从心律失常性心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离与鉴定心脏间充质基质细胞

本方案的总体目标是从致心律失常性心肌病患者中分离心脏间充质基质细胞，检测其成脂分化能力，并对其表面标志物进行表型分析。该方法有助于回答致心律失常性心肌病研究领域中的关键问题，例如心脏基质细胞在脂肪替代过程中的作用及其潜在的分子机制。该技术的主要优势在于，仅需极少的简单传代步骤即可从小块心脏组织样本中分离出基质细胞。

尽管该方法可为心律失常性心肌病的研究提供见解，但也适用于其他系统，例如需要进行心内膜心肌活检的心血管疾病研究。当我们意识到可以将造口细胞分离技术进行缩小化，以应用于心脏活检及其所能提供的电生理学信息时，我们首次提出了该方法的设想。

本方案中，使用整合式电生理解剖标测与心脏荧光透视技术，从致心律失常性心肌病（ACM）患者右心室采集心内膜心肌活检样本。采集约五克组织，置于TMES培养基中并运送至实验室。在实验室中，根据需要准备生物安全柜，以进行至外胚层消化前的全部操作。

然后将活检组织转移至培养皿中，并用 PBS 洗涤两次。此时可在显微镜下对活检组织进行拍照记录。接着将活检组织转移至含有 1 毫升胶原酶溶液的 2 毫升离心管中。

将样本切成大小为0.5至1毫米宽的小片段。随后，在37摄氏度下以持续旋转振荡孵育组织90分钟。接着，离心消化液，弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升PBS中。

然后再次离心管体，弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升TMES中。将悬液接种至一个60毫米培养皿中，并用TMES补足体积至3毫升，但不可超过此量。随后根据文字方案中的步骤培养并扩增细胞。

开始前，准备好细胞解离试剂、洗涤缓冲液以及所需的抗体。当培养物的预估细胞数量达到三百万时，用10毫升无菌PBS将100毫米培养皿洗涤两次。随后向细胞中加入5毫升细胞解离试剂，在室温下孵育7至10分钟，使细胞脱落。

待细胞脱离后，向细胞中加入 15 毫升 PBS，将悬液转移至 50 毫升离心管中。随后离心细胞，并将沉淀重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。然后对细胞进行计数，并将 300 万个细胞转移至新的离心管中，最终体积为 1.5 毫升洗涤缓冲液。

接下来，将悬液分装至12个离心管中。向每根离心管中加入用于表征CMSCs的抗体，抗体浓度应按照推荐浓度添加。务必设置同型对照。

制备完成后，将各管在室温下避光孵育15分钟。随后向每管中加入1毫升洗涤缓冲液以终止反应。然后离心细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于250微升洗涤缓冲液中。

现在使用流式细胞术对细胞进行表征。在细胞成脂分化后，使用油红O染色检测脂质积累。实验开始前，务必准备好油红O工作液。

染色前，先移除培养基，并用两毫升 PBS 洗涤细胞两次。然后加入 4% 多聚甲醛覆盖细胞，在室温下固定五分钟。随后弃去多聚甲醛溶液，并用两毫升 PBS 再次洗涤细胞两次。

第二次洗涤后，加入足量的 ORO 工作液以覆盖细胞。然后在室温下孵育 1 小时。此孵育步骤必须在自动溶液系统无法运行的环境中进行，因此不建议在完全封闭的房间内操作。

孵育结束后，吸除 ORO 溶液，并用两毫升 PBS 多次洗涤细胞，直至 PBS 洗涤液中不再可见染料，且在显微镜下观察时无非特异性染色。接下来，使用倒置组织培养相差显微镜，在 20 倍放大倍数下对每个孔拍摄 20 张图像。具体细节详见文本方案。

CMSCs 从心内膜心肌活检组织中分离获得，方法如前所述。为确认其间充质细胞谱系，将细胞与相应的荧光素偶联抗体孵育，并通过流式细胞术进行分析。CMSCs 对特异性间充质表面抗原 CD29、CD44 和 CD105 呈阳性。

已知CD90阳性细胞的比例具有可变性。这些细胞不表达内皮来源、单核细胞或巨噬细胞来源、造血来源以及主要组织相容性复合体的标志物。随后，将CMSCs在T.ADIPO培养基中进行培养以诱导脂肪向分化，并用油红O（ORO）染色以检测细胞内脂滴的形成。

与健康对照者的细胞相比，来自致心律失常性心肌病患者的CMSCs在72小时和七天的分化条件下积累了更多的脂滴。该技术一旦掌握，细胞分离可在三小时内完成，染色可在两小时内完成，而图像分析可在三小时内完成。

采用此方法后，还可进行药物测试等其他实验，以回答更多问题，例如：我们能否利用同一患者的间质细胞对不同刺激作出反应。该技术建立后，为致心律失常性心肌病领域的研究人员探索人类心脏间质细胞在疾病发病机制中的作用开辟了道路。