排序链霉菌细胞沉淀用一个复杂的对象参数分析仪和分选机

该程序的总体目标是使用大颗粒 COPA 流式细胞仪根据大小对丝状链霉菌形成的菌丝体沉淀进行分类。这首先通过所需细菌菌株的生长和随后的取样来实现。在第二步中，通过 coppa 测量样品菌株。

然后对数据进行计算机分析，并根据用户定义的参数对菌丝体沉淀进行分类。最终，这些分析可用于进一步表征颗粒大小的异质性。虽然这种方法可以用于链霉菌，但它也可以应用于其他生物体，例如丝状真菌，我们实验室的博士生 MaRous Petrus 将证明该程序。

首先，将 100 毫升酵母提取物、麦芽提取物培养基和 0.2 毫升 2.5 摩尔氯化镁加入一个无菌 250 毫升锥形瓶中，每个细菌样品都配有金属螺旋弹簧，以培养培养物。然后用 1 乘以 10 对链霉菌的 8 个孢子接种每个烧瓶，以获得每毫升 10 乘以 6 个孢子的孢子浓度，并在 30 摄氏度下以 180 RPM 振荡培养细菌。两天后，使用无菌的 5 ml 移液器从每种培养物中收集 5 mL 样品，同时轻轻摇动培养瓶以均匀分布细胞。

然后将每个样品分配到单独的 15 mL 锥形管中。要通过 copus 分析评估样品，请确认 copus plus 泵计算机和 488 纳米氩激光器已打开，然后打开生物源软件。确认鞘液瓶已满且废液瓶已空，然后单击 Start（开始）和 Run（运行）。

要在大约 60 秒后将 488 纳米氩激光器从待机切换到开启，激光器将准备就绪。单击，完成，然后检查压力表。单击 pressure 旁边的复选框。

好的，然后在系统灌注流通池后，确认延迟设置为 11，宽度为 7。将阈值设置为 50 表示 signal，将阈值设置为 40 表示最小飞行时间。然后去除样品杯中剩余的水。

加入约 50 毫升 PBS，然后将 0.1 毫升链球菌样品之一加入杯中。确保杯子已正确关闭，然后单击 acquire 开始收集数据。管理流速，以便在至少收集 2， 500 个事件时每秒获取 30 到 50 个事件。

单击、停止然后存储以保存数据以供后续统计分析，以对每个样品的细菌沉淀进行排序。首先设置排序限制，并输入有关最小和最大飞行时间值的详细信息。或者，选择区域，然后定义浇口区域，以创建一个区域来选择具有所需尺寸和属性的颗粒。

放置一个 50 毫升的试管，收集符合分选参数的沉淀。然后设置要排序的颗粒数量，然后单击 sort manually 对所选参数进行排序。分选后，取出剩余的样品，用水冲洗样品杯两次。

在关闭 copus 之前，用 70% 乙醇清洁样品杯。现在运行系统两次。一次用氯化水，一次用白开水，然后清空溢流容器清洁后，单击停止以释放系统压力。

当电机停止时，关闭程序并单击关闭而不清除。然后关闭计算机，椰浆、激光和泵链霉菌形成。菌丝体沉淀和液体培养物，粒径范围广。

为了分析沉淀大小分布，使用配备 1 毫米喷嘴的 copus plus 剖面仪对两天龄液体生长的纤毛链霉菌色素培养物进行大颗粒流式细胞术。此处显示了典型的 copus 输出散点图。x 轴表示飞行时间。

上诉越大，通过激光束所需的时间就越长。Y 轴表示消光，它代表物体的光密度，它中的每个点都对应于通过激光束的单个颗粒。将数据点绘制成直方图，表明该代表性样本的大小不是正态分布的。

分布似乎偏向于正确的对数。转换数据集也不会导致正态分布，以评估是否可以通过假设两个正态分布的混合来解释大小分布，数据进行了数学建模。建模确实表明，小颗粒群由 92% 的颗粒组成，平均尺寸为 248 微米，而大颗粒群占所有颗粒的 8%，平均尺寸为 319 微米。

这里显示了从大颗粒群和小颗粒群中分选的微菌落的代表性分析。两个群体的平均颗粒大小用于定义分选边界，以限制从两个尺寸分布的重叠部分分选颗粒小于 248 微米的颗粒被认为来自小颗粒群，而大于 319 微米的颗粒被认为来自大颗粒群。对分选的颗粒进行显微镜分析，确认了它们的不同大小 遵循此程序。

可以执行其他方法，如下一代测序或蛋白质组学，以揭示这种异质性的潜在机制。