Name: 致心律失常心肌病患者心内膜心肌活检样间质基质细胞的分离与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解从致心律失常心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离心脏间充质基质细胞的方法。该技术通过流式细胞术和油红O染色进行细胞表征与成脂分化分析，为研究心脏疾病机制提供可靠实验方案。

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本工作由意大利卫生部向 Centro Cardiologico Monzino-IRCCS 提供的常规研究经费资助。

该方法符合《赫尔辛基宣言》的要求，且右心室样本的采集已获得&#34;Centro Cardiologico Monzino IRCCS&#34;伦理委员会的批准（2012年6月7日）。
1. 溶液
<ol>
	<li>使用Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM），添加20%胎牛血清（FBS）、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10,000 U/mL青霉素、10,000 µg/mL链霉素和0.02 M L-谷氨酰胺，配制C-MSC培养用的TMES培养基。使用0.22 µm无菌滤器过滤TMES培养基，并于4 °C保存。</li>
	<li>配制胶原酶溶液时，将胶原酶NB4混合物溶于IMDM培养基中，得到终浓度为3 mg/mL的溶液。轻轻涡旋以溶解粉末，再使用0.2 µm注射器滤器过滤胶原酶溶液。将溶液以每管1 mL分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存，待用时取出。</li>
	<li>配制T. ADIPO培养基时，使用IMDM培养基并添加10% FBS、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（用二甲基亚砜（DMSO）预稀释至0.5 M浓度，-20 °C保存备用）、1 µM氢化可的松（用DMSO预稀释至100 mM，再用无菌蒸馏水进一步稀释至10 mM，-20 °C保存备用）以及0.1 mM吲哚美辛（用DMSO预稀释至0.5 M浓度，-20 °C保存备用），制成成脂诱导培养基。使用0.22 µm无菌滤器过滤T. ADIPO培养基，并于4 °C保存。</li>
	<li>配制洗涤缓冲液，成分为0.0067 M PO4磷酸盐缓冲液（PBS）、5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和5%牛血清白蛋白，于4 °C保存。</li>
	<li>通过将1%油红O（ORO）粉末溶于60%异丙醇中，混匀2小时，并使用0.22 µm滤器过滤以去除沉淀物，配制油红O工作液。工作液于室温（RT）保存。</li>
</ol>
2. 心脏间充质基质细胞的分离
<ol>
	<li>心脏活检样本的采集与处理 
	注意：开始前，请确保已准备好胶原酶溶液和TMES培养基。
	<ol>
		<li>将ACM心内膜心肌活检样本（通常约5 mg组织）放入盛有TMES的无菌管中，并运送至实验室。 
		注意：根据既往报道10，ACM活检样本在电生理手术室中采集。简言之，通过右心室内的电-解剖标测与心腔内超声心动图的整合（见视频1），指导对病变心肌边界区进行心内膜心肌活检（见视频2，X线透视成像）。健康对照（HC）样本由组织生物样本库提供，取自意外死亡的健康供体在死亡后24小时内获取的右心室游离壁组织。在运输过程中以及解剖前，将活检样本保存于4 °C的TMES中。活检采集至组织处理之间的时间应尽量缩短（最长不超过24小时）。</li>
		<li>在生物安全柜中准备好进行操作所需的全部试剂，直至完成酶消化步骤。</li>
		<li>将灭菌器置于通风橱下，使用前15分钟开启仪器，使其温度升至200–250 °C。</li>
		<li>将剪刀和镊子灭菌10秒。确保灭菌后的器械在使用前已冷却。同时准备一次性无菌手术刀片。</li>
		<li>将装有活检样本的试管放入无菌操作台内。打开试管，将活检组织转移至无菌培养皿中。</li>
		<li>用3 mL无菌PBS清洗右心室活检样本两次。如需在显微镜下拍摄活检样本图像，可在此步骤进行。</li>
		<li>使用无菌镊子将右心室活检样本转移至含有1 mL胶原酶溶液的无菌2 mL离心管中。</li>
		<li>用无菌剪刀将组织剪成0.5–1 mm3大小的碎块。</li>
		<li>在37 °C条件下持续旋转振荡孵育1.5小时。</li>
		<li>在室温下以400 × g离心10分钟，收集消化后的细胞悬液。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL无菌PBS重悬沉淀以进行洗涤。</li>
		<li>在室温下再次以400 × g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL TMES培养基中。</li>
		<li>将所得细胞悬液接种至无菌的60 mm组织培养处理培养皿中，并加入TMES培养基至终体积为3 mL。将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。 
		注意：过高的培养基体积可能影响消化后组织碎片的正常贴壁。</li>
		<li>24小时后，弃去培养基以去除未贴壁的细胞和碎片。 
		注意：单个解离的间充质细胞可贴附于塑料表面并形成克隆；此外，未完全消化的小块组织碎片也可贴壁并支持细胞出芽生长。</li>
		<li>用5 mL无菌PBS清洗培养皿两次，然后加入3 mL新鲜TMES培养基。</li>
		<li>每周更换TMES培养基三次，直至细胞融合度达到80%。 
		注意：贴壁细胞的数量取决于组织质量、组织量以及消化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞扩增
注意：开始前请确保已准备好 TMES 培养基。
<ol>
	<li>当细胞融合度达到80%时，将消化后的小型活检样本转移至新的无菌60 mm组织培养处理培养皿中，并加入3 mL新鲜TMES培养基。 
	注意：活检样本可重复用于进一步的C-MSC分离。可重复此操作，直至获得足够数量的分离细胞。</li>
	<li>用3 mL无菌PBS洗涤贴壁细胞两次。加入胰蛋白酶-EDTA溶液（60 mm培养皿加0.5 mL），于37 °C孵育3 - 5分钟，以使细胞脱落。</li>
	<li>当细胞从培养皿表面脱落时，加入0.5 mL无菌FBS以终止胰蛋白酶活性，并将细胞收集至新的50 mL无菌离心管中。</li>
	<li>用5 mL无菌PBS洗涤培养皿两次，将残留细胞一并加入同一离心管中。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL TMES培养基中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液加入细胞计数板中。 
	注意：若细胞浓度过高，可用PBS将初始悬液按1:10稀释，再取10 µL稀释后的细胞悬液加入细胞计数板中。</li>
	<li>在显微镜下计数3个大方格及其其中两条边线上的细胞数，并计算平均细胞数。 
	注意：为获得细胞数/mL，需将计数所得平均细胞数乘以104（即细胞计数板的稀释因子）。若细胞经过额外稀释，还需再乘以相应的稀释倍数。所需接种细胞数与细胞浓度（细胞数/mL）之比，即为下一步（步骤3.9）接种时所需初始悬液的体积（mL）。</li>
	<li>将重悬的细胞以5,000 - 10,000个细胞/cm2的终浓度接种于无菌100 mm组织培养处理培养皿中，并加入TMES培养基至终体积8 mL。将培养皿置于细胞培养箱中孵育。 
	注意：当细胞融合度达到70 - 80%时，重复细胞扩增操作。每次传代（P）时，建议冻存部分细胞，其余继续接种培养。将细胞扩增至P3或P4代，用于荧光激活细胞分选（FACS）分析（第4节）和成脂分化（第5节）。</li>
	<li>细胞消化脱落后如需冻存，于室温下以400 × g离心10分钟。</li>
	<li>按前述方法计数细胞（步骤3.7 - 3.8），将1 × 106个细胞重悬于900 µL无菌FBS中。转移至无菌冻存管，加入100 µL无菌DMSO并混匀。</li>
	<li>迅速将冻存管放入-80 °C冷冻容器中，至少保存2天后转移至液氮中长期保存。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术表征心脏间充质基质细胞
注意：开始之前，请确保已准备好细胞解离试剂、洗涤缓冲液以及特异性抗体。
<ol>
	<li>当细胞数量达到至少 3 x 106 时（按 3.7 - 3.8 步骤所述计数细胞），用 10 mL 无菌 PBS 将 100-mm 培养皿清洗两次。</li>
	<li>加入 5 mL 细胞解离试剂，在室温下静置 7 - 10 分钟，使细胞脱落。</li>
	<li>当细胞从培养皿表面脱落时，加入 15 mL 无菌洗涤缓冲液，并将悬液收集至一个新的 50 mL 无菌离心管中。</li>
	<li>用 10 mL 洗涤缓冲液将培养皿再清洗两次，并将残留的细胞并入同一离心管中。</li>
	<li>在室温下以 400 x g 离心 10 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。</li>
	<li>按前述方法计数细胞（步骤 3.7 - 3.8），取 3 x 106 个细胞转移至新的无菌离心管中，并加入洗涤缓冲液至终体积为 1.5 mL。 
	注意： 总细胞数和洗涤缓冲液的总体积取决于分析所用标记物的数量（每根 FACS 聚苯乙烯管中为 3 x 105 个细胞/100 µL）。</li>
	<li>将 100 µL 细胞悬液分装至 12 根不同的 FACS 聚苯乙烯管中，按产品说明书推荐浓度加入相应的特异性抗体。 
	注意： 用于 C-MSC 表征的抗体包括 CD34、CD105、CD45、CD29、CD90、CD44、CD31、CD14 和 HLA-DR（表 1）。需制备对照样本，即在 100 µL 重悬细胞中加入同型对照抗体，以检测信号的特异性。</li>
	<li>将样本在避光条件下孵育 15 分钟。</li>
	<li>每管加入 1 mL 无菌洗涤缓冲液以终止反应。</li>
	<li>在室温下以 400 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 250 µL 洗涤缓冲液中。</li>
	<li>进行流式细胞术分析以完成 C-MSC 的表征。</li>
</ol>
5. 心脏间充质基质细胞的脂肪成脂分化
注意：开始之前，请确保已准备好 T. ADIPO 培养基和 ORO 工作液。
<ol>
	<li>在 T. ADIPO 培养基中培养
	<ol>
		<li>按照第 3 节所述方法消化并计数细胞。</li>
		<li>在无菌的 6 孔组织培养板中，每孔加入 2 mL T. ADIPO 培养基，并接种 3 × 105 个细胞。</li>
		<li>让 C-MSC 在 T. ADIPO 培养基中分化 72 小时或 1 周，每 2–3 天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>油红 O 染色 
	注意：使用油红 O（ORO）染色检测 C-MSC 中的脂质积累。
	<ol>
		<li>将 6 孔组织培养板置于通风橱中。</li>
		<li>移除成脂诱导培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入足量的 4% 多聚甲醛（PFA），以完全覆盖每个孔。在室温下固定细胞 5 分钟。</li>
		<li>弃去 PFA，并用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>在室温下，用足量油红 O 工作液覆盖各孔，孵育固定后的细胞 1 小时。 
		注意：油红 O 孵育期间，不要将 6 孔组织培养板留在通风橱内，以避免油红 O 工作液蒸发。</li>
		<li>完全移除油红 O 工作液，并用 2 mL PBS 洗涤 3–5 次，直至孔板彻底清洁；弃去洗涤液。当 PBS 洗涤液变得澄清，且在显微镜下观察不到细胞外的非特异性染色时，停止洗涤。</li>
		<li>使用倒置组织培养相差显微镜，对每个孔在 20 倍放大倍数下拍摄 20 张图像。</li>
		<li>使用图像处理程序打开图片，以定量分析细胞中油红 O 的积累量。</li>
		<li>通过图像处理软件中的 &#34;拆分通道&#34;功能分离不同颜色通道，仅对 255-红色通道的亮度进行定量分析。</li>
		<li>通过计数细胞核数量来统计每张图片中的细胞数，并将油红 O 信号强度归一化至细胞数量。</li>
		<li>计算同一样本各图片所得结果的平均值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

MSC 与 C-MSC：MSC 是存在于多种成体组织基质组分中的多能细胞，例如骨髓、脂肪组织、软骨、脑、皮肤、胎儿附属结构以及心脏12。已有不同研究致力于分离和表征这些细胞，以探索其在基础研究和转化研究中的潜在应用12,13。
在健康状态下，间充质干细胞（MSC）处于静息状态，以较低速率进行自我更新14。由于它们会暴露于环境中的病理变化，因而会通过直接转分化、基质沉积或旁分泌效应来促进组织重塑，从而作出应答14。
心脏间充质干细胞（C-MSC）是心脏中数量众多的非心肌细胞群体4它们起源于心外膜，迁移至心肌层，并经历上皮-间质转化过程。15它们通过与心肌细胞的相互作用以及对细胞外基质稳态的调节，在生理和病理状态下均有助于维持心脏结构的机械完整性和电生理稳定性。7,16然而，C-MSC 的广泛功能尚未被完全理解。通过深入研究其在生理和病理条件下的作用，可促进对该细胞功能的全面认识。 体外 分离后的研究。
已从人类心脏的不同区域获得C-MSC，例如心耳2,17和右心室18。
最近，已从人右心室心内膜活检样本中成功分离出C-MSC8，表明所需组织来源可少至3-5 mg。
可能的应用： 本文所述方法允许从非常小的心脏标本中，通过少数几个简单步骤（如消化及基于贴壁性的筛选）获得细胞。
C-MSC 可被视为一种细胞模型，因为其易于扩增和维持 体外，并能分化为中胚层谱系的细胞（内皮细胞、成骨细胞和脂肪细胞）。此外，直接从患者体内获取细胞的可能性具有重要意义 体外 用于个性化/精准医学背景下机制研究的工具。事实上，这些细胞携带供体的遗传背景及可能存在的特异性突变，并受到患者特定特征的影响，如临床状况、年龄、性别、生活方式和用药情况。此外，通过不同标记物对它们进行分选的可能性，可实现对特定C-MSC亚群的研究19.
C-MSC 被认为在多种心血管疾病中发挥重要作用，这些疾病大多以心脏的不良重塑为特征。因此，C-MSC 可作为开发新型治疗策略的潜在靶点，以对抗心脏疾病8,20。
C-MSC 的干细胞样特性及其免疫原性较低的特点，提示其在心脏再生医学的细胞治疗中具有潜在应用价值。事实上，与骨髓或其他来源的 MSC 相似，C-MSC 在自体和异体应用中均可能使用，且无需供体与受体之间的配型21。
此外，C-MSC直接从心脏组织中分离获得，具有经心脏微环境和表观遗传特征预处理的优势。在心脏再生医学领域，这一特性对于获得成功的治疗效果可能尤为重要。
迄今为止，再生医学的临床前研究已发现C-MSC及其旁分泌活性具有重要的治疗潜力18,22,23。重要的是，目前已有以心脏组织为细胞来源的临床试验正在进行，所用细胞包括心脏球来源细胞或C-MSC的亚群13,24,25。然而，与骨髓来源的MSC类似，获得临床级C-MSC可能需要采用不同的制备方案26。
ACM中的C-MSC：本方案主要适用于需要进行心内膜活检的病理学研究。致心律失常性心肌病（ACM）患者会因诊断目的接受活检操作27。其心肌组织逐渐被瘢痕组织替代，这种电生理上无活性的组织由脂肪细胞和纤维化成分构成。为了引导活检取样至病变瘢痕区域（此处诊断阳性率最高），需采用心内膜心肌标测技术10,28,29。本方案所使用的样本取自病变心肌的交界区域。
Sommariva 等人最近定义了C-MSC在ACM发病机制中的关键作用8，证明C-MSC是ACM心脏脂肪生成的积极参与者，因为这些心脏中的前脂肪细胞具有间充质来源。此外，通过本方案从ACM患者活检组织中分离的C-MSC表现出比对照组更强的脂质积累和脂肪生成倾向。因此，这些细胞可用于验证ACM的一些分子机制，证明其作为机制研究细胞模型的适用性9。
局限性与关键步骤：尽管直接从患者获取C-MSC具有诸多优势（参见“&#34;可能的应用&#34;”段落），但本方案仍存在多种局限性。
首先，心脏活检是一种侵入性操作，若非绝对必要，通常会避免实施。事实上，获取心脏组织样本在伦理和技术上均存在难题。进行心脏活检的指征可能包括在心肌病的鉴别诊断中明确诊断、监测心脏移植后的状态，或确认心脏肿瘤的存在30。因此，只有符合共识声明31所建议需进行心内膜心肌活检的患者，方可纳入C-MSC相关研究。此外，心脏活检操作可能引发临床并发症，尤其在心肌病患者的心脏中风险更高。因此，电生理医师在取样时始终持谨慎态度，所得活检样本可能非常微小，从而影响细胞的分离。未来的实验可通过优化胶原酶浓度或消化时间来克服这一问题。
与其他所有原代人类细胞一样，C-MSC在不同个体间的各种表型中均表现出高度变异性。实际上，来自不同个体的细胞不仅在遗传上存在差异，还受到不同环境因素的影响。具体而言，在本实验中，细胞的分离、生长以及成脂分化均观察到较高的变异性。
必须注意本方案中的关键步骤。如果活检样本中含有毛细血管，则必须将其去除，以避免内皮细胞的平行分离，否则可能污染C-MSC培养物，并可通过FACS分析（CD31阳性）加以证实。为了实现有效的脂肪向分化，细胞必须处于活跃的生长期。细胞汇合程度也可能影响脂质的积累。
方法的意义： 与以往间充质基质细胞的分离方法相比，这是首次详细提出直接从人心室活检样本中获取C-MSC的方案。尽管该方法建议用于心肌炎患者样本的处理，但原则上可适用于所有需要进行心内膜心肌活检的患者。
本方案是对先前方法的有效改进，先前方法在获取所需细胞时需要更大的心脏样本32，而这类样本通常难以收集。
此外，样本来源本身也是一项引人注目的创新。虽然心室活检通常取自室间隔33，但本方案考虑了从右心室游离壁获取的样本。源自病变右心室区域的细胞可能更能代表涉及右心室疾病的病理状态。
此外，本方案中使用的某些试剂与其他C-MSC分离和分化方法所用的试剂有所不同32。例如，本文建议使用的胶原酶为I型和II型胶原酶的混合物，其蛋白水解活性比例均衡。此外，消化液由该胶原酶混合物溶解于制备C-MSC培养基所用的相同基础培养基（IMDM）中而成，从而使分离得到的C-MSC能够适应后续的生长条件。
此外，尽管分选步骤可使细胞批次标准化，但仅通过这些细胞的贴壁特性分离得到的完整C-MSC群体，仍是一种简化方法，且不改变C-MSC的免疫表型特征。本论文提出的T. ADIPO组分能够诱导成脂分化，同时避免胰岛素等其他成分所引起的代谢失调。
此外，本文提出的基于油红O比色强度评估的脂质积累定量方法，相较于仅依据油红O染色阳性细胞百分比的方法，能够提供关于脂质积累量的更多信息。通常可通过异丙醇提取细胞中掺入的油红O并测定其吸光度来量化脂质积累。然而，该方法需要更多的操作步骤，且由于异丙醇易挥发，结果易受实验变异影响。

间充质基质细胞（MSC）是一类在多种组织中具有重要支持功能的成体细胞1。骨髓是MSC的传统来源，但也可从其他多种组织中分离获得，包括胎盘、脂肪组织、脐带血、肝脏和心脏1,2。
2006年，国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy, ISCT）首次明确规定了定义人类MSC的最低标准3。具体而言，MSC必须具有贴附于塑料表面的能力。它们表达特定的表面抗原：对CD44、CD105、CD29和CD90等间充质标记物呈阳性，对CD14、CD45、CD34和CD31等造血及内皮细胞标记物呈阴性，这是MSC的特征。由于不表达HLA-DR，MSC不会引发同种异体免疫反应。此外，MSC具有多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞谱系1,3。
关注心脏的细胞组成，心脏间充质基质细胞（C-MSC）在正常成人心脏中含量丰富4,5。它们在心脏的正常生理功能和病理状态下均发挥关键作用。生理条件下，C-MSC提供支持心肌结构和功能完整性的微环境；而在心脏疾病中，它们会因心脏损伤而被激活，参与伤口愈合和纤维化重塑过程6,7。
最近已证实，C-MSC 参与致心律失常性心肌病（ACM）中的脂肪替代过程8特别是，ACM 是一种主要由桥粒基因突变引起的遗传性疾病，导致心肌发生纤维脂肪性替代，主要累及右心室。9这种替代从心外膜延伸至心内膜，形成一种无传导性的基质，可引发进行性心力衰竭并加重室性心律失常，在严重情况下可能导致猝死。Sommariva 等 证明了致心律失常性心肌病（ACM）患者心脏组织切片中存在前脂肪细胞的间充质来源。此外，从ACM患者心内膜心肌活检组织中分离出的C-MSC表达桥粒基因，因此可能受到这些基因突变的影响。特别是在脂肪生成条件下，ACM患者的C-MSC比对照组心脏来源的C-MSC积累更多的脂质。这些证据表明，C-MSC不仅在疾病发病机制中发挥积极作用，而且是研究ACM的一种有效细胞模型。
为了促进在此背景下或其他需要进行心内膜心肌活检的心脏疾病中的未来研究，本文提供了一项详细方案，用于从小块心内膜心肌组织中分离心脏间充质干细胞（C-MSC）、扩增这些细胞、进行免疫表型表征以及成脂分化。

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Gibco by Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies Italia</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 NB4</td><td>Serva</td><td>17454.02</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tryple select 1X（细胞解离试剂）</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6689</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液</td><td>D.b.a. Italia S.r.l.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>抗体 CD14-FITC（M&amp;phi;P9）</td><td>Becton Dickinson</td><td>345784</td><td></td></tr><tr><td>抗体 整合素 &amp;beta;1（CD29）-PE（克隆 MAR4）</td><td>Becton Dickinson</td><td>561795</td><td></td></tr><tr><td>抗体 PECAM-1（CD31）-APC&amp;nbsp;（克隆 9G11）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>抗体 造血祖细胞抗原（CD34）-APC（克隆 581）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>CD34-581-05</td><td></td></tr><tr><td>抗体 H-CAM（CD44）-PE&amp;nbsp;（克隆 G44-26）</td><td>Becton Dickinson</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>抗体 L-CA（CD45）-APC（克隆 HI30）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD4505-4</td><td></td></tr><tr><td>抗体 THY1（CD90）-FITC（克隆 5E10）</td><td>Becton Dickinson</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>抗体 内皮糖蛋白（CD105）-APC（克隆 266）</td><td>Becton Dickinson</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>抗体 HLA-DR-FITC（克隆 L243）</td><td>Becton Dickinson</td><td>&lt;br/&gt; 347400</td><td></td></tr><tr><td>Gima Quick Plus 消毒器</td><td>Gima&amp;nbsp;</td><td>35642</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机 Sigma 3-16K</td><td>Sigma Centrifuges</td><td>10330</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>AxioVert 200M 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>B 40-080 e 03/01</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gallios</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>773231AF</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ（图像处理程序）</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup 滤器单元</td><td>Merck S.P.A.&amp;nbsp;</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Eppendorf</td><td>30122178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 安全锁扣管</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养多孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BRAND&amp;nbsp;计数板 BLAUBRAND B&amp;uuml;rker-T&amp;uuml;k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td></td></tr></tbody></table>

从心律失常性心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离与鉴定心脏间充质基质细胞

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

正常成人心脏由多种不同类型的细胞组成，其中心脏间充质基质细胞是数量丰富的细胞群体。分离这些细胞不仅有助于研究其在心脏疾病中的作用，还可提供一种有用的原代细胞模型，用于探究生物学机制。
本文描述了从致心律失常性心肌病（ACM）患者心内膜活检样本中分离C-MSC的方法。心内膜心肌活检在电-解剖标测所显示的瘢痕邻近的右心室区域进行引导取样。活检组织经胶原酶消化后，接种于含培养基的塑料培养皿中，以促进C-MSC的生长。分离的细胞可在体外培养中连续传代扩增。为确认其间充质细胞表型，文中提供了免疫表型鉴定方法。C-MSC具有向多种细胞类型分化的能力，包括脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞；鉴于ACM患者心脏中存在脂肪细胞沉积的特征，本文还详细描述了C-MSC向脂肪细胞分化的实验方案以及脂滴积累的鉴定方法。

心脏间质细胞的分离： 从心内膜心肌活检中分离C-MSC的操作流程见图1。
心脏基质细胞的间充质表征：根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，定义多能间充质基质细胞的最低标准包括其免疫表型特征3。具体而言，为确认其间充质谱系来源，需将细胞与相应的FITC/PE/APC标记抗体孵育，并通过流式细胞术进行分析。用于C-MSC表征的所有抗体均列于材料表中。
如图所示 图2，通过活检获得的C-MSC对特定的间充质表面抗原CD29、CD44和CD105呈阳性。CD90阳性细胞的比例存在差异，与先前报道一致11。内皮细胞（CD31、CD34）、单核细胞/巨噬细胞（CD14）、造血细胞（CD45）标志物以及主要组织相容性复合体（HLA-DR）均不表达（图2).
心脏间充质基质细胞的成脂分化：为诱导其成脂分化，需将从致心律失常性心肌病（ACM）患者和健康对照（HC）获得的C-MSC在T. ADIPO培养基（见溶液部分）中进行培养。细胞培养72小时或1周，每周更换培养基两次。
细胞内脂滴的积累通过油红O染色得以证实（图3）。来源于ACM和HC的细胞在成脂分化能力及分化程度上均存在差异。如代表性图像所示，在成脂诱导培养基中培养72小时后，ACM来源的C-MSC比HC来源的C-MSC积累更多的脂滴（图3）。当细胞在成脂诱导条件下培养更长时间（1周）时，这种差异仍然存在（图3）。
<img alt="光谱学光模式；概念：光学发射研究；结果：光谱分析。" src="/files/ftp_upload/57263/57263video1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：电解剖标测图与心内超声心动图的融合。 一名接受心内膜心肌活检患者的右心室心内膜单极电解剖标测图（左前斜位和右前斜位视图，下排图示）。在心尖部可见范围有限的低电压区域（红色/绿色）。心内膜心肌活检样本（标记为圆圈）取自病变心肌及室间隔部位。实时心内超声心动图可用于确认活检钳在目标区域的正确位置（上排图示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_1.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="心脏导管造影X光；血管造影术中的导管放置与血管成像。" src="/files/ftp_upload/57263/57263video2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 2"> 
视频 2：右前斜位透视视频。 活检钳经由长可调弯鞘管插入，并推进至心室。在仔细确认活检钳与心肌接触良好后，张开钳口，随后牢固闭合以采集组织样本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_2.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="脂肪组织处理流程图；取样、切碎、消化、铺板、细胞获取、免疫表型分析、成脂分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程示意图。 使用活检导管（一种小型钳状切割器械）获取心肌内膜活检样本。所获得的活检组织重量约为5 mg（A）。将心肌内膜活检样本用无菌剪刀剪切成0.5–1 mm3大小的组织块（B），并加入胶原酶溶液。将样本置于37 °C、旋转平台混合器上的培养箱中消化1.5小时（C）。消化后的溶液经离心后接种于塑料培养皿中的TMES培养基中（D）。利用细胞对塑料表面的黏附特性，可获得C-MSC，这些细胞以单个细胞、克隆形式，或从小块未完全消化的活检组织中长出的形式存在（E）。随后通过流式细胞术对C-MSC进行表型鉴定（F）。将C-MSC接种至成脂诱导培养基中培养，并通过油红O染色检测脂滴积累情况（G）。比例尺表示50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱；红色染色数据；显示细胞群体分析及阳性细胞百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：C-MSC的代表性细胞荧光分析图谱。 每个直方图显示细胞数量与指定通道中荧光强度的关系（PE：藻红蛋白；APC：别藻蓝蛋白；FITC：异硫氰酸荧光素）。每张图中均显示同型对照（白色）和与特异性细胞表面标志物抗体结合的样本（红色）。C-MSC表达间充质细胞表面抗原CD29、CD44、CD105，部分表达CD90，但不表达CD31、CD34、CD14、CD45和HLA-DR。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪细胞分化、油红O染色、显微镜图像、柱状图、脂质积累分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：C-MSC的脂肪向分化。在脂肪诱导培养基中培养72小时和1周后，ACM和HC来源的C-MSC经油红O（ORO）染色的代表性图像（左侧图片；n = 3）。右侧图为255红色通道染色亮度的定量结果：强度以任意单位（A.U.）表示。ACM来源的C-MSC比对照组积累更多的脂滴。采用Student's T检验，*：p &lt; 0.05。比例尺表示50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文提供了一种从致心律失常性心肌病患者心内膜心肌活检样本中分离心脏间充质基质细胞的方法，并描述了这些细胞的表征及其促进成脂分化的实验方案。

一个正常的成人心脏由多种不同类型的细胞组成，其中心脏间充质基质细胞是数量较多的一类细胞。

本方案的总体目标是从致心律失常性心肌病患者中分离心脏间充质基质细胞，检测其成脂分化能力，并对其表面标志物进行表型分析。该方法有助于回答致心律失常性心肌病研究领域中的关键问题，例如心脏基质细胞在脂肪替代过程中的作用及其潜在的分子机制。该技术的主要优势在于，仅需极少的简单传代步骤即可从小块心脏组织样本中分离出基质细胞。尽管该方法可为心律失常性心肌病的研究提供见解，但也适用于其他系统，例如需要进行心内膜心肌活检的心血管疾病研究。当我们意识到可以将造口细胞分离技术进行缩小化，以应用于心脏活检及其所能提供的电生理学信息时，我们首次提出了该方法的设想。本方案中，使用整合式电生理解剖标测与心脏荧光透视技术，从致心律失常性心肌病（ACM）患者右心室采集心内膜心肌活检样本。采集约五克组织，置于TMES培养基中并运送至实验室。在实验室中，根据需要准备生物安全柜，以进行至外胚层消化前的全部操作。然后将活检组织转移至培养皿中，并用 PBS 洗涤两次。此时可在显微镜下对活检组织进行拍照记录。接着将活检组织转移至含有 1 毫升胶原酶溶液的 2 毫升离心管中。将样本切成大小为0.5至1毫米宽的小片段。随后，在37摄氏度下以持续旋转振荡孵育组织90分钟。接着，离心消化液，弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升PBS中。然后再次离心管体，弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升TMES中。将悬液接种至一个60毫米培养皿中，并用TMES补足体积至3毫升，但不可超过此量。随后根据文字方案中的步骤培养并扩增细胞。开始前，准备好细胞解离试剂、洗涤缓冲液以及所需的抗体。当培养物的预估细胞数量达到三百万时，用10毫升无菌PBS将100毫米培养皿洗涤两次。随后向细胞中加入5毫升细胞解离试剂，在室温下孵育7至10分钟，使细胞脱落。待细胞脱离后，向细胞中加入 15 毫升 PBS，将悬液转移至 50 毫升离心管中。随后离心细胞，并将沉淀重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。然后对细胞进行计数，并将 300 万个细胞转移至新的离心管中，最终体积为 1.5 毫升洗涤缓冲液。接下来，将悬液分装至12个离心管中。向每根离心管中加入用于表征CMSCs的抗体，抗体浓度应按照推荐浓度添加。务必设置同型对照。制备完成后，将各管在室温下避光孵育15分钟。随后向每管中加入1毫升洗涤缓冲液以终止反应。然后离心细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于250微升洗涤缓冲液中。现在使用流式细胞术对细胞进行表征。在细胞成脂分化后，使用油红O染色检测脂质积累。实验开始前，务必准备好油红O工作液。染色前，先移除培养基，并用两毫升 PBS 洗涤细胞两次。然后加入 4% 多聚甲醛覆盖细胞，在室温下固定五分钟。随后弃去多聚甲醛溶液，并用两毫升 PBS 再次洗涤细胞两次。第二次洗涤后，加入足量的 ORO 工作液以覆盖细胞。然后在室温下孵育 1 小时。此孵育步骤必须在自动溶液系统无法运行的环境中进行，因此不建议在完全封闭的房间内操作。孵育结束后，吸除 ORO 溶液，并用两毫升 PBS 多次洗涤细胞，直至 PBS 洗涤液中不再可见染料，且在显微镜下观察时无非特异性染色。接下来，使用倒置组织培养相差显微镜，在 20 倍放大倍数下对每个孔拍摄 20 张图像。具体细节详见文本方案。CMSCs 从心内膜心肌活检组织中分离获得，方法如前所述。为确认其间充质细胞谱系，将细胞与相应的荧光素偶联抗体孵育，并通过流式细胞术进行分析。CMSCs 对特异性间充质表面抗原 CD29、CD44 和 CD105 呈阳性。已知CD90阳性细胞的比例具有可变性。这些细胞不表达内皮来源、单核细胞或巨噬细胞来源、造血来源以及主要组织相容性复合体的标志物。随后，将CMSCs在T.ADIPO培养基中进行培养以诱导脂肪向分化，并用油红O（ORO）染色以检测细胞内脂滴的形成。与健康对照者的细胞相比，来自致心律失常性心肌病患者的CMSCs在72小时和七天的分化条件下积累了更多的脂滴。该技术一旦掌握，细胞分离可在三小时内完成，染色可在两小时内完成，而图像分析可在三小时内完成。采用此方法后，还可进行药物测试等其他实验，以回答更多问题，例如：我们能否利用同一患者的间质细胞对不同刺激作出反应。该技术建立后，为致心律失常性心肌病领域的研究人员探索人类心脏间质细胞在疾病发病机制中的作用开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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