Name: 排序链霉菌细胞沉淀用一个复杂的对象参数分析仪和分选机 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解如何使用COPA流式细胞仪对链霉菌菌丝体颗粒进行高通量分选和分析。该方法可识别小颗粒（平均248微米）和大颗粒（平均319微米）两种群体，为研究丝状细菌生长异质性提供有效工具。

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从培养两天的液体培养物中分析和分选Streptomyces菌丝团的流程在图1中以示意图形式展示。该方法的详细步骤如下所述。
1. 培养（包括培养基和缓冲液的制备）
<ol>
	<li>配制 1 L 的 10×&#160;磷酸盐缓冲液（PBS；80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4 溶于 1 L 蒸馏水中，调节 pH 至 7.4）。使用时，取 100 ml 10×&#160;PBS 加入 900 ml 蒸馏水中，得到 1 L 的 PBS 溶液。</li>
	<li>配制 1 L YEME 培养基（3 g Difco 酵母提取物、5 g Bacto 胰蛋白胨、3 g Oxoid 麦芽提取物、10 g 葡萄糖、340 g 蔗糖，加蒸馏水至 1 L）和 100 ml 2.5 M MgCl2 溶液。将两种溶液均通过高压灭菌进行灭菌。注意，也可使用其他 Streptomyces 培养基4,14。</li>
	<li>向一个装有金属螺旋弹簧的无菌 250 ml 锥形瓶中加入 100 ml YEME 培养基和 0.2 ml 2.5 M MgCl2。根据待研究的细菌样品数量准备相应数量的锥形瓶。</li>
	<li>每瓶接种 108 个 Streptomyces 孢子，使孢子浓度达到 106 个/ml。在 30 °C、180 rpm 振荡条件下培养细菌 2 天。</li>
</ol>
2. 取样
<ol>
	<li>使用无菌的5 ml移液管，从每种培养物中转移5 ml样品至15 ml Falcon管中。取样时轻轻摇动培养物，以确保样品具有代表性。</li>
	<li>若样品需立即使用COPAS进行分析，则无需进行样品制备步骤。将样品置于冰上，并直接进入本方案的步骤3.1。若样品需在后续时间点进行分析，则按照本方案的步骤2.3–2.5所述固定沉淀物。请注意，固定处理还可防止分析后管路系统未彻底清洗时细菌的生长。需确保甲醛固定不会影响后续分析。例如，真菌沉淀物经甲醛固定后无法提取RNA；相比之下，使用70%乙醇固定后可成功提取RNA12。</li>
	<li>向5 ml样品中加入600 μl 37%甲醛，通过轻轻倒置管子3次混匀。将样品置于冰上固定30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以2,500 × g转速使用固定角转子离心机离心10分钟。小心移除上清液，并用5 ml PBS重悬沉淀物进行洗涤。</li>
	<li>重复步骤2.4，使沉淀物用PBS洗涤两次。样品可在4 °C条件下以PBS保存数周。</li>
</ol>
3. COPAS 分析
<ol>
	<li>确保 COPAS Plus、泵、计算机和 488 nm 氩激光器均已开启，并启动 Biosort 软件。尽管已开启，激光器仍处于待机模式。</li>
	<li>检查鞘液瓶是否已装满，废液瓶是否为空。</li>
	<li>点击“START”，然后点击“RUN”，将 488 nm 氩激光器从待机状态切换至开启状态。大约 60 秒后，当激光器开启时，点击“DONE”。</li>
	<li>检查压力表。“鞘流”、“样品”、“分选器”和“清洗”的压力读数应分别约为 4.0、0.5、2.7 和 10.9。</li>
	<li>点击“Pressure OK”旁边的复选框。系统将对流动池进行预灌注，准备就绪可供使用。</li>
	<li>默认设置为“Delay”11，“Width”7。“Signal”的阈值设为 50，“TOF Minimum”设为 40，其中 TOF 表示飞行时间。（补充说明：所有“Gains”均设为 1，触发模式设为 EXT（消光），在“Configuration”选项卡下的“Select scan rate”中选择 2.50 MHz，重合度设为“Enhanced”。）</li>
	<li>从样品杯中移除残留的水，并加入 0.1 ml 来自步骤 2.2 或 2.5 的 Streptomyces 样品以及约 50 ml PBS。确保样品杯已正确关闭。</li>
	<li>点击“Acquire”开始采集数据。调节流速，使每秒获得 30–50 个事件。如果流速过高，向样品杯中添加 PBS；如果流速过低，则添加更多样品。</li>
	<li>当至少采集到 2,500 个事件时，点击“STOP”。为保存所有数据，点击“Store”并保存文件以供后续统计分析。Biosort 软件将数据保存为四个文件，其中仅 .txt 文件用于后续分析。</li>
	<li>使用 50 ml 注射器从样品杯中移除样品，并用水清洗 2 次，以清洁样品杯。</li>
	<li>重复步骤 3.7–3.10，直至所有样品均完成分析。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>打开 .txt 文件，剔除 EXT 值低于 25 的数据（例如可使用 Microsoft Excel 进行操作）。这些数据对应的是碎片和游离的菌丝片段（对于 Aspergillus niger，所有 EXT 值低于 150 的数据均应剔除）4,12。然后，将所有飞行时间（TOF）数据保存为单列的纯文本 '.txt' 文件（对于大量数据文件，可在编程语言 R 中实现自动化处理，R 可从以下网址获取：<a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a>）。</li>
	<li>确保已安装 SciLab（版本 5.3.2 或更高版本，下载地址：http://www.scilab.org/），并同时安装 'fittools' 库。该库及其使用手册可从以下链接获取： 
	http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip 
	http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual%20fittools.pdf</li>
	<li>启动 SciLab，并运行 fittools 库中的必要函数以对数据进行建模。简要步骤如下：按照手册说明安装 fittools 库（仅需安装一次）。
	<ol>
		<li>加载 fittools 库。</li>
		<li>将数据（'.txt' 文件）读入 SciLab。</li>
		<li>对数据进行对数转换（默认使用自然对数）。</li>
		<li>使用双群体模型对数据进行拟合。</li>
		<li>绘制包含直方图和拟合模型的图形（可选）。</li>
		<li>对数据进行自助法抽样（Bootstrap，1,000 次重复）。</li>
		<li>将模型拟合到自助法生成的数据集上。</li>
		<li>获取 5 个参数的置信区间估计值。结果将提供两个群体的参与比例（p）、各自的均值（μ1 和 μ2）以及相应的标准差（α1 和 α2）。此外，通过自助法（1,000 次重复）后重新拟合模型，确定 95% 置信区间12,13,15。若两个均值的置信区间无重叠，且 p 的置信区间位于 0.025–0.975 范围内，则该数据集可被解释为两个正态分布群体的组合。（注意：小菌球的参与比例为 p，而大菌球的参与比例为 1-p。）Streptomyces 菌球的 TOF 与其直径之间的关系为：直径 = 0.57 × TOF + 159 μm4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若分析结果显示存在两个群体，可将平均 TOF 值作为 COPAS 分选仪的分选参数，分别设定为小菌球和大菌球分选的上下限。请注意，用户也可根据实际需求选择其他分选参数。</li>
</ol>
5. 样品沉淀物分选
<ol>
	<li>按照步骤 3.7 所述，加载需要分选的 Streptomyces 样品。</li>
	<li>设置“分选范围”，并输入飞行时间（TOF）的最小值（Lo）和最大值（Hi）。或者，通过选择“区域”（Regions）并点击“定义门控区域”（Define Gate Region），圈定具有目标尺寸或特性的菌粒。</li>
	<li>放置一个 50 ml 离心管，用于收集符合分选参数的多个菌粒。或者，也可使用微孔板对单个菌粒进行分选。进行 DNA 和蛋白质提取需要多个菌粒（104-105）。qPCR 分析基因表达时，单个菌粒已足够，但进行 RNA 测序则需要多个菌粒。</li>
	<li>确定并设置所需分选的菌粒数量，点击“手动分选”（Sort Manually）以按选定参数进行分选。当达到设定数量后，分选将自动停止。</li>
	<li>使用 50 ml 注射器从样品杯中移除剩余样品，并用水清洗样品杯 2 次。若需分选其他样品，请重复步骤 5.1–5.5。</li>
	<li>关闭 COPAS 前，先用水冲洗样品杯以去除残留菌粒，再用含 70% 乙醇（EtOH）和/或 2% 次氯酸钠的水溶液清洗样品杯。运行一次含氯水样以清洁整个系统，并重复运行一次纯水。清空溢流容器，并清洁或更换其中的滤膜。</li>
	<li>完成后，点击“停止”（STOP）以释放系统压力。待电机停止后，关闭程序并点击“不排空关机”（Shutdown without purging），随后关闭计算机、COPAS 仪器、激光器和泵。</li>
</ol>

<ol><li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHopwood%2C+DA+%22Streptomyces+in+nature+and+medicine%3A+the+antibiotic+makers%22">Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers</a>. , University Press. New York, Oxford. (2007).</li>
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<li>Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+production+and+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li>
<li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li>
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<li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li>
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<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li>
<li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Stud.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li>
<li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKieser%2C+T+%22Practical+Streptomyces+Genetics%22">Practical Streptomyces Genetics</a>. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).</li>
<li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li>
<li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

流式细胞术实现了对大量单细胞的高速分析，这有助于我们理解克隆群体中的异质性6。常规流式细胞术无法用于链霉菌和真菌的多细胞菌丝团（mycelial pellets）分析。我们的研究已证明，使用COPAS可实现对Streptomyces菌丝团的高通量分析。本文所述方法操作简便、快速，且高度可重复。仪器操作过程中需特别注意的关键参数是流速，其不应超过100个事件/秒&#160;（本方案步骤3.8）。若菌丝团浓度过高，导致流速过高，仪器将无法准确识别单个菌丝团，从而导致TOF值计算错误。通过加入PBS充分稀释样品可解决此问题。
局限性 
本研究所使用的 COPAS Plus 配备直径为 1 mm 的喷嘴，适用于测量粒径范围在 30–700 μm 的颗粒，因此可用于测定链霉菌形成的菌团。然而，对于丝状真菌，其微菌落可能更大，这限制了 COPAS Plus 的普遍适用性。COPAS XL 可测量最大达 1,500 μm 的颗粒，但其在较小粒径范围内的灵敏度低于 COPAS Plus。COPAS Plus 和 COPAS XL 均无法分析小于 30 μm 的颗粒，这意味着单个微生物孢子或细胞无法被检测。此外，COPAS 系统可能无法准确分析孢子或细胞形成的小聚集体，以及非常小的微菌落；对于此类样本，应使用常规细胞分析仪。这一局限性可通过 Union Biometrica 公司的 Biosorter 克服，该仪器可分析粒径范围为 1–1,500 μm 的颗粒，但其采购成本较高。
故障排除 
COPAS 是一种坚固且易于操作的仪器。然而，有时在将样品加入样品杯并启动测量后，无法检测到颗粒。通常原因是入口管堵塞，可通过按下“clean”命令轻松解决。该操作会将颗粒从管路系统推回样品杯中。另一个可能的原因是样品杯盖未正确安装，这会导致压力损失，进而导致无法检测到颗粒。
意义与未来方向 
本文重点关注了菌团大小的分析，但 COPAS 系统还能够基于荧光和密度进行分析与分选。荧光检测使我们能够利用 GFP 等报告基因分析基因表达，同时还能评估细胞的组成成分。更强大的功能是可根据这些参数对菌团进行分离。分选后的菌团可用于后续分析，包括各类组学研究。事实上，我们此前曾分选了 60,000 个大菌团和 200,000 个小菌团，并证明大菌团与小菌团之间的蛋白质组存在显著差异4。因此，该技术为提升链霉菌作为细胞工厂的性能提供了新的研究方向。
COPAS 技术的关键优势在于节省时间。以往对菌丝球的研究依赖显微镜进行，这将可分析的菌丝球数量限制在数百个以内16。显微镜研究已提示，在液体培养的Streptomyces培养物中存在两类菌丝球群体16。事实上，在多种链霉菌中，无论培养条件如何，均检测到两类不同大小的菌丝球群体4。这种大小异质性不仅存在于丝状链霉菌中，在丝状真菌中也观察到了类似现象12。然而，上述异质性现象背后的机制至今尚不清楚。利用该技术可根据菌丝球的大小和荧光特性对其进行分选，从而有助于揭示这些机制。

链霉菌是一类丝状土壤细菌，以其能够产生抗生素而闻名，同时还可生成可用作免疫抑制剂或用于抗真菌感染和抗癌的化合物1,2。此外，这些生物体还能产生多种在工业应用中具有重要意义的酶3。大多数具有商业价值的这类化合物均在生物反应器中生产。链霉菌在生物反应器中的生长特征是形成由相互连接的菌丝组成的复杂结构，称为菌团或菌丝球。这些多细胞结构在大小上具有高度异质性4，其体积可超过单细胞细菌（如Escherichia coli或Bacillus subtilis）一百万倍以上。尽管在自然生物系统中，异质性通常被视为一种有益性状5，但在工业生产中却被认为是影响产量的障碍。为了获得尽可能高的产率，生物反应器中的培养过程必须具备可重复性和可控性。因此，深入理解生物反应器中各类菌丝球所起的作用，对于将链霉菌优化为细胞工厂至关重要。
流式细胞术常用于分析群体中的单个细胞6。流式细胞仪可通过同时测量细胞的多种特性（如大小、密度和多色荧光），获取多参数信息。通过这种方式，可关联细胞特性，从而增进对培养物内异质性以及不同细胞亚群存在的理解6。更专业的仪器使得可根据用户自定义参数对细胞进行分选。例如，可用于筛选突变体。分选后的突变细胞可进一步培养以进行表征。该方法已被证明在提高菌株生产力等方面具有实用价值7,8。常规流式细胞仪的喷嘴通常仅允许最大直径约10 μm的细胞通过。因此，链霉菌的菌丝团无法用常规流式细胞仪进行分析。然而，可使用复杂物体参数分析仪与分选仪（COPAS）进行分析。与常规流式细胞仪类似，COPAS能够以高通量方式获取颗粒的多参数数据。根据COPAS型号的不同，可分析10–1,500 μm范围内的颗粒。此外，它还支持对单个颗粒进行分选，分选出的颗粒可用于后续培养或下游分析，例如DNA、RNA或蛋白质的提取。COPAS最初设计用于分析和分选小型多细胞生物，例如线虫Caenorhabditis elegans9以及果蝇Drosophila的胚胎和幼虫10。该仪器也已被用于斑马鱼11和丝状真菌12,13的研究。后者同样会形成菌丝团，其尺寸甚至大于丝状细菌所形成的菌丝团。我们近期已证明，COPAS同样适用于链霉菌的分析4。本文描述了利用COPAS评估Streptomyces coelicolor菌丝团异质性的实验流程，包括按大小对菌丝团进行分选的方法细节。但需注意，该方法也可用于其他形成菌丝团的链霉菌的分析。

<table><tbody><tr><td>COPAS Plus</td><td>Union Biometrica</td><td>PLUS</td><td>大型颗粒流式细胞仪，包含激光器和软件</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td>PBS组分</td></tr><tr><td>Difco酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>210933</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Bacto蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Oxoid麦芽提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXLP0039B</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>培养基组分。高压灭菌后加入。</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>沉淀物固定</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71696</td><td>用于仪器清洁</td></tr><tr><td>乙醇（EtOH）</td><td>VWR</td><td>20816.367</td><td>用于仪器清洁</td></tr><tr><td>锥形瓶（250 ml）</td><td>Fisher Scientific</td><td>214-1132</td><td>用于培养链霉菌的培养瓶</td></tr><tr><td>弹簧</td><td>Verenfabriek De Spiraal</td><td>定制</td><td>用于培养瓶中。RVS1.4401/长度210 mm/直径17 mm/螺距5 mm</td></tr><tr><td>无菌离心管（15 ml）</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>注射器（50 ml）</td><td>Sigma</td><td>Z683698</td><td></td></tr></tbody></table>

分选 链霉菌属 使用复杂物体参数分析仪和分选器制备细胞沉淀

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

链霉菌是一类丝状土壤细菌，工业上常用于生产酶和抗生素。在生物反应器中培养时，这些微生物会形成相互连接的菌丝网络，称为菌丝球，其大小具有异质性。本文介绍了一种利用复杂物体参数分析仪与分选仪（COPAS）对菌丝球进行分析和分选的方法。文中详细说明了仪器的操作步骤以及数据的基本统计分析方法。此外，还描述了如何根据用户自定义的参数对菌丝球进行分选，从而实现后续处理，例如RNA或蛋白质含量分析。通过该方法可深入探究异质性生长背后的机制，这对于提升链霉菌作为细胞工厂的性能具有重要意义，因为生产效率与菌丝球的大小密切相关。

链霉菌菌团的 COPAS 测量 
链霉菌在液体培养中会形成菌丝团，其大小具有较广的分布范围。为了分析菌团大小分布，将培养 2 天的Streptomyces coelicolor液体培养物使用配备 1 mm 喷嘴的 COPAS Plus 分析仪进行大颗粒流式细胞术检测。典型的 COPAS 输出结果为散点图，如图 2A所示。横轴表示飞行时间（TOF），其与菌团大小相关（即较大的菌团通过激光束所需时间更长）。纵轴显示消光值，代表颗粒的光学密度。散点图中的每个点对应一个独立事件，即单个菌团通过激光束的过程。重要的是，当样品浓度过高（即激光每秒检测到超过 100 个事件）时，COPAS 常常无法准确识别单个菌团，从而导致 TOF 值虚高。稀释样品可降低平均 TOF 值，直至达到进一步稀释不再影响 TOF 的临界点。该临界点出现在每秒约分析 100 个菌团时。
将数据点绘制成直方图表明，颗粒大小并不呈正态分布（图 2B）。该分布呈现右偏态。对数据集进行对数转换后仍未获得正态分布（图 2C）。为了评估该尺寸分布是否可通过假设由两个正态分布混合而成来解释，对该数据进行了数学建模12,15。建模结果确实表明，该尺寸分布可通过假设存在两组不同的颗粒群体来解释。小颗粒群体占所有颗粒的92%，平均尺寸为248 μm；而大颗粒群体（占所有颗粒的8%）平均尺寸为319 μm（需注意：当参与比例处于2.5%-97.5%之间时，认为存在两个群体）。 
根据尺寸对链霉菌颗粒进行分选
对大团聚体和小团聚体群体中的微菌落进行了分选。为此，利用这两个群体的平均团聚体大小来确定分选边界。小于248 μm的团聚体被视为来自小团聚体群体，而大于319 μm的团聚体被视为来自大团聚体群体（图3），以减少两个尺寸分布重叠部分团聚体的分选。对分选后的团聚体进行显微分析，显示其尺寸差异明显（图3）。收集的团聚体可进一步用于DNA、RNA或蛋白质的提取。
<img alt="详细说明链霉菌菌丝球生长、取样、COPAS 分析、数据分析及菌丝球分选过程的流程图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 利用 COPAS 测量和分析 Streptomyces 菌丝球的实验流程示意图。 详细步骤见实验方法部分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="飞行时间分析；显示消光相关性、峰分布和对数尺度变化的图表。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 液体培养的Streptomyces菌株中菌丝球大小的异质性。 对一株培养2天的S. coelicolor YEME菌株进行COPAS分析（A）表明，菌丝球大小（以飞行时间值表示）呈非正态分布（B），且经对数转换后仍不呈现正态分布（C）。相反，检测到两群在飞行时间（因而大小）上不同的菌丝球群体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="细胞大小分布分析、直方图、显微镜图像、双峰群体比较。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 根据大小对 Streptomyces 菌丝球进行分级。 大小小于248 μm的菌丝球（以粉红色标示）被视为小菌丝球，而大小大于319 μm的菌丝球（以蓝色标示）被视为大菌丝球。显微镜分析证实了其尺寸差异。需注意，这些尺寸是根据飞行时间（TOF）与Streptomyces菌丝球直径之间的关系式（即直径 = 0.57 × TOF + 159 μm）对对数转换后的数据计算得出的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>

液体培养的链霉菌（Streptomyces）菌落通常表现为大小不均一的菌丝球。本文介绍一种高通量分析和分选此类菌丝球的方法。这些菌丝球可用于后续分析，有助于深入理解并调控其生长异质性。

链霉菌是一类丝状土壤细菌，工业上常用于酶和抗生素的生产。在生物反应器中培养时，这些……

本实验的总体目标是利用大型颗粒 COPA 流式细胞仪，按大小对丝状链霉菌形成的菌丝体团块进行分选。首先培养目标细菌菌株并进行取样，以完成第一步。第二步则通过 COPPA 对样品菌株进行测量。随后在计算机中对数据进行分析，并根据用户自定义的参数对菌丝球进行分选。最终，这些分析可用于进一步表征菌丝球大小的异质性。尽管该方法可用于链霉菌，但也适用于其他生物体，如丝状真菌。本实验操作将由本实验室的博士研究生 MaRous Petrus 演示。首先，为每个细菌样品准备一个无菌的 250 毫升锥形瓶，并加入 100 毫升酵母提取物、麦芽提取物培养基和 0.2 毫升 2.5 摩尔/升的氯化镁，锥形瓶中需装有金属螺旋弹簧。然后，将每瓶接种 1 × 10⁸ 个链霉菌孢子，使孢子浓度达到 1 × 10⁶ 个孢子/毫升，并在 30 °C、180 RPM 振荡条件下培养细菌。两天后，轻轻振荡锥形瓶以均匀分散细胞，再用无菌的 5 毫升移液管从每种培养物中吸取 5 毫升样品。然后将每个样品分别加入到15毫升的锥形管中。若需通过流式细胞仪分析样品，需确认流式细胞仪及其泵控计算机和488纳米氩离子激光器已开启，然后打开生物源软件。确认鞘液瓶已装满且废液瓶为空，随后点击“开始”并运行。在约60秒后，将488纳米氩离子激光器从待机状态切换至开启状态，激光器将准备就绪。点击“完成”，然后检查压力表。点击压力旁边的复选框。然后，在系统对流式池完成预启动后，确认延迟设置为11，宽度设置为7。将信号阈值设为50，飞行时间最小阈值设为40。随后清除样品杯中残留的水。加入约 50 毫升 PBS，然后向杯中加入 0.1 毫升的某一种链球菌去垢剂处理样本。确保杯盖已正确关闭，然后单击“采集”以开始收集数据。调节流速，使每秒获得 30 至 50 个事件，直至至少收集到 2,500 个事件为止。点击、停止，然后存储数据，以保存用于后续统计分析的细菌沉淀物，为每个样本进行分选。首先设置分选阈值，并输入飞行时间最小值和最大值的详细信息。或者，选择区域后定义门控区域，以创建一个用于选取具有理想尺寸和特性的沉淀物的区域。放置一个50毫升离心管，用于收集符合分选参数的颗粒。然后设置需分选的颗粒数量，点击手动分选，以针对所选参数进行分选。分选完成后，移除剩余样品，并用水冲洗样品杯两次。关闭 copus 前，使用 70% 乙醇清洁样品杯。随后运行系统两次：第一次使用含氯水，第二次使用纯水，然后排空溢流容器。清洁完成后，单击“停止”以释放系统压力。当电机停止后，关闭程序并点击关机，无需冲洗。然后关闭计算机、copa、激光器和泵。链霉菌形成的菌丝球及液体培养物具有多种尺寸。为了分析沉淀物的粒径分布，将一株生长两天的液体培养的链霉菌 *Streptomyces cila* 色素菌株，采用配备1毫米喷嘴的Copus Plus分析仪进行大颗粒流式细胞术检测。此处展示了一张典型的Copus输出散点图，横轴表示飞行时间。颗粒越大，通过激光束所需的时间越长。Y轴表示消光值，代表物体的光密度，图中每个点对应一个单独颗粒通过激光束的过程。将数据点绘制成直方图后显示，该代表性样本的颗粒大小分布不符合正态分布。分布似乎向右偏斜。对数据集进行转换后仍未得到正态分布。为了评估是否可以通过假设由两种正态分布混合来解释尺寸分布，对数据进行了数学建模。建模结果确实显示存在两个颗粒群体：一个小颗粒群体，占所有颗粒的92%，平均尺寸为248微米；另一个大颗粒群体，占所有颗粒的8%，平均尺寸为319微米。此处展示了从大颗粒群和小颗粒群中分选得到的微菌落的代表性分析结果。采用两个群体的平均颗粒大小来界定分选边界，以限制来自两种粒径分布重叠区域的颗粒被分选；小于248微米的颗粒被视为来自小颗粒群体，而大于319微米的颗粒则被视为来自大颗粒群体。对分选后颗粒的显微分析证实了它们在尺寸上的显著差异。还可以采用下一代测序或蛋白质组学等其他方法来揭示这种异质性的潜在机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

排序<em&gt;链霉菌</em&gt;细胞沉淀用一个复杂的对象参数分析仪和分选机

来源：Kim, H. et. al., 利用高通量遗传酶筛选系统进行多酶筛选。J. Vis. Exp.

检测转基因细菌细胞中靶酶的表达

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从人类原代来源或分化样本中对人巨核细胞进行免疫表型分析和细胞分选 体外 来自造血祖细胞

本文介绍了一种准确且可靠地检测稀有细胞类型中代谢物的实验方案。通过技术改进，包括采用改良的鞘液进行细胞分选以及制备相应的空白对照样本，仅需每样本5000个细胞即可实现对代谢物的全面定量分析。...

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本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。...

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设定外泌体分离的成功分选条件

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。...

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

了解如何使用COPA流式细胞仪对链霉菌菌丝体颗粒进行高通量分选和分析。该方法可识别小颗粒（平均248微米）和大颗粒（平均319微米）两种群体，为研究丝状细菌生长异质性提供有效工具。

分选链霉菌属使用复杂物体参数分析仪和分选器制备细胞沉淀

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