Name: 生物层干涉测量的蛋白质 - 蛋白质相互作用和变构配体反应动力学的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 57 s
Description: 学习使用生物层干涉测量技术实时检测蛋白质-蛋白质相互作用的动力学过程，以F型ATP合酶及其ε亚基为研究对象。该方法可精确测定结合与解离速率常数，并评估小分子配体的变构效应，为代谢调控机制研究提供重要工具。

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感谢 FortéBio 提供了用于图1的图示。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM083088 支持，项目负责人为 T.M.D。

1. BLI 检测仪器的编程设置
至少提前一小时打开仪器，使光源充分预热；这是为了在实验过程中尽量减少光学信号的噪声和漂移。通过仪器选项卡设置所需的温度，以对样品板架进行预热。然后在数据采集软件中设置实验方案。在实验向导选项卡中选择“新建动力学实验”，系统将显示一个分步选项卡菜单，需依次完成各项参数的设定。
1.1. 培养板定义
定义96孔样品板上要使用的列。指定各列用于盛装缓冲液、固定化蛋白或结合配体。对于每个结合反应孔，输入将要使用的结合配体浓度。注意：图2 所示的板型定义包含不同检测的选项。
1.2. 检测方法定义
定义实验所需的全部步骤，包括：(i) 基线（多个）、(ii) 加样、(iii) 结合配体的结合以及 (iv) 解离。随后，如下所述，通过选择实验步骤并双击样品板上相应的列，将各个实验步骤与板上的列关联起来。此操作将设定传感器在实验过程中从一个孔列移动到下一个孔列。
<ol>
	<li>基线 
		以简短的基线步骤（≥60 秒）开始，将传感器置于检测缓冲液中（图 2，第 1 列），以在 96 孔板中建立初始 BLI 信号。</li>
	<li>加载（将生物素化蛋白固定在传感器上） 
		将传感器分配至含有生物素化蛋白的孔中（图 2，第 2 列）。使用阈值功能以达到预定的结合水平（见引言部分）。设置阈值选项，使得当任意一个传感器达到阈值时，所有传感器将被移至下一列孔中。</li>
	<li>基线 
		在缓冲液中进行另一次基线步骤（图 2，第 3 列；通常 &#62;5 分钟），以洗去未固定的生物素化蛋白，并建立新的稳定基线信号。仅针对基本的结合/解离检测（如 图 3 所示），在关联步骤之前，需额外增加一个基线步骤（60 秒），将传感器置于新的缓冲液孔中（图 2，第 4 列）。</li>
	<li>关联（结合伙伴与固定化蛋白的结合） 
		对于基本的结合/解离检测（如 图 3 所示），选择一系列不同浓度的结合伙伴，用于不同的传感器/孔（图 2，第 5 列）。调整步骤时间，使结合伙伴的浓度至少接近饱和，以达到平衡结合信号。对于检测小分子配体对蛋白-蛋白复合物解离的变构效应的检测（如 图 5 所示），选择单一高浓度的结合伙伴（~约为估计 KD 值的 10 倍），用于所有关联孔中。</li>
	<li>解离 （结合伙伴的解离） 
		仅针对基本的结合/解离检测（如 图 3 所示），指定传感器返回至第 4 列（图 2），即与关联前额外基线步骤所用相同的缓冲液孔。对于检测小分子配体变构效应的检测，则应指定传感器移至第 6 列（图 2），其中每个孔可含有缓冲液及不同的变构配体。</li>
</ol>
1.3. 传感器分配
标明传感器板中将放置预湿润传感器的位置。请识别任何空置位置，因为如果未拾取到传感器，实验将失败。
1.4. 查看实验
查看所有计划步骤以检查错误，并返回进行修正。
1.5. 运行实验
输入必要的详细信息，包括数据文件的存储位置。输入实验所需的温度。如果传感器仍需要预润湿，请选择延迟开始实验的选项。最后，当所有样品准备完成（步骤2）且样品板和传感器托盘均已装入仪器后，单击“Go”按钮以运行检测。
2. 样品制备
<ol>
	<li>配制合适的测定缓冲液。本实验所示结果所用的缓冲液为 图3 和 5：20 mM MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸），Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）（用于调节pH至8.0），50 mM KCl。在所有检测步骤以及生物素化蛋白或结合伴侣的稀释过程中，缓冲液中均需添加BSA（牛血清白蛋白，无脂肪酸，终浓度0.5 mg/ml），以最大限度减少蛋白质与传感器的非特异性结合。</li>
	<li>将生物素标记的蛋白质（ε）用检测缓冲液稀释至适当浓度（参见引言部分）。</li>
	<li>制备结合伴侣（F）的稀释液1(-ε) 溶于检测缓冲液中（关于使用浓度范围，请参见讨论部分）。</li>
	<li>预先用缓冲液润洗链霉亲和素包被的传感器至少10分钟，以去除其保护性蔗糖涂层。将装有传感器的支架从传感器托盘中取出，并在托盘底部放入一块96孔板，将板的一个角滑入托盘上的定位凹槽中。对于将要使用的传感器列，在96孔板对应列的每个孔中加入200 μl检测缓冲液。将传感器支架按正确方向（标签插入卡槽）放回托盘中。</li>
	<li>如步骤1编程时所设定，向样品板的孔中加入检测缓冲液或相应的蛋白质稀释液，如 图2避免引入气泡，因为气泡可能导致光信号噪声。设置一个或多个参考孔，分别省略（i）生物素标记的蛋白或（ii）结合伴侣。</li>
	<li>打开仪器门，将传感器托盘插入载物台（左侧），使托盘的卡舌插入载物台的插槽中。将样本板插入板架（右侧），确保板子平整放置且方向正确，方向指示标示在板架上。关闭门，然后从数据采集程序（步骤1.5）启动检测。</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>检测完成后，打开数据分析软件并加载包含数据的文件夹。点击“Processing”选项卡，查看分步处理菜单（位于左侧）以及原始动力学数据，每个传感器（A-H）以不同颜色显示（参见 图3).</li>
	<li>在“数据选择”下，点击“传感器选择”按钮。在“样品板图”中，指定1或2个对照传感器的孔位（G、H孔用于检测 图3) 作为参比孔。在“处理”菜单中，勾选“减法”选项，并选择“参比孔”，以从其他每个传感器的信号中减去参比信号（单个或平均值）。</li>
	<li>使用“对齐 Y 轴”步骤将所有曲线对齐至 Y=0。选择“基线”作为对齐步骤（即关联步骤前的最后一次基线）。在“时间范围”中，输入该基线的最后 10 秒即 60秒基线的50-60秒，如 图3).</li>
	<li>勾选“步骤间校正”框，以最小化缔合步骤与解离步骤之间的信号漂移。选择对齐至基线或解离步骤。</li>
	<li>大多数情况下选择Savitzky-Golay滤波函数，然后点击“Process Data!”继续。目视检查最终处理后的数据（右下方面板）。对于旨在进行全局数据分析的实验（如 图 4），如果信号轨迹在结合步骤与解离步骤之间显示出显著偏移，则应更改“步骤间校正”的解离或基线选择，并在进入数据分析之前重新处理数据。</li>
</ol>
4. 数据分析
点击“数据分析”中的“分析”选项卡以开始。注意：以下示例步骤适用于对多条结合/解离曲线进行全局分析（如图3所示）。
<ol>
	<li>在“分析步骤”中，选择“结合与解离”；在“模型”中，选择 1:1。注意：也可选择其他有限选项。</li>
	<li>在“拟合”中，选择“全局（完整）”；在“分组依据”中，选择“颜色（如图所示）”。勾选“Rmax 按传感器不关联”，以允许对 Rmax（配体与固定化蛋白饱和结合时的最大信号响应）进行独立拟合。注意：大多数实验中我们均采用此设置，因为不同传感器上固定蛋白的量略有差异（见图3，加载）。</li>
	<li>在显示的表格中，确保所有待分析的传感器曲线具有相同颜色，以便将其作为全局数据集进行分析。如有需要，可选择一个或多个传感器曲线排除在全局拟合之外：在“包含”列中，右键单击目标传感器位置，选择“排除孔位”。</li>
	<li>点击“拟合曲线！”以开始非线性回归分析。检查拟合结果，包括：(i) 回归曲线与传感器数据曲线的叠加图（如图4所示），(ii) 拟合残差图，以及 (iii) 包含确定参数值（速率常数、Rmax、KD）和统计信息（参数的标准误差、卡方值、R2）的表格。</li>
	<li>在“数据导出”中，点击“导出表格为 .csv 文件”以保存拟合结果。若需使用其他软件对数据或拟合曲线进行绘图或进一步分析，请点击“导出拟合结果”，将每个传感器的数据和拟合曲线保存为文本文件。</li>
</ol>

<ol><li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li>
<li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li>
<li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li>
<li>Duncan, T. M. The Enzymes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+TM+%22Energy+Coupling+and+Molecular+Motors+Vol%22">Energy Coupling and Molecular Motors Vol</a>. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).</li>
<li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+subunit+%CE%B5+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li>
<li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+%28F1%29+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li>
<li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+40+years%2C+new+medicine+for+combating+TB%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mycobacteriol%22%5BJournal%5D)">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li>
<li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-ATPase+of+Escherichia+coli%3A+The+%CF%B5-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis%2C+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state%2C+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li>
<li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor%3A+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li>
<li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li>
<li>Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific%2C+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li>
<li>Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDayne%2C+D+%22Fort%C3%A9Bio+newsletter+In+Interactions%22">FortéBio newsletter In Interactions</a>. 5, 8-9 (2012).</li>
<li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

目前可用的BLI仪器在生物分子相互作用检测中具有较高的通量和灵活性。将各种溶液样品分配至黑色微孔板的孔中，一组并行的BLI传感器按程序在板上的不同列孔之间往复移动。整个检测过程中，样品通过轨道振荡进行搅拌。本研究所采用的系统配备8个传感器，使用96孔样品板；而另一种系统则配备16个传感器，并使用384孔样品板。因此，可在多个传感器并行操作下，针对不同条件测试固定于传感器上的生物分子与其溶液中结合伴侣之间的相互作用。例如，在本文展示的首个实验中，针对固定化的抑制性ε亚基，同时平行测定了其与酶（结合伴侣）六种不同浓度下的相互作用图3 和 4）。这使得能够进行全局分析，以确定唯一的一组速率常数（ka，kd）用于净结合与解离，从而得到平衡解离常数（KD = kd/a），与抑制常数（KI由酶抑制溶液测定确定的 ε8. 另一种类型的实验（图5) 证明了BLI还可用于监测小分子配体对两个蛋白质之间相...

蛋白质-蛋白质相互作用对许多生物过程至关重要，无标记光学方法如表面等离子体共振（SPR）已被用于研究这些相互作用。 体外 研究结合与解离的动力学1大多数无标记方法将一种生物分子固定在传感器表面，并利用光学信号检测溶液中的结合伴侣分子与该固定化生物分子的结合。1虽然表面等离子体共振（SPR）是一种高灵敏度的方法，但由于流经传感器的溶液折射率发生变化，容易受到干扰。2尽管灵敏度不如表面等离子共振（SPR），但生物层干涉技术（BLI）受样品组成变化的影响较小。1,3. BLI 使用带有专有生物相容性涂层的光纤生物传感器，涂层位于传感器尖端。本实验所用系统（Octet-RED96）包含八个分光光度计。白光通过导管传输至由机械臂操控的一排探针。探针拾取光纤传感器并将其移至含有样品的96孔板中。目标分子之一被固定在生物传感器表面，随后传感器被移至含有溶液中结合伴侣的孔中。BLI 监测结合伴侣与固定分子的结合过程，之后再将传感器转移至不含结合伴侣的溶液中，监测其解离过程。分子与生物传感器表面的结合会导致光波在传感器内部表面以及传感器与溶液的外部界面反射后产生光学干涉的变化。这些干涉变化可被量化，并用于确定结合与解离的动力学速率，如动画所示。 图1.
我们已应用生物膜层干涉技术（BLI）来测量细菌ATP合酶催化复合物与其ε亚基之间的相互作用，其中ε亚基可对酶产生自抑制作用。ATP合酶是一种嵌入膜内的旋转式纳米马达，可催化ATP4的合成与水解。&#160;该催化复合物（F1）可被分离为可溶性形式，并发挥ATP酶功能。ε亚基包含两个结构域：其N端结构域（NTD）对酶的正确组装及功能耦合至关重要，但不直接与催化亚基相互作用；而C端结构域（CTD）可通过与多个催化亚基相互作用来抑制酶活性5,6。这种由ε介导的调控机制特异存在于细菌ATP合酶中，在线粒体同源物中未见类似现象。ATP合酶已被确认为抗菌药物的潜在靶点，例如近期美国食品药品监督管理局（FDA）已批准贝达喹啉用于治疗耐药性结核病7。因此，针对ε亚基的抑制功能进行药物研发，可能获得不抑制线粒体ATP合酶的新型抗菌剂。在分离的催化复合物（F1）中，ε亚基表现为可解离的亚基。然而，当ε结合于F1后，其CTD可发生显著的构象变化，部分插入酶的中央腔，形成一种难以直接解离的抑制状态6,8。我们利用BLI测量F1与ε结合及解离的动力学过程，并间接研究催化位点配体对ε构象的变构效应。
在我们的系统中，ε亚基被选择用于固定在传感器表面，因为BLI信号（类似于SPR）对结合到表面的分子质量敏感。ε亚基相对于主要的F复合物而言较小（约15 kDa）1 复合物（约 347 kDa）。因此，F 结合将产生更大的 BLI 信号1 固定化的ε。为了监测F1 解离过程可能非常缓慢，因此必须将 ε 强力固定。因此，我们选择对 ε 进行生物素标记&#160;并将其固定在链霉亲和素包被的生物传感器上。&#160;蛋白质可通过（i）对表面赖氨酸进行随机修饰而实现生物素化9，(ii) 利用生物素-马来酰亚胺试剂与一个独特的天然或工程化半胱氨酸发生反应10 或 (iii) 基因添加一段特异的生物素受体肽，该肽在表达过程中可被酶促生物素化 体内 标记蛋白的表达11在我们的系统中，ε 采用方法 (iii) 进行生物素标记。8将生物素标记的ε固定在链霉亲和素传感器上后，BLI可检测F的结合与解离1 亚基ε被耗竭的1(-ε))。在本研究所描述的实验中，已通过预实验确定了可合理固定在传感器上的生物素化蛋白用量。该用量可能因蛋白及其结合伴侣的分子量不同而有所变化，但其目标是确定能够提供以下条件的最低固定化蛋白量：(i) 在结合伴侣浓度较低（低于KD）以及（ii）在结合伙伴接近饱和浓度时，结合动力学的畸变最小。此外，生物素化化学计量可能有所不同（但应避免 &#62;1 mol 生物素/每摩尔蛋白），因此每批新制备的生物素化蛋白可能需要进行初步检测，以确认在链霉亲和素包被的传感器上固定化时能够获得稳定的BLI信号。

<table><tbody><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td>无脂肪酸</td></tr><tr><td>生物传感器/链霉亲和素</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5019</td><td>96个传感器托盘</td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td>黑色，聚丙烯材质</td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>版本 6.4</td><td>有更新版本可供使用</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Pall/Fort&amp;eacute;Bio</td><td>版本 6.4</td><td>有更新版本可供使用</td></tr></tbody></table>

生物层干涉技术用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学及变构配体效应

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

我们描述了使用生物层干涉技术研究亚基ε与催化复合物之间抑制性相互作用的方法。 大肠杆菌&#160;ATP合酶。细菌F型ATP合酶 是新型经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的抗生素的靶点，该抗生素用于治疗耐药性结核病。了解细菌ATP合酶亚基C末端结构域对自身活性的特异性自抑制机制 ε&#160;可为抗菌药物的发现提供一种靶向该酶的新途径。该酶的C末端结构域 ε 在酶在活性状态与非活性状态之间转换时，ε会发生显著的构象变化，而催化位点的配体可以影响ε哪种构象占主导地位。该检测方法可测量ε与催化复合物结合/解离的动力学过程，并间接反映酶结合状态下构象的转变 ε 从看似不可解离的抑制构象之间的转换。生物层干涉信号对溶液组成不甚敏感，因此也可用于监测催化位点配体对ε构象变化的变构效应。

实时结合与解离的BLI动力学结果如图3所示。本实验在结合和解离阶段均使用了测定缓冲液。由于传感器仅短暂预湿，实验开始时设置了10分钟的基线步骤。随后，将生物素化的ε亚基加载到传感器上。在整个后续步骤中，ε均未发生可检测到的解离，这一点可通过未添加结合伴侣的参考曲线（G）看出。第二个参考传感器（H）未固定蛋白，显示结合伴侣的非特异性结合水平较低。在结合阶段，对传感器A-F使用了不同浓度的F1(-ε)，以便对结果进行全局拟合，从而获得最优的ka、kd和KD值。数据按照实验方案进行处理，得到图4中的数据轨迹（蓝色）。在此情况下，通过从样品轨迹中减去参考传感器H的信号，以校正结合伴侣的非特异性结合及系统信号漂移。在数据分析步骤中，所有曲线均采用1:1模型（单一ka，单一kd）进行全局拟合；“全局（完整）”拟合假设结合伴侣完全解离（信号在无限时间后将回到零）（图4，红色）。需要注意的是，对于F1...

本文所述方案介绍了利用生物膜干涉技术（Bio-layer Interferometry）进行蛋白质-蛋白质相互作用的动力学分析。F型ATP合酶参与细胞能量代谢，在细菌中可被其ε亚基抑制。我们已采用生物膜干涉技术研究催化复合体与ε亚基抑制性C末端结构域之间的相互作用。

我们描述了使用生物层干涉技术研究亚基ε与大肠杆菌催化复合物之间的抑制性相互作用。

以下实验的总体目标是利用生物膜干涉技术（BLI）来测定蛋白质的动力学、蛋白质相互作用以及小分子配体对这些相互作用的变构效应。该目标通过将其中一种蛋白质进行特异性生物素标记，并将其平行固定在链霉亲和素包被的生物传感器表面来实现。第二步，将与传感器结合的蛋白质暴露于含有其结合伴侣的缓冲液中，并通过检测传感器表面光学干涉信号的实时变化来监测结合过程。随后，将每个传感器转移至不含结合伴侣的缓冲液中，以实时测量蛋白质的解离过程。蛋白质复合物。所获得的结果可用于确定相互作用蛋白质结合与解离的动力学速率常数，从而推算其结合亲和力。进一步的结果表明，生物膜干涉技术（BLI）能够检测小分子配体对蛋白质-蛋白质复合物解离速率的影响。与表面等离子共振等现有方法相比，该技术的主要优势在于对折射率变化不敏感。因此，结合与关联步骤可引入小分子配体的变化，以实时检测其对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。尽管如此，该方法仍可提供有关蛋白质-蛋白质相互作用动力学的信息。该方法还可应用于多种组合，例如蛋白质与固定化DNA或RNA的结合，或脂质体与固定化蛋白质的结合。开始本实验时，需按照文本方案中所述设置BLI仪器。然后在数据采集软件中设置实验方案。在实验向导选项卡中选择新建动力学实验。这将显示一个分步菜单，在第一个选项卡中定义所有必需的步骤。定义要使用的列。在96孔样品板上，指定各列用于盛装缓冲液、待固定化的蛋白质或结合伴侣。对于每个结合反应，需输入所用结合配体的浓度。在第二个选项卡中，定义实验所需的所有步骤，包括基线加载、结合配体的结合和解离阶段。通过选择检测步骤，然后双击样品板上相应的列，可将各个检测步骤与板上的列孔关联起来。此操作可编程传感器从一个孔列移动到下一个孔列。在检测过程中，首先从与第一列孔连接的短暂基线步骤开始，使用检测缓冲液以在96孔板中建立初始BLI信号。然后将上样步骤连接至含有生物素化蛋白的孔。使用阈值功能以达到预定的结合水平。设置阈值选项，使所有传感器均移至下一列孔中。当任意一个传感器达到阈值时，在缓冲液中增加一个额外的基线步骤，以洗去传感器上未固定的生物素化蛋白，并建立新的稳定基线信号。对于基础检测，为确定全局结合与解离速率常数，应在结合步骤之前，使用新一列缓冲液孔中的传感器增加一个额外的基线步骤。接下来，将结合步骤连接至含有不同浓度结合配体的孔板列中。调整步骤时间，以确保结合配体至少达到饱和浓度并实现平衡结合信号。对于解离步骤，设定传感器返回到第四列，即在结合前用于额外基线测定的相同缓冲液孔。如果结合和解离速率比预期更快或更慢，可在实验过程中调整结合和解离步骤的时间。在第三个选项卡中，标明传感器托盘中将放置预润湿传感器的位点。第四个选项卡可对程序进行图形化审查。在第五个选项卡中，输入必要的详细信息，包括数据文件的存储位置和所需的温度。进行实验时，需预先将链霉亲和素包被的传感器用溶液润湿至少10分钟，以去除其保护性的蔗糖包被。将装有传感器的架子从传感器托盘中取出，并在托盘底部插入一块96孔板，将板的一个角滑入托盘上的定位凹槽中。对于要使用的传感器列，每孔加入 200 微升检测缓冲液。将 96 孔板中该列传感器架按编程时指定的正确方向放回托盘中，同时在样品板的孔中加入检测缓冲液或相应的蛋白质稀释液。避免产生气泡，因为气泡可能导致光信号噪声。设置一个或多个对照孔，分别省略生物素化蛋白或结合伴侣。打开仪器门，观察传感器臂的光输出。将传感器托盘的卡舌插入载物台的槽口中，将托盘放置到载物台上。将样本板插入板架中，确保板子平整放置，并按照板架上所示的方向正确对齐。关闭门，然后从数据采集程序中启动检测。如果传感器仍需要预先润湿，请选择延迟开始实验的选项。最后，当所有样品制备完成，并且样品板和传感器托盘均已装入仪器后，点击“开始”按钮以运行检测。检测完成后，打开数据分析软件并加载包含数据的文件夹。单击处理选项卡，查看分步处理菜单以及原始动力学数据，在数据选择下每个传感器以不同颜色表示。在样品板图上单击传感器选择按钮。在处理菜单中将一个或两个对照传感器的孔指定为参考孔。勾选减法框，并选择参考孔以从其他所有传感器信号中减去参考信号。使用“Y轴对齐”步骤将所有曲线对齐至Y等于零。然后选择基线作为时间范围的对齐步骤。输入该基线的最后10秒。单击基线步骤内的区域将显示对齐情况。接下来，勾选“步间校正”复选框，以最小化结合步骤与解离步骤之间的信号漂移。选择一条曲线进行基线校正或解离分析。大多数情况下选择KY去滤功能，点击“处理数据”以在右下面板中目视检查最终处理后的数据。要分析数据，请点击数据分析中的“分析”选项卡以进入分析步骤，选择关联和解离分析。在模型中，选择“一对一”进行拟合，并选择“全局拟合”。在分组方式中选择“颜色”，并选择“Rmax不链接至传感器”，以允许在配体与固定化蛋白达到饱和结合时，对最大信号响应进行独立拟合。最后，点击“拟合曲线”以开始非线性回归分析。检查拟合结果，其中包括回归曲线与传感器数据轨迹的叠加图、拟合残差图以及包含确定参数值和统计信息的表格。此处显示的是实时结合与解离的BLI动力学结果。本实验首先进行了10分钟的基线步骤，由于传感器仅经过短暂预湿，随后将生物素化的epsilon加载到传感器上。在整个后续所有步骤中，如参考曲线所示（该曲线未添加结合伴侣），ε亚基均未发生可检测到的解离。第二个参考传感器未固定可移动蛋白，显示结合伴侣的非特异性结合水平较低。在A至F传感器的结合步骤中，使用了不同浓度的F1缺失ε亚基，以便对结果进行全局拟合，获得最佳的结合速率常数（association rate constant）和平衡解离常数（KD）。结果经处理后得到蓝色数据轨迹。在此情况下，通过从样品信号中减去参照传感器信号，以校正结合伙伴的非特异性结合以及系统信号漂移。在数据分析步骤中，所有曲线均采用一对一模型进行全局拟合。该全局拟合假设结合伙伴完全解离。此处展示了另一个实验，其中酶结合了固定在传感器上的ε亚基，并存在于一毫摩尔的A-T-P-A-D-T-A条件下。这使得大多数F1-ε复合物倾向于形成非抑制性构象，该构象可轻易解离。随后将传感器转移至含有不同配体的解离孔中，以检测不同配体对ε亚基构象的影响。例如，暴露于镁离子、A GP 和磷酸盐会显著减缓净解离速率，表明 epsilon 转变为紧密结合的抑制状态。首次建立 BLI 检测时，重要的是要包括对照实验，以检测蛋白质与传感器之间是否存在非特异性结合，并评估在将要使用的蛋白质浓度下，非特异性结合是否发生显著变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计、运行和分析用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学的 BLI 检测，并对此有更深入的认识。BLI 可用于直接检测小分子配体对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。

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学习使用生物层干涉测量技术实时检测蛋白质-蛋白质相互作用的动力学过程，以F型ATP合酶及其ε亚基为研究对象。该方法可精确测定结合与解离速率常数，并评估小分子配体的变构效应，为代谢调控机制研究提供重要工具。

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