排序链霉菌细胞沉淀用一个复杂的对象参数分析仪和分选机
2014年2月13日
液体培养链霉菌培养物的特点是菌丝球是异构的大小。我们在这里描述了一种分析方法及排序，例如粒料在高通量方式进行。这些粒料可以用于进一步的分析，这将提供线索理解和控制生长的异质性。
该程序的总体目标是使用大颗粒 COPA 流式细胞仪根据大小对丝状链霉菌形成的菌丝体沉淀进行分类。这首先通过所需细菌菌株的生长和随后的取样来实现。在第二步中，通过 coppa 测量样品菌株。
然后对数据进行计算机分析，并根据用户定义的参数对菌丝体沉淀进行分类。最终，这些分析可用于进一步表征颗粒大小的异质性。虽然这种方法可以用于链霉菌，但它也可以应用于其他生物体，例如丝状真菌，我们实验室的博士生 MaRous Petrus 将证明该程序。
首先，将 100 毫升酵母提取物、麦芽提取物培养基和 0.2 毫升 2.5 摩尔氯化镁加入一个无菌 250 毫升锥形瓶中，每个细菌样品都配有金属螺旋弹簧，以培养培养物。然后用 1 乘以 10 对链霉菌的 8 个孢子接种每个烧瓶，以获得每毫升 10 乘以 6 个孢子的孢子浓度，并在 30 摄氏度下以 180 RPM 振荡培养细菌。两天后，使用无菌的 5 ml 移液器从每种培养物中收集 5 mL 样品，同时轻轻摇动培养瓶以均匀分布细胞。
然后将每个样品分配到单独的 15 mL 锥形管中。要通过 copus 分析评估样品，请确认 copus plus 泵计算机和 488 纳米氩激光器已打开，然后打开生物源软件。确认鞘液瓶已满且废液瓶已空，然后单击 Start（开始）和 Run（运行）。
要在大约 60 秒后将 488 纳米氩激光器从待机切换到开启，激光器将准备就绪。单击，完成，然后检查压力表。单击 pressure 旁边的复选框。
好的，然后在系统灌注流通池后，确认延迟设置为 11，宽度为 7。将阈值设置为 50 表示 signal，将阈值设置为 40 表示最小飞行时间。然后去除样品杯中剩余的水。
加入约 50 毫升 PBS，然后将 0.1 毫升链球菌样品之一加入杯中。确保杯子已正确关闭，然后单击 acquire 开始收集数据。管理流速，以便在至少收集 2， 500 个事件时每秒获取 30 到 50 个事件。
单击、停止然后存储以保存数据以供后续统计分析，以对每个样品的细菌沉淀进行排序。首先设置排序限制，并输入有关最小和最大飞行时间值的详细信息。或者，选择区域，然后定义浇口区域，以创建一个区域来选择具有所需尺寸和属性的颗粒。
放置一个 50 毫升的试管，收集符合分选参数的沉淀。然后设置要排序的颗粒数量，然后单击 sort manually 对所选参数进行排序。分选后，取出剩余的样品，用水冲洗样品杯两次。
在关闭 copus 之前，用 70% 乙醇清洁样品杯。现在运行系统两次。一次用氯化水，一次用白开水，然后清空溢流容器清洁后，单击停止以释放系统压力。
当电机停止时，关闭程序并单击关闭而不清除。然后关闭计算机，椰浆、激光和泵链霉菌形成。菌丝体沉淀和液体培养物，粒径范围广。
为了分析沉淀大小分布，使用配备 1 毫米喷嘴的 copus plus 剖面仪对两天龄液体生长的纤毛链霉菌色素培养物进行大颗粒流式细胞术。此处显示了典型的 copus 输出散点图。x 轴表示飞行时间。
上诉越大，通过激光束所需的时间就越长。Y 轴表示消光，它代表物体的光密度，它中的每个点都对应于通过激光束的单个颗粒。将数据点绘制成直方图，表明该代表性样本的大小不是正态分布的。
分布似乎偏向于正确的对数。转换数据集也不会导致正态分布，以评估是否可以通过假设两个正态分布的混合来解释大小分布，数据进行了数学建模。建模确实表明，小颗粒群由 92% 的颗粒组成，平均尺寸为 248 微米，而大颗粒群占所有颗粒的 8%，平均尺寸为 319 微米。
这里显示了从大颗粒群和小颗粒群中分选的微菌落的代表性分析。两个群体的平均颗粒大小用于定义分选边界，以限制从两个尺寸分布的重叠部分分选颗粒小于 248 微米的颗粒被认为来自小颗粒群，而大于 319 微米的颗粒被认为来自大颗粒群。对分选的颗粒进行显微镜分析，确认了它们的不同大小 遵循此程序。
可以执行其他方法，如下一代测序或蛋白质组学，以揭示这种异质性的潜在机制。
概述
本研究提出了一种基于大颗粒COPA流式细胞仪对液体培养的链霉菌菌丝体颗粒按大小进行分类的方法。该方法允许对颗粒大小异质性进行高通量分析，这可以带来对生长控制的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 生物技术
背景
- 链霉菌是一种以其复杂的生命周期而闻名的丝状细菌。
- 生长过程中形成的菌丝体颗粒表现出大小异质性。
- 理解这种异质性对于生物技术应用至关重要。
- 流式细胞术提供了一种以高通量方式分析颗粒大小的方法。
研究目的
- 开发一种按大小对菌丝体颗粒进行分类的方法。
- 分析链霉菌颗粒的大小分布。
- 为进一步研究生长异质性提供框架。
使用的方法
- 在受控环境中培养链霉菌。
- 对流式细胞术分析进行取样和准备。
- 使用COPA流式细胞仪按大小测量和分类颗粒。
- 对大小分布进行统计分析和颗粒种群建模。
主要结果
- 基于大小识别出两种不同的颗粒种群。
- 小颗粒平均248微米，而大颗粒平均319微米。
- 大小分布不是正态分布，表明存在显著的异质性。
- 显微镜分析确认了分类颗粒的不同大小。
结论
- 开发的方法可以有效地按大小对菌丝体颗粒进行分类。
- 进一步的分析可以阐明大小异质性背后的机制。
- 这种方法可以适用于其他丝状生物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
