监控功能和血管形态由快速增长的肿瘤产生细胞分泌的因素招募
2014年11月23日
我们描述了一种基质胶栓测定，以使用两种互补的成像方式（超声和显微内镜）来说明癌细胞分泌的因子库的血管生成潜力。基质胶是一种细胞外基质 （ECM） 模拟凝胶，用于将分泌到条件培养基 （CM） 中的血管生成因子引入宿主（小鼠）。
以下实验的总体目标是使用超声和内窥镜来说明癌细胞分泌的一组因子的血管生成潜力。这是通过首先植入一个塞子，在没有肿瘤细胞的情况下在小鼠中产生类似肿瘤的环境来实现的。接下来，评估血管密度和塞子内功能性血管的百分比。
在最后一步中，将血管的形态可视化。最终，细胞分泌的促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡及其对血管生成的影响可以通过两种互补的成像方式在不同时间点进行内部、重要和不同的时间点评估。与常规基质胶塞测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许分析细胞分泌的因子库，同时利用互补的活体成像方式。
演示这个程序将是她运行的 F Andra 我实验室的博士生 要使用超声评估细胞外基质或 ECM 模拟凝胶栓血管化，首先将一个 1.5 毫升的 einor 管放入冰上，其中包含 80 微升新鲜制备的调节培养基。该过程最棘手的部分是使用冰冷的尖端注射没有气泡的凝胶。温和混合和缓慢注射将确保最佳凝胶给药。
然后使用冰冷的 1000 微升吸头将 600 微升冰冷的 4 摄氏度混合过夜。解冻的 ECM 模拟凝胶进入培养基中，注意不要形成气泡。通过脚趾捏确认镇静后，剃掉每只小鼠的腹部，并使用配备 27 号针头的冰冷的 1 毫升注射器缓慢皮下注射。
每只动物注射一根 EEND DPH 管的内容物。给药整个体积后，将针头固定几分钟，直到凝固。三周后，再次剃掉小鼠的腹部区域，用脱毛膏去除多余的毛发，然后将小鼠固定在微型纵器的舞台上仰卧位。
接下来，将盐水填充一个装有 30 号针头的 1 毫升注射器。然后将针头放入尾静脉内。牢固固定针头并松开注射器。
现在将换能器放在所需扫描区域的中间，然后单击 3D 以初始化 3D 电机平台。单击 3D。再次输入扫描距离和步长，然后按 Scan 扫描。
确认在显示的 3D 图像数据中扫描了整个插头。如果没有，请调整换能器，使整个插头可见，然后再次扫描该区域，就像刚才演示的那样。接下来选择对比度并调整时间增益补偿或 tgc 控制以使图像变暗，使用样品瓶混合器激活微气泡 45 秒。
然后在 1 毫升注射器中将 50 微升微泡与 50 微升生理盐水混合。用含有活化微泡的注射器替换含有盐水的松动注射器，并将稀释的微泡注射到每只小鼠的尾静脉中。等待几秒钟，让气泡达到稳定状态，然后单击 3D 并选择扫描以获取 3D。
对比增强图像。单击 看到商店 以保存图像数据，然后选择 3D 并销毁 3D。要销毁微气泡，请再次单击 3D 并选择 scan 以获取销毁后 cena 循环。
然后再次单击 seen a store。接下来，在参考文献设置中，单击 create reference（创建参考文献），然后选择 Study management（研究管理）。打开 pre destruction cena 循环。
现在单击 process cena 以生成绿色对比度叠加。然后在超声成像软件中选择 load into 3D。接下来，单击 mode settings（模式设置），单击 volume（音量），然后选择 parallel（并行）。
然后分割一系列轮廓以创建目标组织的 3D 体积，然后单击 Finish 完成分割。为了使用纤维共聚焦内窥镜评估 ECM 模拟凝胶塞血管形态，注射 200 微升每毫升 10 毫克，将 C 标记的葡聚糖放入每只实验动物的尾静脉中。然后在距离塞子约 1 厘米处切开一个小切口，将内窥镜探针轻轻放在塞子顶部，同时保持塞子完好无损。
探头就位后，使用脚踏板按下启动激光器。一旦荧光出现在屏幕上，用脚踏板按下选择键以在电影之间获取长达 32 的短电影，在装有水的试管中清洗探针尖端。拍摄完成后，用棉签清洁尖端以分析平均血管直径。
接下来，单击 detect micro vessels 以打开容器检测模块窗口，然后单击 preferences。确保 mean vessel diameter 在感兴趣的统计数据中。标记显示模式下的窗口和显示直方图条。
单击 detect 以显示选定的测量值。为了分析血管附近区域的荧光信号强度，请选择创建圆圈 ROI 并在感兴趣区域中创建一个圆圈。最后，选择 Compute histogram within ROI 以计算与圆圈区域相关的值。
在这里，微泡对比增强超声成像揭示了 U 87 mg 条件性中等负荷栓子内功能性血管的广泛募集。相反，在含有来自休眠肿瘤生成细胞的条件培养基的栓子中，血流几乎无法检测到。如这些代表性图像所示，在 fit c 葡聚糖给药后血管的纤维共聚焦内窥镜进一步强调了这些新形成的血管的形态，请注意载有 U 87 mg 条件培养基的塞子内的血管如何表现出典型的渗漏钝端扩大的血管形态。
扩大和高度缠结的血管也表现出不连续和缓慢的流动，并且在周围区域观察到血液泄漏，血管外部明显的高荧光信号也证明了这一点。一旦掌握，这项技术可以在几个时间点在几个小时内完成，以优化血管生成动力学。
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概述
本研究描述了一种利用超声和内窥显微镜评估癌细胞分泌因子促血管生成潜能的Matrigel栓塞实验。该方法可在小鼠体内构建的类似肿瘤环境中，对血管密度和形态进行评价。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 血管生成
背景
- 血管生成对肿瘤生长和转移至关重要。
- 理解促血管生成与抗血管生成因子之间的平衡至关重要。
- 传统方法可能无法有效分析分泌的因子。
- 互补的成像技术可增强对血管生成的评估。
研究目的
- 说明癌细胞分泌因子的促血管生成潜力。
- 在小鼠模型中利用Matrigel栓塞实验。
- 评估血管密度和功能。
使用的方法
- 在小鼠体内植入Matrigel栓以模拟肿瘤微环境。
- 评估血管密度及功能性血管。
- 利用影像学方法观察血管形态。
- 随时间推移评估促血管生成因子的表达。
主要结果
- 成功在小鼠体内构建出类似肿瘤的微环境。
- 实现了对血管密度的定量评估。
- 展示了血管形态的可视化结果。
- 获得了关于促血管生成因子平衡的新见解。
结论
- Matrigel 小管形成实验可有效评估血管生成潜能。
- 多种互补的成像方式可提供详细的分析信息。
- 该方法有助于加深对癌症生物学的理解。
常见问题
行业高管相关性
该方法使生物制药研发能够在生理相关的体内环境中评估肿瘤细胞分泌的复杂因子库的促血管生成潜力。通过将定量超声成像与高分辨率内窥显微镜相结合，该方法可提供有关血管功能和形态的机制性见解，支持靶点验证以及血管生成调节类治疗药物的风险评估。该检测方法有助于在早期阶段评估促血管生成与抗血管生成因子的平衡，为研发管线决策提供依据，并降低肿瘤药物开发后期的生物学风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过评估癌细胞分泌因子库的总体促血管生成效应，验证治疗假设。
- 操作价值：可在模拟肿瘤的基质中实时测量血管密度和灌注情况，从而实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过将因子分泌谱与血管表型相关联，支持机制层面的风险评估，有助于靶点的优先排序。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：利用条件培养基作为输入，制备标准化且可重复的生物系统，用于筛选促血管生成或抗血管生成化合物。
- 定量输出：生成可测量的终点指标，包括血管密度、功能性血管百分比和平均血管直径，用于化合物筛选实验。
- 可扩展性与重复使用：支持在多个时间点进行纵向监测，从而实现动力学分析，并可在不同因子文库或基因扰动实验中重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 疾病相关性： 模拟快速生长的胶质母细胞瘤的血管生成微环境，为临床前疗效研究提供转化桥梁。
- 生物标志物一致性： 实现血管形态（如渗漏性、扩张的血管）与功能读数的相关性分析，支持转化型生物标志物的发现。
- 基于风险的推进评估： 通过随时间量化血管生成反应，促进“推进/终止”决策，降低临床前研究进展中的不确定性。
流程与工作流整合
该检测方法可融入从早期靶点验证到先导化合物优化，再到临床前验证的整个发现流程，提供一种功能性的读出结果，以补充生物化学和表型筛选。
- 发现生物学：通过揭示复杂因子混合物的促血管生成潜力，阐明血管生成调控中的通路水平效应，支持假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的血管读数（如血管密度、功能），实现不同孔板或时间点间测试条件的可靠比较。
- 分析：提供多模态数据——包括超声衍生的灌注参数和基于内窥显微镜的形态计量分析——以支持比较分析及构效关系研究。
- 转化研究：将体外因子分泌与体内血管效应相连接，利用与疾病相关的血管表型，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在肿瘤学项目中评估因子组合、抗体或小分子的促血管生成或抗血管生成活性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将分泌因子谱与功能性血管结果相关联，增强预测可信度，减少血管生成调控中的机制模糊性。
- 操作价值：通过可重复的凝胶栓形成、标准化成像方案以及跨操作者和实验地点的可量化终点，实现评估的标准化。
- 战略价值：通过实现对靶向血管生成候选物的早期去风险化，减少对生物学无活性策略的投资，提高资本使用效率。
- 组合影响：提供血管生成活性的直接证据，支持区分促血管生成与抗血管生成机制，从而指导基于风险调整的优先级决策。
实施注意事项
- 需要具备体内成像技术的专业知识，包括超声造影剂操作和光纤共聚焦内窥显微镜的使用。
- 依赖于可获取的高频超声系统（配备三维电动平台）和微泡造影剂，以及具备荧光葡聚糖标记能力的内窥显微成像平台。
- 需要跨团队对插件制备、成像参数和图像分析流程进行标准化，以确保不同研究间的可重复性。
- 在将该模型应用于不同细胞系、肿瘤类型或基质共培养体系时，需考虑适应性调整，以维持其生理相关性。
- 受限于该检测方法的终点性质，每个时间点均需处死实验动物，从而限制了对个体对象的纵向采样。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
