膜标本，称重 &#62;100 mg</li>
	<li>迅速将样本转移至实验区域，并在10分钟内开始样本处理&#160;从标本切除开始。</li>
	<li>将标本置于冰冻的CP缓冲液中，于体视显微镜下用精细剪刀小心去除心内膜纤维化层；随后将心肌组织剪成小块（长约2-3 mm）。根据组织样本大小，每次分离选取100 mg至1 g之间的左心室心肌组织。</li>
	<li>组织切碎完成后，将心肌碎块转移至消化装置中，并加入洁净的冰冻CP溶液。心肌碎块的体积不应填满两个硅胶刷之间的整个空间（3–4 ml），总组织量不超过1 g。</li>
</ol>
3. 心肌组织块的洗涤与消化
<ol>
	<li>将组织块转移至消化装置的刮取室后，用冷的Ca2+无钙解离缓冲液（DB）</li>
	<li>将消化装置置于恒温水浴中，使腔室与水浴中的加热用水接触（图1）。将浴槽温度设定为 37.5 &#176;C并打开，以缓慢升高组织浴槽的温度。开启消化装置的电机，将转速设定为1转/秒。</li>
	<li>用 DB 进行 3 次洗涤循环，每 8 分钟更换一次灌流 chamber 中的溶液为新鲜 DB。DB 已预热至 37 &#176;C）并在接触心肌组织块之前用氧气饱和。</li>
	<li>通过向DB溶液中加入250 U/ml V型胶原酶和4 U/ml XXIV型蛋白酶制备酶缓冲液1（EB1）。通过向DB溶液中加入250 U/ml V型胶原酶制备酶缓冲液2（EB2）。将溶液预热至37 &#176;C）并用氧气饱和 EB1 和 EB2。</li>
	<li>在旋转消化装置中，使用100%氧合的EB1溶液进行两次12分钟的消化循环（37 °C）。 &#176;C). 每个循环使用约 3 ml EB1。每次循环后用移液器抽吸去除溶液并弃去。</li>
	<li>准备6个15 ml离心管用于细胞收集，并准备约80 ml冷（4 °C）的KB溶液 &#176;C) 用于洗脱缓冲液的KB溶液。</li>
	<li>进行第一次15分钟&#160;在37℃下用3 ml 100% 氧化的EB2进行消化循环 &#176;C. 消化循环结束后，收集含有首次解离心肌细胞的溶液至15 ml离心管中，并用12 ml冷KB溶液稀释细胞悬液。将离心管平放于室温下保存。</li>
	<li>将剩余的EB2溶液与等体积的DB混合，以使后续消化循环中胶原酶V的浓度减半。</li>
	<li>执行另外5次，每次12分钟&#160;在37℃下用3 ml EB2进行消化循环 &#176;C；每次收集含心肌细胞的缓冲液至15 ml锥形管中，并加入12 ml KB溶液稀释。将6个含细胞的试管于室温下静置30分钟。</li>
</ol>
4. 细胞重悬与 Ca2+ 重新适应
<ol>
	<li>加入 1 mg/ml&#160;牛血清白蛋白（BSA）至20 ml Ca2+无钙台氏液（TB）。过滤该溶液。</li>
	<li>将含有心肌细胞的六个锥形管在100 × g条件下离心5分钟，使心肌细胞沉淀。弃去上清液，于室温下用不同体积（1–3 ml，根据细胞得率确定）含牛血清白蛋白（BSA）的TB缓冲液重悬各管中的细胞。</li>
	<li>逐步增加 Ca2+ 通过添加少量 100 mmol/L 的溶液，调节细胞所含缓冲液中的浓度&#160;CaCl2 溶液。在第一和第二步中，Ca2+ 浓度升高至50 &#956;mol/L 和 100 &#956;mol/L，分别。随后的 Ca2+ 每5分钟执行一次附加步骤&#160;且浓度增加100 &#956;mol/L 逐步稀释至终浓度为 0.9 mmol/L。</li>
	<li>评估分离过程的得率。取0.5 ml含心肌细胞的溶液转移至显微镜的玻璃底培养皿中。在10倍物镜放大下观察15个显微镜视野，计算健康心肌细胞所占百分比（例如 具有清晰横纹且无明显包涵物的杆状细胞 图&#160;2预期得率约为 20%。</li>
</ol>
5. 分离心肌细胞的功能评估。
以下方案是人类心肌细胞功能评估的一个示例，包括动作电位和细胞内Ca2+流的同步记录。
<ol>
	<li>为穿孔膜片钳配置的膜片钳实验配制电极内液（PS）。该溶液可在 -20 °C 下保存长达 3 个月。</li>
	<li>向无 Ca2+ 的 Tyrode 缓冲液（TB）中加入 1.8 mmol/L CaCl2。在膜片钳/荧光实验期间，用此溶液灌流心肌细胞。</li>
	<li>将 1 ml&#160;细胞悬液转移至 1.5 ml 离心管中，加入 10 μmol/L Fluoforte 和 10 μl Powerload Concentrate。室温孵育 30 分钟。随后将离心管垂直放置，静置 5 分钟使细胞沉降；再用含 Ca2+&#160; 的 TB 重悬细胞。</li>
	<li>将 0.25 ml 细胞悬液转移至小型（0.5 ml）温度可控的显微镜载物台记录浴槽中，通过重力驱动的加热微灌流系统以 0.3 ml/min 的流速进行灌流（温度：37 ± 0.5 °C）。</li>
	<li>使用微电极拉制仪制备膜片钳电极，使其尖端直径为 3 至 5 μm，充满 PS 后电阻为 3 至 4.5 MΩ。</li>
	<li>将两性霉素 B 加入一批 PS 中（终浓度 250 μg/ml），并用此溶液填充电极。&#160;</li>
	<li>选择杆状、横纹清晰且无颗粒物的细胞，形成吉欧封接（giga seal），等待 5 至 10 分钟，直至接入电阻降至 20 MΩ 以下。</li>
	<li>在电流钳模式下，使用短脉冲（&lt; 3 msec）以不同刺激频率（0.2 Hz、0.5 Hz 和 1 Hz，每种频率持续 1 min&#160;）诱发动作电位。记录过程中，开启波长为 492 ± 3 nm 的明场照明，并在 505–520 nm 范围内检测 Fluoforte 荧光信号。使用 Digidata 1440A 和 pClamp 10.0 软件采集荧光和膜电位信号。可根据需要重复记录序列；但每个细胞的总记录时间应控制在 15 min&#160;以内。</li>
</ol>

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<li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization%3A+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li>
<li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们描述并验证了一种从人类心室心肌手术样本中分离出有活力心肌细胞的方法。该技术在先前已成功用于从心房手术样本中分离细胞的方案基础上发展而来，并针对从病变心室心肌中分离单个有活力心肌细胞进行了优化和精细调整。早期研究表明，通过从心房和心室组织块中分离单个心肌细胞的方法会特异性损害复极化钾电流，导致电生理特性及对生理刺激的反应发生改变8,24，而通过冠状动脉灌注输送含酶缓冲液则不会损害分离细胞中的延迟整流钾电流25。然而，由于手术标本中冠状动脉分支的完整性已丧失，与移植心脏不同，无法通过冠状动脉灌注法从心室心肌手术标本中分离人类心室心肌细胞。采用本方法分离的心肌细胞在起搏频率变化或β-肾上腺素能刺激下，动作电位时程表现出明显的适应性调节。此类反应的发生依赖于延迟整流钾通道的完整性26-28，提示本分离方法未对这些通道的整体功能造成损害。此外，采用本方法分离的细胞不仅表现出正常的电生理反应（图3和&#160;4），还呈现出形态和持续时间符合预期的钙瞬变（图3和5...

自单个心肌细胞分离技术发展以来，对心肌电生理特性的研究取得了显著进展。近年来，由于能够分离出保持完整组织全部生理特性的活性单个心肌细胞，人们对心脏兴奋-收缩耦联（EC-Coupling）的理解也得以深化。膜片钳技术被常规用于研究心肌细胞肌膜离子电流的功能及其药物调控作用。利用对Ca2+敏感的荧光染料记录细胞内钙动态变化，也常在多种健康与疾病模型的单个心肌细胞上进行，为兴奋-收缩耦联的生理机制以及导致机械功能障碍和心脏疾病中致心律失常风险增加的细胞内Ca2+稳态异常提供了关键数据。这些研究获得的信息对于理解药物在临床环境中的电生理和机械效应至关重要。然而，不同物种之间在跨膜电流和兴奋-收缩耦联蛋白方面存在特异性差异，这些差异决定了心脏动作电位和心脏力学特性的种属特征。因此，尽管对非人类哺乳动物来源的心肌细胞的研究阐明了特定跨膜离子通道和兴奋-收缩耦联蛋白的生物物理特性及其生理功能，但它们未必能准确反映人类心肌细胞的真实情况。因此，从人类心肌组织中分离出活性心肌细胞，对于全面理解心脏疾病的病理生理机制以及验证新的治疗策略至关重要。
在手术过程中，心耳组织通常会被丢弃，因此人类心房组织易于获取。早期对成人人类心脏动作电位和离子电流的定量研究采用了酶解法分离的心房细胞1-4。随后也有报道对分离的成人人类心室细胞进行动作电位或电流记录3,5-10。这些研究大多使用来自移植心脏的细胞，通过胶原酶灌注冠状动脉节段，或将相对大量的切除组织暴露于胶原酶中以获得分离细胞。这些研究实现了对健康心脏以及终末期心力衰竭患者心室心肌细胞跨膜离子电流的详细表征。已有研究报道了L型Ca2+电流（ICa-L）5-7、瞬时外向钾电流（Ito）8、内向整流钾电流（Iκ1）8，以及延迟整流钾电流（Iκ）的不同组分9。随着细胞分离方法的改进与优化10，已能明确表征终末期心力衰竭中致心律失常电位增加的离子基础，包括动作电位延长11、延迟后除极12以及“funny电流”增强13，从而导致舒张期除极和早搏的发生。
通常通过逆行灌流整个心脏并使用多种酶混合物的方法从小型动物中分离成年心肌细胞，该技术可获得大量耐受 Ca2+ 的细胞14。相比之下，从组织碎片中分离心肌细胞的成功率天然较低，这可能是由于酶对单个心肌细胞的接触受限，无法达到冠状动脉灌流时的效果。由于未使用供体心脏的资源极为有限，常规获取正常人左心室细胞的唯一可行方法是对择期手术中切除的、通常非常小的组织碎片进行酶消化。目前在细胞水平上研究最充分的人类疾病模型是终末期心力衰竭，原因在于可供移植的心脏相对容易获得。然而，仅少数患者会发展为终末期心力衰竭，且该阶段常表现为心肌细胞严重重塑的共同通路，与原发病因相对无关15。能够在疾病早期、尚未出现心功能失代偿阶段的患者中评估单个心肌细胞功能，对于理解不同遗传性或获得性疾病的特异性病理生理机制至关重要。肥厚型心肌病（HCM）即为一个典型例子。HCM 是一种常见（每 500 人中约有 1 例）的可遗传性心脏病，其特征为心脏肥厚、心律失常风险增加以及由于流出道梗阻和舒张功能障碍导致的收缩功能异常16。HCM 心脏的心肌细胞经历复杂的重塑过程，涉及细胞结构（肥大、肌原纤维排列紊乱）和兴奋-收缩耦联（EC-Coupling）的改变17。然而，目前关于 HCM 心肌细胞功能障碍的大多数信息均来自转基因动物模型。由于仅有少数 HCM 患者会进展至终末期心力衰竭并需要心脏移植，因此使用标准方法可获得的 HCM 心脏极为罕见。然而，至少 30% 的 HCM 患者会因室间隔显著肥厚导致收缩期流出道血流受阻而出现梗阻症状（HCM）18。目前缓解 HCM 梗阻最有效的治疗选择是外科室间隔切除术：在此手术过程中，通过经主动脉途径切除大小不一的上段室间隔组织。因此，这部分肥厚的室间隔组织可用于新鲜组织的心肌细胞分离。
既往已建立并发表了一种从单个小型经静脉心内膜活检标本中分离人类心室肌细胞的方法19。我们采用了一种从接受心脏手术患者的心室心肌样本中分离单个室间隔心肌细胞的方法，包括接受室间隔切除术的肥厚型心肌病（HCM）患者以及接受瓣膜置换术的患者。本文除详细描述细胞分离方案外，还展示了典型的电生理学和Ca2+荧光测量结果，以证明所分离的人类心室肌细胞具有活性，并且适用于膜片钳和细胞内Ca2+研究。

<table><tbody><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;P9791 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;M1880 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;H3375 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;A9251 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;G8270 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;M4125 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;S7653&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp;&region=IT&quot;&gt;P9333 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;人类表型本体&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;S7907 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;S6297 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾（KHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;237205&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;P2256 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;B0753 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;S8045 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸单钾盐一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;49601&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;107360&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>3-羟基丁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;166898&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5&amp;prime;三磷酸二钾盐二水合物（K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;A8937&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;C0780 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;S3674 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;E0396 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;A0281&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;M8266 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>梭菌胶原酶 V 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;C9263 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶，细菌型，XXIV型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙溶液，约 1 M in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;21115&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 氯化钙溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;53704&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>甲基磺酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;83000&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>FluoForte 试剂</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>Powerload 浓缩液，100X</td><td>Life Technologies</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>灌流快速步骤系统</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶解液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp;amp;region=IT&quot;&gt;A9528 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消化装置</td><td>定制</td><td>定制</td><td>该设备由本实验室使用塑料管、浇铸的Sylgard和电机定制而成；其详细描述见图1C-1D和图7。如有需要，可提供进一步细节。</td></tr><tr><td>用于消化装置刷子的硅橡胶弹性体</td><td>道康宁</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>用于消化装置的变速旋转电机</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>刷子浇铸模具</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>模具由标准的聚四氟乙烯（PTFE）2.5 cm直径圆棒定制加工而成。</td></tr></tbody></table>

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

病变心脏的心肌细胞会经历复杂的重构过程，涉及细胞结构、兴奋-收缩耦联以及膜离子电流的变化。这些变化很可能&#160;是导致心脏疾病患者心律失常风险增加以及收缩功能改变进而引起收缩期和舒张期功能障碍的原因。然而，目前关于心脏疾病中心肌细胞功能改变的大多数信息均来自动物模型。
本文描述并验证了一种从接受心脏手术的患者心室心肌小块外科样本中分离出有活性心肌细胞的方案。该方案进行了详细阐述。通过电生理学和细胞内钙离子浓度测定，证明了利用该方法获得的人心室心肌细胞进行多种单细胞检测的可行性。
本研究报道的方案可用于未来探讨不同心脏疾病存在时人类心脏功能改变的细胞和分子基础。此外，该方法可用于在细胞水平上识别新的治疗靶点，并测试新化合物对人心肌细胞的有效性，具有直接的转化价值。

采用上述方法对接受肌切除术的肥厚型心肌病（HCM）患者室间隔分离的心肌细胞功能异常进行表征，并与非心力衰竭、非肥厚性外科手术患者进行比较21。本节所包含的结果来源于该研究21，并作为示例展示该技术如何用于表征心脏疾病状态下心肌细胞功能的改变。
一名肥厚型心肌病（HCM）患者的代表性手术样本如图2A所示。手术样本在心内膜纤维条索的大小和厚度方面表现出极大的变异性。每次从HCM样本中分离细胞所用的心肌组织量约为1 g。而对照样本所用组织量较小（100–500 mg），原因是组织来源有限。处理对照样本时的细胞产量显著高于HCM样本，这可能是因为HCM心肌组织中存活心肌细胞的相对比例减少，且心内膜心肌纤维化程度增加22。基于这些观察结果，我们得出结论：获取可存活心肌细胞所需的组织量可能因心肌疾病的存在与否而有所不同。
将样品切割成小块，如图2B所示。随后，将这些组织块转移至消化装置的腔室中（<stron...

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。

病变心脏的心肌细胞会经历复杂的重构过程，涉及细胞结构、兴奋-收缩耦联以及膜离子电流的改变。这些变化很可能导致心脏疾病患者的心律失常风险增加，以及收缩和舒张功能障碍。然而，目前关于心肌细胞功能改变的大多数信息均来自动物模型。本文描述并验证了一种从接受心脏手术患者的小块心室心肌手术样本中分离出有活性心肌细胞的实验方案。该方案进行了详细阐述，并报告了电生理学和细胞内钙离子测量结果，以证明利用该方法获得的人心室心肌细胞可用于多种单细胞水平的检测。本文所述方法可为未来研究不同心脏疾病状态下人类心脏功能改变的细胞与分子机制提供帮助。此外，该方法还可用于在细胞水平识别新的治疗靶点，并评估新化合物在人心肌细胞中的有效性，具有直接的转化应用价值。

本实验的总体目标是从疾病状态的人类心室样本中分离出具有活性的心肌细胞，并表征其功能改变。首先，将新鲜的心室样本在冰冻的停搏液中快速收集并剪碎，以避免组织过度降解和细胞损伤，从而实现这一目标。第二步是使用定制的消化装置和酶溶液对心肌组织块进行逐步消化。经过六个循环后，每个循环中含缓冲液的细胞被收集到离心管中，并用细胞保存液进行稀释。最后一步是将六个离心管中的细胞重悬于体积更小、钙离子浓度正常的生理溶液中，以进行功能表征。最终，通过膜片钳记录动作电位，同时利用荧光染料评估细胞内钙离子变化，从而显示肥厚型心肌病患者心肌细胞的动作电位时程及细胞内钙循环的改变。DYS独特方法相较于16法（如标准块状去排斥法）的主要优势在于，在酶解液联合使用的情况下，我们采用了一种定制的消化装置，该装置凭借其硅质刮片，可实现可变细胞的同步解离。该方法有助于回答心脏病学领域中的关键问题，例如，已知与心脏疾病相关的分子和结构重塑如何反映为单个心肌细胞的改变，而这些改变可通过我们的方法进行分析，并被特定药物靶向干预。因此，该技术的应用前景可拓展至肥厚型心肌病等遗传性心脏疾病的治疗领域。事实上，该方法可用于测试针对因肥厚性或缺血性心脏病而接受心脏手术的患者所获取的心室心肌细胞的新型神经病理学干预手段。我们最初是在比较人类动脉标本与心脏手术期间获取的心室活检组织的相似性时，提出了该方法的想法。开始操作时，将40毫升停搏液倒入50毫升离心管中，并置于冰上，以便将标本从手术室快速转运至细胞分离实验室；标本应迅速转移至实验区域，并在切除后10分钟内开始标本处理。从手术室获取切除后的集体心室心肌标本，立即用冰冻的CP溶液冲洗，并将标本置于冰冻CP缓冲液中保存于试管内。随后用精细剪刀小心去除心内膜纤维化层。将心肌组织切成2至3毫米长的小块，每次分离所用的心室心肌总量介于100毫克至1克之间。将组织块转移至消化装置的刮取室后，用冰冷的无钙解离缓冲液替换腔室中的CP缓冲液。然后将消化装置置于恒温水浴中。将水浴温度设置为37.5摄氏度并开启。接着开启消化装置的电机，将转速设为每秒一转。用DB进行三次洗涤循环，每八分钟更换一次腔室中的溶液，换为37摄氏度、经氧气饱和的洁净DB。随后，通过在 DB 溶液中加入 250 单位/毫升的 V 型胶原酶和 4 单位/毫升的 24 型蛋白酶，制备酶缓冲液一。然后通过在 DB 溶液中加入 250 单位/毫升的胶原酶，制备酶缓冲液二。向DB溶液中加入5毫升全氧合EB1，升温至37摄氏度。然后在旋转消化装置中，用3毫升100%氧合EB1在37摄氏度下进行两次消化，每次12分钟。每次消化后用移液器吸除溶液并弃去。接下来，准备六支15毫升离心管用于细胞收集，并准备80毫升4摄氏度的经脱氧缓冲液EB2，将其预热至37摄氏度。随后，在37摄氏度条件下，使用3毫升100%氧合的EB2缓冲液进行第一次15分钟的消化。消化结束后，收集含有首次解离的心肌细胞的溶液至15毫升离心管中，并用12毫升冷KB溶液稀释细胞悬液。将离心管平放在室温下，用3毫升EB2溶液在37摄氏度下进行另外五次12分钟的消化循环，并在每次循环中将含有心肌细胞的缓冲液收集到15毫升的锥形管中。每次循环中，记得将收集的3毫升缓冲液用12毫升KB溶液稀释。最后，将六个含有细胞的离心管在室温下保存。在此步骤中，将牛血清白蛋白以每毫升1毫克的浓度加入20毫升无钙Tyro缓冲液中。然后过滤该溶液，接着将含有六种心肌细胞的锥形管在100 ×g 条件下离心5分钟。为促使心肌细胞沉淀，弃去上清液，并在室温下用含牛血清白蛋白的TB缓冲液以可变体积重新悬浮每管中的细胞。通过在第一步和第二步中逐次加入少量 100 毫摩尔/升氯化钙溶液，逐步提高含有缓冲液的细胞中的钙离子浓度。钙离子浓度分别升至 50 微摩尔/升和 100 微摩尔/升。随后的钙离子添加步骤每隔五分钟进行一次，每次浓度增加 100 微摩尔/升，直至最终浓度达到 0.9 毫摩尔/升。为评估分离操作的得率，将0.5毫升含有心肌细胞的溶液转移至显微镜的玻璃底培养皿中。在10倍物镜放大倍数下观察15个显微镜视野，计算健康心肌细胞所占百分比，健康心肌细胞的特征为杆状细胞、横纹清晰且无明显包涵物。预期得率约为20%，以用于演示人心肌细胞功能评估，包括动作电位与细胞内钙离子流的同步记录。首先，配制用于穿孔膜片钳实验的移液管溶液。然后向无钙台氏液中加入1.8 mM的氯化钙。在膜片钳荧光实验期间，使用该溶液对心肌细胞进行灌流。随后，取1毫升细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，加入10 µmol/L Flu Fort 和10 µL Power Load。将离心管水平放置于室温下孵育30分钟。之后，将离心管竖直放置，静置5分钟使细胞沉降。然后用移液管吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于含钙的缓冲液中。取0.25毫升细胞悬液转移至一个小型温度可控的显微镜载物台记录室中，通过重力灌流系统以每分钟0.3毫升的流速灌注预热的微灌流系统，保持温度为37摄氏度。使用显微拉针仪制备尖端直径为3至5微米、充入PS后电阻为3至4.5兆欧的膜片钳电极。随后，将两性霉素B加入PS中，使其终浓度为250微克/毫升，并用该溶液填充电极，然后将电极安装至电极夹持器上。接下来，选择呈Ron形状、横纹清晰且无包涵体的细胞。形成吉格封接，并等待5到10分钟，直至接入电阻降至20欧姆以下。随后，在电流钳模式下使用不同频率的短脉冲刺激诱发动作电位。在记录阶段，开启492纳米的明场照明，并在505至520纳米范围内检测Fluor fort荧光。然后采集荧光和膜电位信号。该图显示了肥厚型心肌病（HCM）样本中心室心肌细胞动作电位的变化。以下是来自对照心肌细胞和 HCM 心肌细胞在 0.2 赫兹、0.5 赫兹和 1 赫兹刺激下诱发的典型叠加动作电位。来自对照组心肌细胞在0.5赫兹下的叠加动作电位。图中显示了在无和含有10⁻⁷摩尔异丙肾上腺素条件下的情况，此处还展示了一条来自肥厚型心肌病（HCM）患者心肌细胞的代表性膜电位轨迹，该轨迹表现出多次自发性去极化，即早后除极。该图显示了来自HCM样本的心室心肌细胞中钙瞬变的改变。以下是通过膜片钳电极以 0.2 赫兹频率刺激时，对照心肌细胞和肥厚型心肌病（HCM）细胞中记录到的代表性重叠钙瞬变曲线。图中展示了 HCM 和对照心肌细胞在不同时间点的钙瞬变动力学特征，此外还提供了代表性长时程记录，显示在三种不同刺激频率下细胞内钙的变化情况，突出了在较高起搏频率下 HCM 心肌细胞舒张期钙水平升高。该图展示了利用人室性心肌细胞进行的其他实验应用。左侧显示的是在不同膜电压下记录的L型钙电流的代表性叠加曲线，右侧显示的是来自18个分离自心肌病（HCM）样本细胞的平均L型钙电流峰值密度；此处还展示了在1赫兹电场刺激期间从心室肌细胞记录到的胞内钙瞬变轨迹。在进行该操作时，必须注意在从手术室获取标本后尽快开始实验操作，以确保细胞活性。遵循此程序可成功分离人心室肌细胞。还可进一步开展其他方法，如活细胞共聚焦显微镜观察或免疫化学染色，这对于回答一些基础科学问题至关重要，例如，心脏疾病中膜结构及钙释放单位的亚细胞定位如何发生改变。该技术为细胞心脏病学研究心室心肌细胞的功能异常以及检验新型治疗方案的潜在应用价值奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何从人体样本中分离出具有活性的单个心肌细胞，以及如何在不同条件下表征细胞功能。

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隔离与人类心室肌细胞的功能研究从新鲜手术样品

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人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

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分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

学习从新鲜手术样品中分离人源心室肌细胞并进行功能研究的方法。该技术采用定制消化装置和酶解方案，可获取具有活性的心肌细胞，用于电生理记录和药物测试，为研究肥厚型心肌病等心脏疾病提供重要工具。

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

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