从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

本实验的总体目标是从疾病状态的人类心室样本中分离出具有活性的心肌细胞，并表征其功能改变。首先，将新鲜的心室样本在冰冻的停搏液中快速收集并剪碎，以避免组织过度降解和细胞损伤，从而实现这一目标。第二步是使用定制的消化装置和酶溶液对心肌组织块进行逐步消化。

经过六个循环后，每个循环中含缓冲液的细胞被收集到离心管中，并用细胞保存液进行稀释。最后一步是将六个离心管中的细胞重悬于体积更小、钙离子浓度正常的生理溶液中，以进行功能表征。最终，通过膜片钳记录动作电位，同时利用荧光染料评估细胞内钙离子变化，从而显示肥厚型心肌病患者心肌细胞的动作电位时程及细胞内钙循环的改变。

DYS独特方法相较于16法（如标准块状去排斥法）的主要优势在于，在酶解液联合使用的情况下，我们采用了一种定制的消化装置，该装置凭借其硅质刮片，可实现可变细胞的同步解离。该方法有助于回答心脏病学领域中的关键问题，例如，已知与心脏疾病相关的分子和结构重塑如何反映为单个心肌细胞的改变，而这些改变可通过我们的方法进行分析，并被特定药物靶向干预。因此，该技术的应用前景可拓展至肥厚型心肌病等遗传性心脏疾病的治疗领域。

事实上，该方法可用于测试针对因肥厚性或缺血性心脏病而接受心脏手术的患者所获取的心室心肌细胞的新型神经病理学干预手段。我们最初是在比较人类动脉标本与心脏手术期间获取的心室活检组织的相似性时，提出了该方法的想法。开始操作时，将40毫升停搏液倒入50毫升离心管中，并置于冰上，以便将标本从手术室快速转运至细胞分离实验室；标本应迅速转移至实验区域，并在切除后10分钟内开始标本处理。

从手术室获取切除后的集体心室心肌标本，立即用冰冻的CP溶液冲洗，并将标本置于冰冻CP缓冲液中保存于试管内。随后用精细剪刀小心去除心内膜纤维化层。

将心肌组织切成2至3毫米长的小块，每次分离所用的心室心肌总量介于100毫克至1克之间。将组织块转移至消化装置的刮取室后，用冰冷的无钙解离缓冲液替换腔室中的CP缓冲液。然后将消化装置置于恒温水浴中。

将水浴温度设置为37.5摄氏度并开启。接着开启消化装置的电机，将转速设为每秒一转。用DB进行三次洗涤循环，每八分钟更换一次腔室中的溶液，换为37摄氏度、经氧气饱和的洁净DB。

随后，通过在 DB 溶液中加入 250 单位/毫升的 V 型胶原酶和 4 单位/毫升的 24 型蛋白酶，制备酶缓冲液一。然后通过在 DB 溶液中加入 250 单位/毫升的胶原酶，制备酶缓冲液二。

向DB溶液中加入5毫升全氧合EB1，升温至37摄氏度。然后在旋转消化装置中，用3毫升100%氧合EB1在37摄氏度下进行两次消化，每次12分钟。每次消化后用移液器吸除溶液并弃去。

接下来，准备六支15毫升离心管用于细胞收集，并准备80毫升4摄氏度的经脱氧缓冲液EB2，将其预热至37摄氏度。随后，在37摄氏度条件下，使用3毫升100%氧合的EB2缓冲液进行第一次15分钟的消化。消化结束后，收集含有首次解离的心肌细胞的溶液至15毫升离心管中，并用12毫升冷KB溶液稀释细胞悬液。

将离心管平放在室温下，用3毫升EB2溶液在37摄氏度下进行另外五次12分钟的消化循环，并在每次循环中将含有心肌细胞的缓冲液收集到15毫升的锥形管中。每次循环中，记得将收集的3毫升缓冲液用12毫升KB溶液稀释。最后，将六个含有细胞的离心管在室温下保存。

在此步骤中，将牛血清白蛋白以每毫升1毫克的浓度加入20毫升无钙Tyro缓冲液中。然后过滤该溶液，接着将含有六种心肌细胞的锥形管在100 ×g 条件下离心5分钟。为促使心肌细胞沉淀，弃去上清液，并在室温下用含牛血清白蛋白的TB缓冲液以可变体积重新悬浮每管中的细胞。

通过在第一步和第二步中逐次加入少量 100 毫摩尔/升氯化钙溶液，逐步提高含有缓冲液的细胞中的钙离子浓度。钙离子浓度分别升至 50 微摩尔/升和 100 微摩尔/升。随后的钙离子添加步骤每隔五分钟进行一次，每次浓度增加 100 微摩尔/升，直至最终浓度达到 0.9 毫摩尔/升。

为评估分离操作的得率，将0.5毫升含有心肌细胞的溶液转移至显微镜的玻璃底培养皿中。在10倍物镜放大倍数下观察15个显微镜视野，计算健康心肌细胞所占百分比，健康心肌细胞的特征为杆状细胞、横纹清晰且无明显包涵物。预期得率约为20%，以用于演示人心肌细胞功能评估，包括动作电位与细胞内钙离子流的同步记录。

首先，配制用于穿孔膜片钳实验的移液管溶液。然后向无钙台氏液中加入1.8 mM的氯化钙。在膜片钳荧光实验期间，使用该溶液对心肌细胞进行灌流。

随后，取1毫升细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，加入10 µmol/L Flu Fort 和10 µL Power Load。将离心管水平放置于室温下孵育30分钟。之后，将离心管竖直放置，静置5分钟使细胞沉降。

然后用移液管吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于含钙的缓冲液中。取0.25毫升细胞悬液转移至一个小型温度可控的显微镜载物台记录室中，通过重力灌流系统以每分钟0.3毫升的流速灌注预热的微灌流系统，保持温度为37摄氏度。

使用显微拉针仪制备尖端直径为3至5微米、充入PS后电阻为3至4.5兆欧的膜片钳电极。随后，将两性霉素B加入PS中，使其终浓度为250微克/毫升，并用该溶液填充电极，然后将电极安装至电极夹持器上。接下来，选择呈Ron形状、横纹清晰且无包涵体的细胞。

形成吉格封接，并等待5到10分钟，直至接入电阻降至20欧姆以下。随后，在电流钳模式下使用不同频率的短脉冲刺激诱发动作电位。在记录阶段，开启492纳米的明场照明，并在505至520纳米范围内检测Fluor fort荧光。

然后采集荧光和膜电位信号。该图显示了肥厚型心肌病（HCM）样本中心室心肌细胞动作电位的变化。以下是来自对照心肌细胞和 HCM 心肌细胞在 0.2 赫兹、0.5 赫兹和 1 赫兹刺激下诱发的典型叠加动作电位。

来自对照组心肌细胞在0.5赫兹下的叠加动作电位。图中显示了在无和含有10⁻⁷摩尔异丙肾上腺素条件下的情况，此处还展示了一条来自肥厚型心肌病（HCM）患者心肌细胞的代表性膜电位轨迹，该轨迹表现出多次自发性去极化，即早后除极。该图显示了来自HCM样本的心室心肌细胞中钙瞬变的改变。

以下是通过膜片钳电极以 0.2 赫兹频率刺激时，对照心肌细胞和肥厚型心肌病（HCM）细胞中记录到的代表性重叠钙瞬变曲线。图中展示了 HCM 和对照心肌细胞在不同时间点的钙瞬变动力学特征，此外还提供了代表性长时程记录，显示在三种不同刺激频率下细胞内钙的变化情况，突出了在较高起搏频率下 HCM 心肌细胞舒张期钙水平升高。该图展示了利用人室性心肌细胞进行的其他实验应用。

左侧显示的是在不同膜电压下记录的L型钙电流的代表性叠加曲线，右侧显示的是来自18个分离自心肌病（HCM）样本细胞的平均L型钙电流峰值密度；此处还展示了在1赫兹电场刺激期间从心室肌细胞记录到的胞内钙瞬变轨迹。在进行该操作时，必须注意在从手术室获取标本后尽快开始实验操作，以确保细胞活性。遵循此程序可成功分离人心室肌细胞。还可进一步开展其他方法，如活细胞共聚焦显微镜观察或免疫化学染色，这对于回答一些基础科学问题至关重要，例如，心脏疾病中膜结构及钙释放单位的亚细胞定位如何发生改变。

该技术为细胞心脏病学研究心室心肌细胞的功能异常以及检验新型治疗方案的潜在应用价值奠定了基础。观看本视频后，您应能充分掌握如何从人体样本中分离出具有活性的单个心肌细胞，以及如何在不同条件下表征细胞功能。