监控功能和血管形态由快速增长的肿瘤产生细胞分泌的因素招募

以下实验的总体目标是使用超声和内窥镜来说明癌细胞分泌的一组因子的血管生成潜力。这是通过首先植入一个塞子，在没有肿瘤细胞的情况下在小鼠中产生类似肿瘤的环境来实现的。接下来，评估血管密度和塞子内功能性血管的百分比。

在最后一步中，将血管的形态可视化。最终，细胞分泌的促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡及其对血管生成的影响可以通过两种互补的成像方式在不同时间点进行内部、重要和不同的时间点评估。与常规基质胶塞测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许分析细胞分泌的因子库，同时利用互补的活体成像方式。

演示这个程序将是她运行的 F Andra 我实验室的博士生 要使用超声评估细胞外基质或 ECM 模拟凝胶栓血管化，首先将一个 1.5 毫升的 einor 管放入冰上，其中包含 80 微升新鲜制备的调节培养基。该过程最棘手的部分是使用冰冷的尖端注射没有气泡的凝胶。温和混合和缓慢注射将确保最佳凝胶给药。

然后使用冰冷的 1000 微升吸头将 600 微升冰冷的 4 摄氏度混合过夜。解冻的 ECM 模拟凝胶进入培养基中，注意不要形成气泡。通过脚趾捏确认镇静后，剃掉每只小鼠的腹部，并使用配备 27 号针头的冰冷的 1 毫升注射器缓慢皮下注射。

每只动物注射一根 EEND DPH 管的内容物。给药整个体积后，将针头固定几分钟，直到凝固。三周后，再次剃掉小鼠的腹部区域，用脱毛膏去除多余的毛发，然后将小鼠固定在微型纵器的舞台上仰卧位。

接下来，将盐水填充一个装有 30 号针头的 1 毫升注射器。然后将针头放入尾静脉内。牢固固定针头并松开注射器。

现在将换能器放在所需扫描区域的中间，然后单击 3D 以初始化 3D 电机平台。单击 3D。再次输入扫描距离和步长，然后按 Scan 扫描。

确认在显示的 3D 图像数据中扫描了整个插头。如果没有，请调整换能器，使整个插头可见，然后再次扫描该区域，就像刚才演示的那样。接下来选择对比度并调整时间增益补偿或 tgc 控制以使图像变暗，使用样品瓶混合器激活微气泡 45 秒。

然后在 1 毫升注射器中将 50 微升微泡与 50 微升生理盐水混合。用含有活化微泡的注射器替换含有盐水的松动注射器，并将稀释的微泡注射到每只小鼠的尾静脉中。等待几秒钟，让气泡达到稳定状态，然后单击 3D 并选择扫描以获取 3D。

对比增强图像。单击 看到商店 以保存图像数据，然后选择 3D 并销毁 3D。要销毁微气泡，请再次单击 3D 并选择 scan 以获取销毁后 cena 循环。

然后再次单击 seen a store。接下来，在参考文献设置中，单击 create reference（创建参考文献），然后选择 Study management（研究管理）。打开 pre destruction cena 循环。

现在单击 process cena 以生成绿色对比度叠加。然后在超声成像软件中选择 load into 3D。接下来，单击 mode settings（模式设置），单击 volume（音量），然后选择 parallel（并行）。

然后分割一系列轮廓以创建目标组织的 3D 体积，然后单击 Finish 完成分割。为了使用纤维共聚焦内窥镜评估 ECM 模拟凝胶塞血管形态，注射 200 微升每毫升 10 毫克，将 C 标记的葡聚糖放入每只实验动物的尾静脉中。然后在距离塞子约 1 厘米处切开一个小切口，将内窥镜探针轻轻放在塞子顶部，同时保持塞子完好无损。

探头就位后，使用脚踏板按下启动激光器。一旦荧光出现在屏幕上，用脚踏板按下选择键以在电影之间获取长达 32 的短电影，在装有水的试管中清洗探针尖端。拍摄完成后，用棉签清洁尖端以分析平均血管直径。

接下来，单击 detect micro vessels 以打开容器检测模块窗口，然后单击 preferences。确保 mean vessel diameter 在感兴趣的统计数据中。标记显示模式下的窗口和显示直方图条。

单击 detect 以显示选定的测量值。为了分析血管附近区域的荧光信号强度，请选择创建圆圈 ROI 并在感兴趣区域中创建一个圆圈。最后，选择 Compute histogram within ROI 以计算与圆圈区域相关的值。

在这里，微泡对比增强超声成像揭示了 U 87 mg 条件性中等负荷栓子内功能性血管的广泛募集。相反，在含有来自休眠肿瘤生成细胞的条件培养基的栓子中，血流几乎无法检测到。如这些代表性图像所示，在 fit c 葡聚糖给药后血管的纤维共聚焦内窥镜进一步强调了这些新形成的血管的形态，请注意载有 U 87 mg 条件培养基的塞子内的血管如何表现出典型的渗漏钝端扩大的血管形态。

扩大和高度缠结的血管也表现出不连续和缓慢的流动，并且在周围区域观察到血液泄漏，血管外部明显的高荧光信号也证明了这一点。一旦掌握，这项技术可以在几个时间点在几个小时内完成，以优化血管生成动力学。