Name: 监控功能和血管形态由快速增长的肿瘤产生细胞分泌的因素招募 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解利用超声和显微内窥镜评估肿瘤细胞分泌因子的血管生成潜能。该方法通过小鼠基质胶塞模型定量分析血管密度与形态，为肿瘤血管生成研究提供可靠的体内成像策略。

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Satchi-Fainaro 研究实验室的部分经费来自国际癌症研究协会（The Association for International Cancer Research，AICR）、德国-以色列基金会（German-Israel Foundation，GIF）、以色列科学基金会（THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION，项目编号 1309/10）、瑞士桥奖（Swiss Bridge Award），以及以色列国家纳米技术计划（Israeli National Nanotechnology Initiative，INNI）的重点技术领域（Focal Technology Area，FTA）项目“用于个性化诊疗的纳米医学”资助，同时获得利昂娜·M. 和哈利·B. 赫尔姆斯利纳米技术研究基金（The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund）的支持。

注意：所有动物实验均经特拉维夫大学萨克勒医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并按照其标准执行。
1. 条件培养基制备
<ol>
	<li>在10 cm培养皿中加入8 ml添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/制霉菌素溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），接种2 × 106个U-87 MG细胞。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养，至48小时达到完全汇合。</li>
	<li>使用10 ml注射器从培养皿中吸出全部培养基，经0.45 µm滤膜过滤后收集至15 ml离心管中。</li>
	<li>无需洗涤细胞，直接向培养皿中加入1 ml胰蛋白酶溶液（0.25%），并进行孵育。</li>
	<li>待所有细胞脱落后，加入至少5 ml含10% FBS的DMEM终止胰酶消化，并进行细胞计数。</li>
	<li>使用血细胞计数板或其他细胞计数装置计数细胞数量，并根据所用计数方法计算细胞总数。 
	注意：该数值后续将用于标准化条件培养基（C.M.）的浓度。</li>
	<li>将条件培养基（C.M.）转移至玻璃圆底烧瓶中，使用高真空旋转蒸发仪进行浓缩。如需加快浓缩速度，可将水浴温度升至37 °C。持续浓缩至C.M.呈糊状。</li>
	<li>将每块培养皿所得的C.M.重新悬浮于400 µl生理盐水中。若使用多于一块培养皿，则按比例增加体积。例如，使用2块培养皿时，使用800 µl。每块培养皿的C.M.用于4只小鼠。</li>
	<li>为比较不同细胞系或处理条件，应根据步骤1.6获得的细胞数量比例调整体积。例如，若某块培养皿的细胞数量多出1.5倍，则在原有的400 µl生理盐水中额外加入200 µl。此即为调整后的C.M.。</li>
</ol>
2. 小鼠体内ECM模拟凝胶栓接种
<ol>
	<li>在将ECM模拟凝胶接种到小鼠体内之前，准备以下材料：
	<ol>
		<li>去除了生长因子且不含酚的ECM模拟凝胶（实验前一天晚上在4 °C冰上过夜解冻）。</li>
		<li>电动剃毛器。</li>
		<li>用于麻醉小鼠的氯胺酮和赛拉嗪。</li>
		<li>预冷的1,000 µl无菌吸头。</li>
		<li>预冷的1 ml注射器和27 G针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每只小鼠准备一个含有80 µl调整好浓度的C.M.的1.5 ml离心管，并置于冰上保存。</li>
	<li>向每根离心管中加入600 µl在4 °C冰上过夜解冻的预冷的去除了生长因子且不含酚的ECM模拟凝胶。ECM模拟凝胶在4 °C时呈液态，在体温下会固化；为防止其提前固化，请使用预冷的1,000 µl吸头。轻轻混匀各管内容物，避免产生气泡，并始终保持在冰上。</li>
	<li>使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）对6周龄BALB/c小鼠进行麻醉。根据机构动物护理与使用委员会的规定确认麻醉效果，i.e. 在开始实验前确认。当小鼠对用力夹捏脚趾无反应时，表明已达到适当的麻醉深度。</li>
	<li>剃除小鼠腹部区域的毛发，并使用外科消毒剂/酒精进行消毒。</li>
	<li>使用预冷的1 ml注射器和27 G针头，将离心管中的内容物皮下注射。注射过程应非常缓慢，以防止气泡形成。注射完毕后，针头需在原位停留数分钟，直至凝胶完全固化后再拔出。</li>
</ol>
3. 利用超声评估ECM模拟凝胶栓的血管化
注意：本实验步骤需要操作超声成像系统的先前经验，或需由经授权的技术人员协助完成。
<ol>
	<li>开始前，请准备好以下材料和仪器：
	<ol>
		<li>电动剃须刀</li>
		<li>脱毛膏</li>
		<li>为使小鼠麻醉，使用氯胺酮和赛拉嗪。</li>
		<li>非靶向微泡</li>
		<li>激活装置。</li>
		<li>配备55 MHz 708探头和三维采集微操作器的超声成像系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种后三周测量凝胶塞内的血管化程度： 
	注意：在U-87 MG细胞系建立的动物模型中，3周被确定为成像的最佳时间点。在不同实验条件下，自植入栓块数天后开始校准血管化动力学。
	<ol>
		<li>使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）对小鼠进行麻醉。根据机构动物护理与使用委员会的标准确认麻醉效果。 即 在开始实验之前。当动物对用力捏压脚趾不再产生反应时，即已达到适当的麻醉水平。</li>
		<li>剃除小鼠腹部的毛发，并使用脱毛膏处理。</li>
		<li>将小鼠仰卧位固定在显微操作仪的载物台上。</li>
		<li>使用含有生理盐水的1 ml注射器和30 G针头，将针头插入尾静脉内，固定针头并松开注射器。</li>
		<li>3D模式对比成像采集设置：
		<ol>
			<li>按“3D”键以初始化三维电机平台，并将换能器置于所需扫描区域的中央。</li>
			<li>按下“3D”按钮，输入扫描距离和步长，然后按下“Scan”开始扫描。</li>
			<li>确保在显示的3D图像数据中已扫描到整个栓塞部位。如果未完全显示，调整换能器位置，使整个栓塞部位在扫描图像中可见，并重复步骤3.5.2。</li>
			<li>按“对比度”按钮，并将时间增益补偿（TGC）控制旋钮向左旋转，以使图像变暗。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用专用于微泡激活的瓶混匀器激活微泡，持续45秒。</li>
		<li>在1 ml注射器中混合50 µl微泡与50 µl生理盐水。</li>
		<li>将含有生理盐水的已松动注射器更换为含有激活微泡的注射器。将稀释后的微泡注入小鼠尾静脉，等待数秒使微泡达到稳态，然后使用3D采集电机获取栓子部位的三维增强对比动态影像序列。
		<ol>
			<li>按“3D”并选择 &#34;扫描&#34; 获取三维增强对比图像，然后按“Cine Store”以保存图像数据。</li>
			<li>按“3D”并点击“Destroy 3D”以破坏微泡。</li>
			<li>再次按下“3D”并选择 &#34;扫描&#34; 获取破坏后动态图像序列后，按“Cine Store”按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生成微泡破坏前后叠加图像帧：
		<ol>
			<li>在屏幕左侧的“参考设置”中，点击“创建参考”。</li>
			<li>按“研究管理”以打开获取的毁损前动态影像序列。</li>
			<li>单击“处理动态图像”以生成绿色对比覆盖图像，然后单击“载入3D”。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用美国成像软件对所得的三维图像进行定量分析，以测定凝胶栓子内的血容量：
		<ol>
			<li>按“扫描/冻结”，然后按“模式设置”。</li>
			<li>点击“体积”并选择“并行”。</li>
			<li>通过分割一系列轮廓来创建目标组织的三维体积。</li>
			<li>单击“Finish”以完成分割。 
			注意：对比剂的体积将显示在屏幕左下角。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在操作结束后，将小鼠置于温暖、清洁、干燥、安静的环境中，远离其他动物。使用市售的手术加热垫或白炽灯提供保温。&#160;（50-75 瓦），置于啮齿类动物12-14英寸远处。持续监测小鼠，直至其能够维持直立姿势并正常行走。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用光纤共聚焦内窥显微镜评估模拟细胞外基质凝胶栓中的血管形态
注意：本部分实验步骤需在超声成像后立即进行，要求操作者已具备纤维共聚焦内窥显微成像系统的操作经验，或需有授权技术人员协助。
<ol>
	<li>开始前，请准备好以下材料和仪器：
	<ol>
		<li>手术工具，如镊子、剪刀和可吸收缝合线。</li>
		<li>异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（70 KDa）。</li>
		<li>校准溶液（三个试管，分别含有过氧化氢、水或荧光溶液）。</li>
		<li>成像系统及适用于血管成像的探头，按照制造商说明操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过尾静脉注射 200 µl 浓度为 10 mg/ml 的 FITC 标记葡聚糖。</li>
	<li>使用外科擦洗剂/酒精对腹部区域进行消毒，并在距栓塞部位约 1 cm 处做一小切口。</li>
	<li>将内窥显微探头轻轻放置在栓塞部位上方，同时保持栓塞结构完整。</li>
	<li>图像采集：
	<ol>
		<li>探头放置到位后，使用脚踏板按下“启动激光”。荧光信号应显示在屏幕上。</li>
		<li>通过点击屏幕上的“录制”按钮或使用脚踏板按下“选择”键，采集短片段视频（最长 30 秒）。</li>
		<li>每次采集间隔，将探头尖端放入装有水的试管中进行清洗。</li>
		<li>完成采集后，取下探头并用棉签清洁探头尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析平均血管直径：
	<ol>
		<li>点击上方面板中的“检测微血管”图标，打开血管检测模块窗口。</li>
		<li>点击“偏好设置”，在“关注的统计量”中勾选“平均血管直径”，在“显示模式”中勾选“显示直方图条”。</li>
		<li>点击“检测”以显示所选测量结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析血管邻近区域的荧光信号强度：
	<ol>
		<li>在左侧面板中点击“创建圆形感兴趣区域（ROI）”，并在目标区域创建一个圆形。</li>
		<li>点击“计算 ROI 内直方图”以计算该区域的相关数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 小鼠术后处理
<ol>
	<li>每次成像操作结束后，将小鼠置于温暖、清洁、干燥且安静的环境中，远离其他动物。使用市售的手术加热垫或白炽灯&#160;（50–75 W），放置在距离啮齿动物12–14英寸&#160;的位置提供保温。持续监测小鼠，直至其能够维持直立姿势并正常行走。&#160;</li>
	<li>若需在其他时间点对栓塞物的血管化情况进行进一步分析，请采用以下恢复条件：
	<ol>
		<li>使用可吸收缝线缝合小切口。</li>
		<li>皮下注射镇痛药物（如布托啡诺，1 mg/kg），然后将小鼠放回单独的笼具中。</li>
		<li>观察所有动物，判断是否需要进一步镇痛处理，并每日重新评估，以监测和评估其痛苦状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验终点，先使用异氟烷麻醉小鼠，随后实施颈椎脱位法处死。</li>
	<li>若在初始成像步骤后的数周内还需进行额外成像操作，则所有操作应尽可能保持无菌。&#160;应进行外科皮肤消毒，使用无菌水和无菌棉签清洁内窥镜探头，并在每只动物之间用无菌水对探头进行消毒。&#160;</li>
</ol>

<ol><li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth%3A+an+in+vivo+Matrigel+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li>
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<li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li>
<li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

结合使用互补的成像方法，可获取有关血管生成不同组分的信息，包括微血管密度、功能性和形态学特征。将C.M.加载到模拟细胞外基质的凝胶塞中，可形成肿瘤微环境，该环境与其他细胞群体（如被招募并外渗进入凝胶塞的内皮细胞）相分离。
通过并行进行微泡造影增强超声成像和光纤共聚焦内窥显微成像，我们可以得出结论：由快速生长的血管生成性肿瘤形成细胞分泌的一组因子（不包括癌细胞本身）不仅能够募集血管，还能形成具有典型EPR特征的功能性脉管系统。此外，该方法可实现肿瘤微环境中分泌因子作用与细胞间相互作用的分离。
通过美国获取的信息以及使用光纤共聚焦内窥显微成像技术存在成像技术本身的局限性。例如，在使用光纤共聚焦内窥显微成像时，无法随时间推移对单个特定的血管进行成像，甚至无法对栓塞部位的同一区域进行重复成像。
ECM模拟凝胶塞实验相对容易操作，在将条件培养基（C.M.）加入ECM模拟凝胶时也能保持这一优势。然而，一个需要考虑的关键问题是C.M.与ECM模拟凝胶的比例。过高的C.M.体积可能阻碍E...

Matrigel 小栓血管生成实验最初由 Kibbey et al. 于 1992 年描述，当时用于评估肽段 SIKVAV（Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val）对血管生成的刺激作用1。与其他 体内 血管生成实验（如小鼠角膜血管生成实验或鸡胚尿囊膜实验）相比，该实验相对易于操作2。注射的模拟细胞外基质（ECM）凝胶可包含细胞、促血管生成或抗血管生成化合物和/或因子。在评估抗血管生成化合物活性时，通常在小栓中加入血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的混合物，抗血管生成物质可直接注入小栓内或通过全身给药3,4。
将模拟细胞外基质（ECM）的凝胶注射到皮下，该凝胶在数分钟内即固化。通常通过测量凝胶栓内血红蛋白水平、注射荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖后检测荧光信号、对组织切片进行内皮特异性标志物免疫染色，或通过荧光激活细胞分选（FACS）2,5,6来评估凝胶栓中血管的募集情况。然而，这些方法仅能进行终点分析，无法提供有关血管功能性和形态学的信息。此外，无论是通过血红蛋白水平还是使用葡聚糖-FITC作为指示剂来测量血浆体积，结果均可能具有误导性，因为血液含量受血管大小以及血液滞留池范围的影响。当所募集的血管系统表现出增强的通透性和滞留（EPR）效应时，这一点尤为关键7。
本文提出一种结合两种互补成像模式的新方法，可更精确地可视化被招募的血管。高分辨率微泡增强超声成像（US）与活体纤维共聚焦内窥显微镜技术相结合，不仅能提供血管密度的信息，还可揭示其形态学特征和功能状态。此外，该分析可在多个时间点进行，从而实现对血管生成动力学的动态监测。超声成像是一种广泛应用的成像技术，在静脉（i.v.）注射微泡造影剂后，可对血管系统进行高空间分辨率成像，而微泡仅局限于血管腔内8-11。这些微泡为充满气体的微粒，当受到超声脉冲激发时可产生强烈的回声信号，因此是优良的对比增强剂。在微泡破坏后，通过超声成像系统软件获取植入物的三维图像。所得图像由微泡破坏前后采集的图像帧组成，并以颜色反映视频强度的差异。这些叠加图像由软件自动显示，从而可定量分析植入物内功能性血管所占的百分比。高分辨率纤维共聚焦内窥显微镜作为互补的成像手段，用于评估血管的形态学特征。在这一微创方法中，静脉注射FITC标记的葡聚糖后获取图像12。该荧光聚合物可标记血流，因而作为观察血管形态和血流情况的“对比剂”。此外，由于所注射的聚合物分子量为70 KDa，仅能通过通透性异常的血管（如肿瘤血管系统中所见）渗出。这将导致血管外出现较强的FITC标记葡聚糖背景信号。因此，纤维共聚焦内窥显微镜可用于观察肿瘤新生血管中增强渗透与滞留（EPR）效应的典型特征：扩张、渗漏、高度扭曲且末端钝圆的血管。
该系统模型曾用于比较U-87 MG人胶质母细胞瘤及其休眠克隆的血管生成潜能13。在ECM模拟凝胶接种后三周，评估了凝胶塞内的血管化情况。结果显示，与含有休眠肿瘤形成细胞条件培养基（C.M.）的凝胶塞相比，含有U-87 MG快速生长肿瘤形成细胞条件培养基（C.M.）的凝胶塞在血管数量、密度和功能方面均显著增加。因此，作者得出结论：与休眠肿瘤形成细胞的条件培养基相比，U-87 MG快速生长肿瘤形成细胞的条件培养基含有更高水平的促血管生成因子。这些因子通过积极影响血管生成级联反应的各个步骤（即内皮细胞的增殖、出芽、迁移以及最终管状结构的形成），促进功能性血管的形成。

<table><tbody><tr><td>旋转真空蒸发仪</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>生长因子减少的无酚红基质胶</td><td>BD生物科学</td><td>FAL356231</td><td>4℃过夜解冻 &amp;deg;在冰上</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vevo2100 超声成像系统</td><td>VisualSonics 公司</td><td>-</td><td>需要具备操作经验或由授权技术人员协助</td></tr><tr><td>55 MHz 708 探头</td><td>VisualSonics 公司</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vevo2100 成像软件</td><td>VisualSonics 公司</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>VialMix</td><td>DEFINITY 成像</td><td>VMIX</td><td>-</td></tr><tr><td>DEFINITY 微泡</td><td>DEFINITY 成像</td><td>DE4</td><td>使用前用 VialMix 激活 45 秒</td></tr><tr><td>CellVizio（光纤共聚焦内窥显微镜）</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>需要具备操作经验或由授权技术人员协助</td></tr><tr><td>ProFlex MiniO/30 探针</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>70 kD FITC标记的葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageCell 软件</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>校准试剂盒</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>生物工业公司</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/制霉菌素溶液</td><td>生物工业公司</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

监测由快速生长的肿瘤形成细胞分泌因子招募的血管系统的功能与形态

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

小鼠皮下Matrigel栓塞实验是一种首选方法 体内 促血管生成与抗血管生成因子的评估。在该方法中，将目标因子引入低温液态ECM模拟凝胶，经皮下注射后，凝胶固化形成模拟肿瘤微环境的基质。该基质允许宿主细胞（如内皮细胞）浸润，从而促进血管系统的形成。
本文提出了一种改良的基质胶栓塞实验方法，可用于展示由癌细胞分泌的多种因子混合物所具有的促血管生成潜力，而非仅针对某一特定因子（例如 bFGF 和 VEGF）或试剂。该方法利用含有模拟细胞外基质（ECM）凝胶的栓塞物，将快速生长的胶质母细胞瘤细胞在条件培养基（C.M.）中分泌的多种因子引入宿主（即 小鼠）体内。我们此前已在该模型系统中详细比较了U-87 MG人胶质母细胞瘤细胞系及其静息状态衍生克隆的促血管生成能力，结果显示U-87 MG亲本细胞可诱导血管生成。条件培养基（C.M.）的制备方法是：将两种细胞系在融合状态下培养48小时后，收集培养液并进行过滤处理，因此其中仅包含细胞分泌的因子，而不含有细胞本身。本文还描述了两种成像技术的联合应用——微泡增强的超声成像与活体纤维共聚焦内窥显微镜，以实现对栓塞物内新生血管的范围、形态及功能进行精确、实时的表征。

将表达快速生长的血管生成性肿瘤细胞系 U-87 MG 的条件培养基（C.M.）植入模拟细胞外基质（ECM）的凝胶塞中，可诱导显著的血管生成。该血管系统可通过两种互补的成像方法进行深入研究。
微泡造影增强超声成像通过显示载有U-87 MG条件培养基（C.M.）的凝胶中存在广泛的血流，揭示了功能性血管被大量招募至凝胶内部的现象；相比之下，含有休眠性肿瘤形成细胞条件培养基（C.M.）的凝胶内则几乎检测不到血流（图1）。
纤维状共聚焦内窥显微镜突出了这些新形成血管的形态（图2）。含有U-87 MG条件培养基的凝胶栓中，血管表现出典型的增强渗透与滞留（EPR）效应特征，该效应常见于此处使用的70 kDa大分子物质如FITC标记的葡聚糖。血管明显扩张且高度扭曲，血流不连续且缓慢（图2A，C）。此外，观察到血液向周围环境渗漏，表现为血管外出现强荧光信号（图2B）。
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我们描述了一种Matrigel栓塞实验，通过两种互补的成像方式——超声成像和内窥显微成像，来展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜能。Matrigel是一种模拟细胞外基质（ECM）的凝胶，可用于将癌细胞分泌至条件培养基（C.M.）中的促血管生成因子引入宿主（小鼠）体内。&#160;

小鼠皮下Matrigel栓塞实验是体内评估促血管生成和抗血管生成因子的首选方法。该方法中，将所需……

以下实验的总体目标是利用超声和内窥显微镜技术，展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜能。该目标首先通过植入一个栓塞物，在小鼠体内构建类似肿瘤的微环境（不使用肿瘤细胞），随后评估栓塞物内的血管密度以及功能性血管所占的百分比来实现。在最后一步中，对血管的形态进行可视化观察。最终，可通过两种互补的活体成像方式，在不同时间点对细胞分泌的促血管生成因子与抗血管生成因子之间的平衡及其对血管生成的影响进行体外、体内及动态评估。该技术相较于传统 Matrigel 小栓实验等现有方法的主要优势在于，能够在利用互补性活体成像技术的同时，分析细胞分泌的一组因子。演示该实验操作的是我实验室的博士生谢然（Xie Ran）和安德拉（Andra）。为了利用超声成像评估细胞外基质（ECM）模拟凝胶塞的血管化，首先将一个含有80微升新鲜配制的条件培养基的1.5毫升离心管置于冰上。该操作中最关键的步骤是使用预冷的枪头将凝胶缓慢注入，避免产生气泡。轻柔混匀并缓慢注射可确保凝胶的最佳递送效果。然后使用预冷的1000微升枪头，将600微升预冷至4摄氏度并已过夜保存的解冻ECM模拟凝胶混入培养基中，注意避免产生气泡。通过脚趾夹捏法确认小鼠麻醉后，剃除每只小鼠的腹部毛发，并使用预冷的1毫升注射器（配备27号针头）缓慢进行皮下注射。每只动物注射一支 EEND DPH 管中的内容物。待全部体积注射完毕后，将针头保持在原位数分钟，直至凝固发生。三周后，再次剃除小鼠腹部区域的毛发，并用脱毛膏去除多余毛发，然后将小鼠仰卧固定在显微操作仪的载物台上。接下来，用生理盐水填充一支配备30号针头的1毫升注射器。然后将针头插入尾静脉内。固定针头，松开注射器。现在将换能器置于所需扫描区域的中央，点击“3D”以初始化三维电机平台。再次输入扫描距离和步长，然后按“扫描”。确认三维图像数据中已完整显示整个栓塞物。若未完整显示，请调整探头位置，确保整个栓塞物均可见，然后重新扫描该区域，方法如前所述。接下来选择“对比”模式，并调节时间增益补偿（TGC）控制以使图像变暗，同时使用试管混合器激活微泡 45 秒。然后将50微升微泡与50微升生理盐水在1毫升注射器中混合。将装有松散生理盐水的注射器更换为含有激活微泡的注射器，并将稀释后的微泡注入每只小鼠的尾静脉。等待数秒，待微泡达到稳定状态后，点击3D并选择扫描以获取三维图像。增强对比度的图像。单击“保存”以存储图像数据，然后选择 3D 并破坏 3D。为破坏微泡，再次单击 3D 并选择扫描，以获取破坏后的图像循环。然后再次点击已查看的商店。接下来在参考设置中，点击创建参考，然后选择研究管理，以打开预破坏 Cena 循环。现在点击“处理对比度”以生成绿色对比度叠加图像。然后在超声成像软件中选择“载入至3D”。接下来，点击“模式设置”，点击“容积”并选择“平行”。然后分割一系列轮廓，以创建目标组织的三维体积，并单击完成以结束分割。为了利用光纤共聚焦内窥显微技术评估ECM模拟凝胶栓子的血管形态，向每只实验动物的尾静脉注射200 µL浓度为10 mg/mL的FITC标记葡聚糖。然后，在距离栓子约1厘米处做一个小切口，将内窥显微探头轻轻放置在栓子表面，同时保持栓子完整。探针就位后，使用脚踏板启动激光。当屏幕上出现荧光时，用脚踏板按下“选择”以获取短至32帧长的视频。每段视频之间，将探针尖端在装有水的试管中清洗。拍摄结束后，用棉签清洁探针尖端，以分析平均血管直径。接下来，单击“检测微血管”以打开血管检测模块窗口，然后单击“首选项”。确保“感兴趣统计量”窗口中的平均血管直径以及“显示模式”中的直方图条均已被选中。单击“检测”以显示选定的测量结果。为了分析血管邻近区域的荧光信号强度，选择“创建圆形ROI”，并在感兴趣区域创建一个圆形。最后，选择“在ROI内计算直方图”以计算与该圆形区域相关的数值。通过微泡造影增强超声成像，可观察到在载有U 87 mg条件培养基的基质塞内，功能性血管被广泛招募。相反，在含有休眠肿瘤形成细胞条件培养基的基质塞内，血流几乎无法检测。通过在注射FITC葡聚糖后采用纤维共聚焦内窥显微镜对血管进行观察，进一步突显了这些新生血管的形态。如这些代表性图像所示，注意载有U 87 mg条件培养基的基质塞内的血管呈现出典型的渗漏性、钝端、扩张的血管形态。扩张且高度扭曲的血管还表现出不连续的缓慢血流，同时在周围区域观察到血液渗漏，血管外明显的强荧光信号也证实了这一点。掌握该技术后，可在多个时间点于数小时内完成操作，以优化血管生成动力学的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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