生物层干涉测量的蛋白质 - 蛋白质相互作用和变构配体反应动力学的影响

以下实验的总体目标是使用生物膜干涉测量法 （BLI） 测量蛋白质动力学、蛋白质相互作用和小配体对这些相互作用的变构效应。这是通过用特异性生物素制备一种蛋白质并将其固定在链球菌表面来实现的。埃顿并联涂覆生物传感器。

作为第二步，将传感器结合的蛋白质暴露于含有其结合伴侣的缓冲液中，并通过其对传感器表面光干涉的影响实时测量结合。接下来，将每个传感器转移到没有结合伴侣的缓冲液中，以测量蛋白质的实时解离。蛋白质复合物。

获得的结果允许确定相互作用蛋白质结合和解离的动力学速率常数，从而确定它们的结合亲和力。进一步的结果表明，BLI 可以检测小配体对蛋白质复合物解离速率的影响。与现有方法（如表面等离子体共振）相比，该技术的主要优点是 BLI 对折射率变化不太敏感。

因此，结合和结合步骤可以包括小配体的变化，以实时测试它们对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，不过，这种方法可以提供对蛋白质-蛋白质相互作用动力学的见解。它也可以应用于不同的组合，例如蛋白质与固定化 DNA 或 RNA 的结合或脂质体与固定化蛋白质的结合。通过按照文本协议中的说明设置 BLI 仪器来开始此实验。

然后在数据采集软件中设置实验设计。在 experiment wizard （实验向导） 选项卡中选择 New kinetics experiment （新建动力学实验）。这将显示一个选项卡式菜单，其中包含必须在选项卡 1 上定义的所有步骤。

定义要使用的列。在 96 孔样品板上。分配包含缓冲液、要固定的蛋白质或结合伴侣的色谱柱。

对于每个关联，请输入要使用的结合伴侣的浓度。在选项卡 2 上，定义分析所需的所有步骤。这些包括基线负荷关联和结合伴侣的解离。

通过选择检测步骤，然后双击相应的色谱柱，将各个检测步骤与样品板上的孔列相关联。这将对传感器进行编程，使其从一列孔移动到下一列孔。在检测过程中，从与第一列孔与检测缓冲液相连的简短基线步骤开始，以在 96 孔板中建立初始 BLI 信号。

然后将加载步骤连接到将包含生物素化蛋白质的孔。使用 threshold 函数实现预先确定的绑定级别。设置阈值选项，以便所有传感器都将移动到下一列井。

当任何一个传感器达到阈值时，在缓冲液中加入另一个基线步骤，以洗去传感器中未固定的生物素化蛋白质，并为基本测定建立新的稳定基线信号，以确定全局结合和解离速率常数，包括一个额外的基线步骤，传感器在关联前在新的缓冲孔列中。下一步，链接关联。步入包含不同浓度结合伴侣的孔列。

调整步长时间，使结合伴侣的至少饱和浓度应达到平衡结合信号。对于解离步骤，指定传感器返回到第 4 列，与关联前用于额外基线的缓冲液孔相同。如果速率比预期的慢或快，则可以在实验期间调整关联和解离步骤的时间。

在选项卡 3 上，指示传感器托盘中将包含用于分析的预润湿传感器的位置。选项卡 4 允许对程序进行图形审查。在选项卡 5 上，输入必要的详细信息，包括数据文件的位置和所需的温度。

对于实验。将链霉亲和素包被的传感器预润湿至少 10 分钟。要去除其保护性蔗糖涂层，请从传感器托盘中取出包含支架的传感器，然后将 96 孔板插入托盘底部，将板的一角滑入托盘上的定向槽口。

对于要使用的传感器柱，每孔添加 200 μL 检测缓冲液。在 96 孔板的该列中，按照分配的正确方向将传感器架放回托盘 在编程过程中，用检测缓冲液或适当的蛋白质稀释液填充样品板的孔。避免引入气泡，因为它们会在光信号中引起噪声。

包括一个或多个省略生物素化蛋白或结合伴侣的参比孔。打开仪器的门，注意传感器臂的光输出。将传感器托盘插入载物台，并将托盘卡舌插入载物台的插槽中。

将样品板插入板架中。确保板平放且方向正确，如板架上所示。关上门并从数据采集程序开始检测。

如果传感器仍需要预润湿，请选择延迟开始实验的选项。最后，一旦所有样品制备完成并且样品板和传感器托盘都加载到仪器中，单击"开始"按钮运行分析。运行检测后，打开数据分析软件并加载包含数据的文件夹。

单击处理选项卡，查看逐步处理菜单和原始动力学数据，其中每个传感器在数据选择下分配了不同的颜色。单击样品板图上的传感器选择按钮。将一个或两个控制传感器的孔指定为处理菜单上的参考孔。

选中减法框并选择参比井，以从其他传感器信号中减去参比信号。使用 align y axis 步骤将所有迹线对齐到 Y 等于零。然后选择 baseline 作为时间范围的对齐步骤。

输入该基准的最后 10 秒。在该基线步骤中单击将显示对齐方式。接下来，选中 inter step correction 框，以最大限度地减少关联和解离步骤之间的信号偏移。

选择要基线或分离的线。大多数情况下选择 KY gole 过滤功能，然后单击 process data 继续在右下方面板目视检查最终的流程数据。要分析数据，请单击 数据分析 中的 analysis 选项卡，对于 step to analyze，选择 association and dissociation。

对于 model（模型），选择 1 对 1 进行拟合 Choose global（选择全局）。对于按选择颜色分组，选择 r max unlinked by sensor，以允许在伴侣与固定化蛋白质饱和结合时独立拟合最大信号响应。最后，点击拟合曲线开始非线性回归分析。

检查拟合结果，其中包括回归曲线与传感器数据轨迹的叠加、拟合残差图以及包含已确定参数值和统计数据的表格。实时结合和解离 BLI 动力学如下所示。该实验以 10 分钟的基线步骤开始，因为传感器已经预先湿润，然后短暂地将生物素化的 ε 加载到传感器上。

从参考曲线中可以看到，在其余所有步骤中均未发生可检测的 ε解离，参比曲线未添加结合伴侣。第二个参考传感器没有动员的蛋白质，并且显示结合伴侣的非特异性结合较低。在传感器 A 到 F 的缔合步骤中使用了不同浓度的 F1 减去 ε，以便全局拟合结果并获得缔合速率常数与缔合速率常数的最佳值，并处理平衡解离常数 KD 结果，产生蓝色数据迹线。

在这种情况下，从样品迹线中减去参比传感器迹线，以校正结合伴侣的非特异性结合和系统信号漂移。在数据分析步骤中，所有曲线都使用一对一、一对一的模型进行全局拟合。全局拟合假设结合伴侣完全解离。

这里显示了一个不同的实验，其中酶在一毫摩尔 A-T-P-A-D-T-A 存在下与传感器固定的 ε 结合。这使得大多数 F1 ε 复合物倾向于假设非抑制性确认，即很容易解离，然后将传感器移动到含有具有不同配体的测定缓冲液的解离孔中。这证明了不同配体对 ε 确认的影响。

例如，暴露于镁 A GP 和磷酸盐显着减慢了净解离，表明 ε 将确认转移到紧密结合的抑制状态。首次设置 BLI 检测时，重要的是要包括对照品，以测试蛋白质与传感器的非特异性结合，以及非特异性结合是否随要使用的蛋白质浓度而显着变化。观看此视频后，您应该对如何设计、编程和分析用于测量蛋白质蛋白质相互作用动力学的 BLI 检测有很好的了解，并对此有所了解。

BLI 允许直接测试小配体对蛋白质相互作用的影响。