隔离与人类心室肌细胞的功能研究从新鲜手术样品

该程序的总体目标是从疾病人类心室标本中分离活的心肌细胞并表征它们的功能改变。这是通过首先在冰冷的心脏停搏溶液中快速收集和切碎新鲜心室样本来实现的，以避免过度的组织降解和细胞损伤。第二步是使用定制的消化装置和酶溶液对心肌块进行逐步消化。

在六个循环中，在每个循环中将含有缓冲液的细胞收集在试管中，并用细胞保存溶液稀释。最后一步是将 6 个试管中包含的细胞重悬于具有正常钙浓度的较低体积的标准生理溶液中，以便进行功能表征。最终，使用荧光染料对动作电位的膜片钳记录和细胞间钙的同步评估来显示肥厚型心肌病患者心肌细胞中作用、电位持续时间和细胞内钙循环的改变。

与标准的块状消解方法一样，DYS Unique 的主要优点是，在与酶溶液结合时，我们使用定制的消化装置，由于其硅刮擦，它允许可变细胞的联合解合。这种方法可以帮助回答心脏病学领域的关键问题，例如与心脏病相关的众所周知的分子和结构重塑如何反映到单个心肌细胞的改变中，这些改变可以通过我们的方法进行分析并由特定药物靶向。因此，这项技术的影响延伸到遗传性心脏病的治疗，例如肥厚型心肌病。

事实上，这种方法可用于在接受心脏手术的肥厚或缺血性心脏病患者的心室心肌细胞上测试新的神经性方法。在比较心脏手术期间获得的人体动脉标本和心室活检之间的类比时，我们首先想到了这种方法。首先将 40 毫升心脏停搏溶液倒入 50 毫升试管中，并将其储存在冰中，以便将标本从手术室运送到细胞分离实验室，将标本快速转移到实验室区域，并在标本切除后 10 分钟内开始标本处理。

切除后立即从手术室采集下一个集体心室心肌标本。用冰冷的 CP 溶液清洗并将其储存在试管中，同时将样品保存在冰冷的 CP 缓冲液中。之后用细剪刀小心地去除心内膜纤维化层。

将心肌组织切成 2 到 3 毫米长的小块，每次分离的心室心肌总量在 100 毫克到 1 克之间。将块转移到消化装置的刮擦室后，用冷的无钙解离缓冲液更换室中的 CP 缓冲液。然后将消化装置放入恒温浴中。

将浴槽设置为 37.5 摄氏度并打开它。接下来打开消解装置的电机，将转速设置为每秒 1 转。使用 DB 进行 3 次洗涤循环，每 8 分钟更换一次腔室中的 37 摄氏度氧气饱和清洁 DB 溶液。

之后，通过每毫升添加 250 单位的 5 型胶原酶和每毫升蛋白酶 4 单位来制备酶缓冲液 1。键入 24 到 DB 解决方案。然后通过每毫升添加 250 单位胶原酶来制备酶缓冲液 2。

键入 5 到 DB 解决方案中，对 EB 1 充氧，并将其加热至 37 摄氏度。然后在旋转消解装置中用 3 毫升 100% 含氧 EB 进行两次 12 分钟的消解循环，其中一次在 37 摄氏度下。通过移液器吸液除去溶液，并在每个循环后丢弃。

接下来，准备 6 支 15 毫升试管用于细胞收集和 80 毫升 4 摄氏度精酿溶液，用于逃避缓冲液，对 EB 2 充氧，并将其加热至 37 摄氏度。随后，在 37 摄氏度下用 3 毫升 100% 含氧 EB 2 进行第一个 15 分钟的消化循环。消化循环后，将含有第一批相关肌细胞的溶液收集在 15 毫升试管中，并用 12 毫升冷 KB 溶液稀释细胞悬液。

将试管平放于室温下，在 37 摄氏度下用 3 毫升 EB 2 进行另外 5 次 12 分钟的消化循环，并在每个循环中收集含有肌细胞的缓冲液在 15 毫升锥形管中。请记住，在每个循环中还要用 12 mL的 KB 溶液稀释 3 mL收集的缓冲液。最后，将含有六个细胞的试管储存在室温下。

在此步骤中，将 1 毫克/毫升牛血清白蛋白添加到 20 毫升不含钙的泰罗缓冲液中。然后过滤溶液，接下来将 6 个含有肌细胞的锥形管以 100 个奶酪离心 5 分钟。为了迫使肌细胞沉降，去除上清液并在室温下用可变量的含有 TB 的 BSA 重悬每个试管中的细胞。

在第一步和第二步中，通过添加每升 100 毫摩尔/升氯化钙溶液的小 OTT，逐渐增加含有缓冲液的细胞中的钙浓度。钙浓度分别提高到 50 微摩尔/升和 100 微摩尔/升。以下钙添加步骤每 5 分钟进行一次，每步将浓度提高 100 微摩尔/升，最终浓度为 0.9 毫摩尔/升。

为了评估分离程序的产量，将 0.5 毫升含心肌细胞的溶液转移到显微镜的玻璃底室中。以 10 倍客观放大倍率评估 15 个显微镜视野，并计算健康肌细胞的百分比，例如具有清晰条纹且无明显内含物的杆状细胞。预期产量应约为 20% 以证明人心肌细胞功能评估，包括动作电位和细胞内钙通量的同时记录。

首先，在穿孔贴片配置中制备用于膜片钳实验的移液器溶液。然后将 1.8 毫摩尔的氯化钙添加到游离钙结核病中。在膜片钳荧光实验期间，使用该溶液对心肌细胞进行超输。

接下来，将 1 毫升细胞悬液转移到 1.5 毫升试管中，并添加每升 10 微摩尔的流感疫苗和 10 微升的电力负载。浓缩液在室温下水平孵育 30 分钟。然后，将试管置于垂直位置，让细胞静置 5 分钟。

然后吸出上清液，将细胞沉淀重悬于含 TB 的钙中。将 25 毫升细胞悬液转移到安装在小型温控显微镜上的记录室中。在 37 摄氏度下，通过重力与加热的微型 fuer 系统以每分钟 0.3 毫升的流速进行超级熔合。

使用微量移液器拉拔器，准备膜片钳移液器，其尖端直径为 3 至 5 微米，充满 ps 时电阻为 3 至 4.5 兆欧姆。之后，以 250 μg/mL 的浓度将两性霉素 B 添加到 PS 中，并使用它来填充电极，然后将电极安装在移液器支架上。接下来，选择具有清晰条纹且无内含物的 Ron 形细胞。

形成千兆密封并等待 5 到 10 分钟，直到访问电阻降至 20 欧姆以下。随后在电流钳模式下使用不同刺激频率的短脉冲引发动作电位。在记录阶段，打开 492 纳米的明场照明，并检测 505 至 520 纳米的 Fluor fort 荧光。

然后获取荧光和膜电位信号。该图显示了 HCM 样本中心室心肌细胞动作电位的改变。以下是从对照肌细胞和 HCM 肌细胞在 0.2 赫兹、0.5 赫兹和 1 赫兹处引发的代表性叠加动作电位。

来自对照肌细胞的 0.5 赫兹的叠加动作电位。在不存在和存在 10 到 7 摩尔异丙肾上腺素的情况下，这是 HCM 患者心肌细胞膜电位的代表性痕迹，它在去极化后早期表现出几次自发性去极化。该图显示了 HCM 样本中心室心肌细胞中钙瞬变的改变。

以下是在对照肌细胞和 HCM 细胞中通过贴片移液管以 0.2 赫兹刺激过程中引发的代表性叠加钙瞬变。显示了 HCM 和对照心肌细胞在不同时间钙瞬变的动力学，以下是代表性的长轨迹，显示了在以三种不同频率刺激期间细胞内钙，这突出了 HCM 心肌细胞中高起搏率下舒张期钙的增加。该图显示了使用人心室肌细胞的其他实验应用。

左图显示了在不同膜电压下记录的 L 型钙电流的代表性叠加迹线，右图显示了在不同膜电压下从 HCM 样本中分离的 18 个细胞的平均 L 型钙电流峰值密度，此处显示的是心室肌细胞在 1 赫兹电场刺激期间记录的细胞内钙迹线。在尝试此程序时，重要的是要记住在从手术室收集标本后不久开始该程序，以确保 ses 遵循此程序分离人心室心肌细胞。可以执行其他方法，如生活方式共聚焦显微镜或免疫化学，这对于回答基本问题至关重要，例如，膜结构和钙释放单位的亚细胞定位在心脏病中发展后如何受到阻碍。

这项技术为细胞心脏病学研究心室心肌细胞的功能异常和测试新型治疗方案的潜在效用铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何从人类标本中分离活的单个心肌细胞以及如何表征不同条件下的细胞功能有很好的了解。