Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Het algemene doel van deze procedure is het profileren van genexpressieniveaus van individuele menselijke embryonale stamcellen met behulp van single cell kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie, of RT-PCR. Dit wordt bereikt door eerst fluorescente geactiveerde cel sortering (FACS) te gebruiken om individuele cellen in elke put van een 96-wells plaat met cellysebuffer te sorteren. De tweede stap is het reverse transcriberen van RNA om cDNA te genereren uit single cell lysaten.

Vervolgens wordt het cDNA geamplificeerd via de polymerasekettingreactie. De laatste stap is het uitvoeren van kwantitatieve RT-PCR op het geamplificeerde cDNA. Uiteindelijk is deze assay nuttig voor het bestuderen van genexpressie in heterogene populaties, zoals menselijke embryonale stamcellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande kwantitatieve kunstmatige vaten op enkelcelniveau is dat deze methode, EEG en robuuster zijn voorafgaand aan de faxzuivering. De OCT vier EGFP menselijke embryonale stamcellen of Hess worden losgemaakt van de schaal van 60 millimeter. Verwijder al het medium, voeg 1 mL Accutane toe en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten.

Neutraliseer Accutane met 1 mL menselijk ES-medium, centrifugeer om de cellen te pelletteren en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in FACS-buffer en stel de concentratie in op 1 × 10⁶ cellen per mL. Haal het celmonster vervolgens door een 35 µm celzeef in een buisje. Bewaar het buisje op ijs voorafgaand aan de celsortering.

Begin deze procedure met het bereiden van een mastermix bestaande uit 1 µL single cell D Ns one en 9 µL single cell lysis solution. Breng voor elke well 10 µL van de mix-oplossing over naar elke well van een 96-wells PCR-plaat. Programmeer de cel sorter voor FACS-analyse om enkelvoudige EGFP-positieve cellen in de wells van de 96-wells PCR-plaat te sorteren. Incubeer de monsters na het celsorteren gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur voor cellyse. Voeg ter stopzetting van de lysereactie 1 µL stop solution toe en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Om deze procedure te starten, voegt u eerst aan elke put van de 96-wells plaat 0,5 µL Eloqua van 20 µM SMAT 15 en SMAA-primers toe. Verhit de monsters gedurende vijf minuten bij 80 °C. Voeg vervolgens vier µL 5x buffer, twee µL DTT, één µL reverse transcriptase en één µL dNTPs toe.

Voer in elke put omgekeerde transcriptie uit in een thermocycler. Stel het thermische programma in op 42 °C gedurende 90 minuten, gevolgd door 85 °C gedurende vijf minuten. Om de reverse transcriptase te inactiveren wanneer de omgekeerde transcriptie is voltooid, voegt u vier µL exo-reagens toe aan elk cDNA-monster en incubeert u dit bij 37 °C gedurende 15 minuten om overtollige oligonucleotiden te verteren, gevolgd door 80 °C gedurende 15 minuten.

Om het exo-reagens te inactiveren, bereidt u de PCR-reactiemix met twee nano molar van de SMAP twee primer. Voeg 10 microliters van de PCR-reactiemix toe aan elk reverse-getranscribeerd monster.

Voer de amplificatie uit bestaande uit 20 cycli van denaturatie, annealing en extensie. Na de amplificatie van de monsters werden twee sets kwantitatieve R-T-P-C-R-reacties uitgevoerd in afzonderlijke platen om de R-T-P-C-R-resultaten te bevestigen. Voeg aan elke put van de twee 96-puts platen 10 µL van twee x Sybr Green PCR-mastermix, 1 µL geamplificeerd cDNA, twee primers en 7 µL water toe. Stel het programma in op 95 °C gedurende 3 seconden, gevolgd door 60 °C gedurende 30 seconden.

Gedurende 40 cycli is een annealing-stap verwijderd om de primerfout te verminderen. In deze studie werden microgramhoeveelheden totaal RNA van Hess verdund tot nano- en picogramniveaus om de technische variabiliteit en de detectie van verschillen bij lage hoeveelheden totaal RNA te beoordelen. Kwantitatieve RT-PCR van het GAPDH-gen werd uitgevoerd met mRNA van samengevoegde hulsjes, seriële verdund van 10 ng/µL naar 0,1 pg/µL. Elk punt geeft de CT-waarde weer van seriële verdunde mRNA en single-cell mRNA gesorteerd via FACS.

Er werd een correlatie waargenomen tussen elk monster en de QR TPCR-resultaten, waarbij verschillende individuele cellen vergelijkbare CT-waarden vertoonden. Fax werd gebruikt om sterk EGFP-positieve cellen te sorteren en te selecteren uit een OCT four EGFP-reporter HESC-lijn. De resultaten tonen een EGFP-positieve populatie van ongeveer 60% vergeleken met de negatieve populatie om de consistentie tussen verschillende batches van reverse transcriptie- en amplificatiereacties te valideren.

Fax-gezuiverde lysaten van enkelvoudige cellen werden in tweeën gesplitst en het protocol werd op elk deel toegepast voor batchvergelijkingen. Er werd een significante correlatie waargenomen tussen de OCT four CT-waarde van elk deel van de lysaten van enkelvoudige cellen. Een heat map-presentatie van de genexpressie in enkelvoudige cellen laat een consistent en robuust niveau van OCT four-expressie zien, maar variërende niveaus van een ander stamcelmarkergen, NAN og; samen tonen onze resultaten aan dat deze assay voor genexpressie in enkelvoudige cellen nuttig is voor het bestuderen van populatieheterogeniteiten van pluripotente stamcellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de QITP voor het transcriptoom van een enkele cel correct uitvoert.