Name: 线性扩增介导的PCR - 未知侧翼DNA的遗传物质和表征本地化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学习线性扩增介导PCR技术，用于精确定位病毒载体在基因组中的整合位点。该方法通过生物素标记引物富集载体-基因组连接序列，结合深度测序揭示整合位点分布，为基因治疗安全性评估和克隆动态研究提供关键技术支持。

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本研究由德国研究基金会（德意志研究联合会，SPP1230，海德堡/曼海姆肿瘤中心资助项目）、德国联邦教育与研究部（iGene）、欧洲委员会第六和第七框架计划（CONSERT、CLINIGENE 和 PERSIST）提供资助。我们感谢伊娜·库切拉（Ina Kutschera）在视频中演示本实验方案的技术操作。

1. 连接子盒（LC）的制备
<ol>
	<li>取40 µl LC1 寡核苷酸（表1）、40 µl LC2 寡核苷酸（表1，需带有合适的限制性内切酶突出末端）、110 µl Tris-HCl&#160;(100 mM, pH 7.5) 和 10 µl 250 mM MgCl2，混合均匀。</li>
	<li>在95 °C孵育5分钟，随后让反应体系缓慢冷却至室温。加入300 µl H2O，并使用离心过滤装置浓缩双链连接子DNA。向洗脱液中加入80 µl H2O，将制备好的连接子片段分装至0.2 ml PCR管中，每管10 µl。</li>
</ol>
2. 载体基因组连接处的预扩增
<ol>
	<li>针对每个待分析样本，配制50 µl的PCR反应体系。
	<ol>
		<li>测定DNA样本的浓度。将x µl（LAM为1–1,000 ng，nrLAM为100–1,000 ng）的DNA加入0.2 ml PCR管中。每个样本的DNA体积应相等，且在0.5至25 µl范围内。</li>
		<li>按照表2所述配制PCR预混液。将(50 - x) µl预混液与每个DNA样本在0.2 ml PCR管中混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用表2所示的PCR条件对载体基因组连接区域进行预扩增。PCR完成后，向每个PCR管中加入0.5 µl Taq聚合酶，并重新运行PCR程序。PCR产物可在4 °C保存最多4天，或在-20 °C长期保存。</li>
</ol>
3. PCR 产物的磁珠分离
<ol>
	<li>磁性 beads 的制备
	<ol>
		<li>将 20 µl（200 µg）链霉亲和素包被的磁性 beads 用移液器转移至 1.5 ml 离心管中，室温下置于磁性粒子分离器（MPS）上 1 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将离心管从 MPS 上取下，用 40 µl PSB/0.1% BSA（pH 7.5）重悬磁性 beads。再次置于 MPS 上 1 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
		<li>用 20 µl 3 M LiCl 溶液（3 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）洗涤 beads，置于 MPS 上 1 分钟，弃去上清液。将 beads 重悬于 50 µl 6 M LiCl 溶液（6 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 2.2 的全部 PCR 反应产物与 50 µl 制备好的磁性 beads 混合。在水平摇床（300 rpm）上室温孵育至少 2 小时。此步骤可使生物素标记的 PCR 产物与链霉亲和素包被的 beads 结合（DNA-beads 复合物）。DNA-beads 复合物可在摇床上继续孵育过夜，或在 4 °C 保存最多 4 天。</li>
	<li>将 DNA-beads 复合物置于 MPS 上 1 分钟（室温），移除上清液，用 100 µl H2O 重悬 DNA-beads 复合物。立即进行 LAM 的第 4 步或 nrLAM 的第 5 步。</li>
</ol>
4. LAM-操作步骤
<ol>
	<li>双链DNA（dsDNA）合成（仅限LAM）
	<ol>
		<li>将第3.3步得到的DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入8.25 µl H2O、1 µl 10x六核苷酸缓冲液、0.25 µl dNTPs（10 mM）和0.5 µl（2 U）Klenow聚合酶。37 °C孵育1小时。</li>
		<li>加入90 µl H2O，暴露于MPS中1分钟。弃去上清液，将DNA-磁珠复合物重悬于100 µl H2O中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>限制性酶切
	<ol>
		<li>将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入8.5 µl H2O、1 µl 10x限制性内切酶缓冲液和0.5 µl限制性内切酶，反应孵育1小时。重复步骤4.1.2。 
		注：应根据所用限制性内切酶制造商推荐的温度进行孵育。确保在目标DNA中用于预扩增的引物结合位点内部或下游不存在该限制性内切酶的识别位点。有关合适限制性内切酶或限制性内切酶组合的选择，请参见9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双链连接子连接（LK）
	<ol>
		<li>将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入5 µl H2O、1 µl 10x FastLink缓冲液、1 µl ATP（10 mM）、2 µl 第1.2步制备的连接子载体，以及1 µl Fast-Link DNA连接酶（2 U/µl）。室温孵育5分钟。重复步骤4.1.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合成dsDNA的变性
	<ol>
		<li>将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。将DNA-磁珠复合物重悬于5 µl 0.1 N NaOH中。在水平摇床上室温孵育5分钟。</li>
		<li>将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，收集含有预扩增载体-基因组连接区的上清液至新的1.5 ml离心管中。立即进行第6步操作，或在-20 °C保存上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. nrLAM 操作步骤
<ol>
	<li>单链连接子（ssLC）连接（仅限 nrLAM）
	<ol>
		<li>将步骤 3.3 中的 DNA-磁珠复合物暴露于 MPS 1 分钟，弃去上清液。加入 6.5 µl H2O、1 µl CircLigase 10x 反应缓冲液、0.5 µl MnCl2（50 mM）、0.5 µl ATP（1 mM）、1 µl ssLinker 寡核苷酸和 0.5 µl CircLigase（100 U/µl）。在 60 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>加入 90 µl H2O，暴露于 MPS 1 分钟。弃去上清液，用 100 µl H2O 洗涤 DNA-磁珠复合物。再次暴露于 MPS 1 分钟，弃去上清液，并将 DNA-磁珠复合物重悬于 10 µl H2O 中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 指数扩增 I
<ol>
	<li>针对每个待分析样本，配制50 µl的PCR反应体系。
	<ol>
		<li>用移液器将2 µl模板DNA（来自步骤4.4.2（LAM）或5.1.2（nrLAM））加入0.2 ml的PCR管中。</li>
		<li>按照表3所述配制PCR预混液。将48 µl预混液加入步骤6.1.1的每个样本中，并按照表3所示的PCR条件扩增载体基因组连接区域。PCR产物可于4 °C保存最多4天，或长期保存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. PCR 产物的磁性分离
<ol>
	<li>按照步骤 3.1.1 - 3.1.3 所示方法制备磁珠。将磁珠重悬于 20 µl（用于 LAM）或 50 µl（用于 nrLAM）的 6 M LiCl 溶液（6 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）中。将步骤 6.1.2 中得到的 20 µl（LAM）或 50 µl（nrLAM）PCR 反应产物与已制备的磁珠（步骤 7.1）混合，在水平摇床上室温孵育 2 小时（300 rpm）。DNA-磁珠复合物可继续在摇床上过夜孵育，或在 4 °C 保存最多 4 天。</li>
	<li>将 DNA-磁珠复合物置于磁力架上 1 分钟，移除上清液，再将 DNA-磁珠复合物重悬于 100 µl H2O 中。再次置于磁力架上 1 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将 DNA-磁珠复合物重悬于 20 µl（LAM）或 5 µl（nrLAM）的 0.1 N NaOH 溶液中。在水平摇床上室温孵育 10 分钟，置于磁力架上 1 分钟，收集含有扩增 DNA 的上清液至新的 1.5 ml 离心管中。立即进行步骤 8.1，或将上清液在 -20 °C 保存。</li>
</ol>
8. 指数扩增 II
<ol>
	<li>针对每个待分析的样本，准备一个50 µl的PCR反应体系。
	<ol>
		<li>将2 µl模板DNA（来自步骤7.3）移液至一个0.2 ml的PCR管中。</li>
		<li>按照表4所述配制PCR预混液。将48 µl预混液加入步骤8.1.1中的每个样本，并按照表4所示的PCR条件扩增载体基因组连接区域。PCR产物可在4 °C保存最多4天，或在-20 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为观察（nr）LAM-PCR产物，取步骤8.1.2中得到的10 µl PCR产物上样至2%琼脂糖凝胶。若条带可见，则将10 µl LAM-PCR产物上样至高分辨率凝胶进行分析。注意：溴化乙锭具有诱变性。操作时务必格外小心，并始终佩戴合适的手套。</li>
</ol>
9. 高通量测序的准备工作
<ol>
	<li>（nr）LAM-PCR 产物的纯化
	<ol>
		<li>取 8.1.2 步骤中的 40 µl PCR 产物，与 44 µl 室温的 AMPure XP 磁珠混合。室温孵育 5 分钟，再置于磁力架（MPS）上静置 2 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，在磁力架（MPS）上用 200 µl 70% 乙醇洗涤两次。</li>
		<li>弃去上清液，将 DNA-磁珠复合物重悬于 30 µl H2O 中。孵育 1 分钟后，将上清液转移至新的 0.2 ml 离心管中。测定纯化后 DNA 的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>融合引物 PCR 扩增以添加测序专用接头。
	<ol>
		<li>针对每个待分析的样本，准备一个 50 µl 的 PCR 反应体系。</li>
		<li>用移液器将 x µl（40 ng）DNA 加入 0.2 ml PCR 管中。每个样本中加入的 DNA 体积应相等，且在 0.5 至 25 µl 范围内。</li>
		<li>按照表 5 中所述配制 PCR 主混合液。将 (50 - x) µl 主混合液加入 9.2.2 步骤中的每个样本，并通过如表 5所示的 PCR 条件，在 (nr)LAM-PCR 产物中引入测序接头。PCR 产物可短期保存于 4 °C（最长 4 天），或长期保存于 -20 °C。</li>
		<li>为观察融合引物 PCR 产物，取 9.2.3 步骤中的 10 µl PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。剩余 PCR 产物按照 9.1.1–9.1.3 步骤进行纯化。取 9.4 步骤中纯化后的 1 µl PCR 产物，使用自动高分辨率电泳设备进行分析，以准确测定融合引物 PCR 产物的浓度和片段大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li>
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<li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

LAM-PCR 技术可用于鉴定已知 DNA 区域侧翼的未知 DNA 序列。由于使用特异性引物与已知 DNA 序列杂交，对连接区域进行预扩增，因而具有高灵敏度，甚至能够扩增并检测到低至单细胞水平的稀有连接序列。相反，在多克隆情况下，LAM-PCR 能够在单次反应中扩增数千种不同的连接序列。
然而，由于仅使用限制性内切酶，每次使用特定的限制性内切酶进行LAM-PCR时，只能分析整合组中的一小部分是否存在连接片段。因此，建议使用不同的酶对同一样本进行重复分析9。如果凝胶上未出现LAM-PCR扩增产物，最可能的原因是已知DNA片段位置与所选限制性内切酶最近识别位点之间的距离过大，无法产生LAM-PCR产物9。此时应更换其他酶以扩增该连接片段。
nrLAM 不依赖限制性内切酶的使用，因此是一种用于全面表征已知 DNA 序列侧翼区域的非常有价值的方法。由于省略了限制性消化步骤，该方法无法获得表征每个扩增连接区的特异性限制性片段长度多态性。相反，每个扩增连接区均产生不同大小的 PCR 产物，电泳后...

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）可用于鉴定和表征任何来源的已知DNA旁侧的未知DNA序列。更具体而言，LAM-PCR最初被开发用于定位病毒载体在宿主基因组中的整合位点（IS）1,2。诸如逆转录病毒或转座子之类的遗传元件会以（半）随机的方式将其基因组整合到宿主基因组中3-6。在许多情况下，精确了解这些载体的整合位置至关重要。LAM-PCR已被证明优于其他替代技术，如连接介导的PCR7及其变体或反向PCR8。该方法的高灵敏度和稳健性源于对载体-基因组连接区域的初始预扩增以及对扩增PCR产物的磁珠筛选。与上述替代方法类似，LAM-PCR依赖于限制性内切酶的使用，这会引入对整合位点（IS）检测能力的偏倚9-11。因此，在单次反应中仅能检测到整合位点库（integrome）的一个子集。通过使用最佳组合的限制性内切酶对同一样本进行平行分析，可将这种偏倚降至最低9。最近，已开发出一种称为非限制性LAM-PCR（nrLAM-PCR）的技术变体，该方法规避了限制性内切酶的使用，能够在单次反应中实现对样本的无偏倚全基因组分析9,12。
过去，LAM-PCR 已被用于鉴定在少数接受基因治疗临床试验的患者中引发白血病的致病性逆转录病毒插入位点（IS）13-15。此后，LAM-PCR 已被改进，可用于鉴定其他整合型载体（如慢病毒载体、转座子）的插入位点，也可用于分析被动整合型载体（如腺相关病毒载体（AAV）或整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV））的整合模式16-21。LAM-PCR 的应用范围广泛：传统上，该技术被广泛用于研究接受基因治疗患者的基因修饰细胞的克隆组成，或通过解析新型载体系统的整合行为来评估其生物安全性15,16,22-24。最近，LAM-PCR 还通过 IDLV 捕获实验实现了对设计核酸酶的特异性及脱靶活性的测定25。
此外，LAM-PCR 可用于在生物体内长期追踪转导细胞的命运。这使得研究人员能够鉴定原癌基因和肿瘤抑制基因，同时也有助于研究造血过程或癌症干细胞生物学26-28。最后但同样重要的是，LAM-PCR 已被改进用于研究人类T细胞受体的多样性29（以及未发表数据）。
通过将该方法与深度测序技术相结合，能够以单核苷酸分辨率对全基因组中数百万条未知侧翼DNA进行表征，从而增强了该技术的内在能力。在以下实验方案中，我们以鉴定慢病毒载体插入位点（IS）为例，逐步描述侧翼未知DNA的扩增与鉴定过程。本方案中所用的寡核苷酸列于表1中。任何来源的提取DNA或cDNA均可作为LAM-PCR和nrLAM-PCR的DNA模板。

<table><tbody><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>可使用其他替代的 Taq 聚合酶</td></tr><tr><td>PCR 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>推荐使用该缓冲液</td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>或任何其他 dNTP</td></tr><tr><td>寡核苷酸（引物）</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>经 HPLC 纯化</td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>含 0.1%（w/v）BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>含 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl，pH 7.5</td><td>USB Corporation&amp;nbsp;</td><td>22637</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A1103,0250</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>Klenow 聚合酶</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>六核苷酸混合物</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB</td><td></td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>Fast-Link DNA 连接试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA 连接酶试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖（Agarose LE）</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>TBE 缓冲液</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>溴化乙锭具有致突变性</td></tr><tr><td>100 bp DNA Marker</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>或任何其他 DNA Marker</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>或任何其他供应商</td></tr><tr><td>Magna-Sep 磁性粒子分离器&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K158501</td><td>适用于 1.5 ml 离心管</td></tr><tr><td>Magna-Sep 磁性粒子分离器</td><td>Life Technologies</td><td>K158696</td><td>适用于 96 孔板</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5，Ultracel-30 膜</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue 凝胶电泳系统 Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>或其他电泳系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>或其他适用于 96 孔板的 PCR 仪</td></tr><tr><td>轨道摇床 KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td>或其他水平摇床</td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 软管</td><td>Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>或其他 0.2 ml PCR 管</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>或其他 1.5 ml 离心管</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>PeqLab</td><td></td><td>或任何其他凝胶成像系统</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 预制胶</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>SEA 2000 水平凝胶电泳装置&amp;nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100 电泳生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

线性扩增介导pcr——遗传元件的定位与未知侧翼dna的表征

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）已开发用于研究接受整合型载体系统基因治疗患者的基因校正细胞中的造血过程。由于逆转录病毒载体能够稳定整合，其整合位点可用于追踪单个细胞及其子代细胞的克隆命运。LAM-PCR首次提供了证据，表明接受基因治疗的患者所发生的白血病源于前病毒插入导致邻近原癌基因的过表达。与现有的逆向PCR和连接介导（LM）-PCR等方法相比，LAM-PCR具有更高的灵敏度和特异性，其关键在于初始的预扩增步骤（使用生物素标记的载体特异性引物进行100个循环的线性PCR），从而使后续反应步骤可在固相（磁珠）上进行。目前，LAM-PCR是鉴定整合位点最灵敏的方法&#160;位于已知DNA附近的未知DNA。最近，一种改良的LAM-PCR技术被开发出来，该方法无需限制性酶切，从而避免了整合位点捕获过程中的偏好性偏差，能够对前病毒在宿主基因组中的位置进行全面分析。以下方案逐步说明了如何扩增整合型慢病毒载体两侧的3’和5’侧翼序列。

LAM-PCR 可扩增出具有特定片段长度的载体基因组连接区域。每个PCR片段的长度取决于基因组中已知DNA位置与最近的限制性内切酶识别位点之间的距离。这使得可通过凝胶电泳直观地观察分析样本中扩增连接产物的多样性，例如，根据凝胶上是否存在单一（单克隆）、少数（寡克隆）或多条（多克隆）条带进行判断。LAM-PCR 的结果最好通过高分辨率电泳凝胶显示（图 2A），但也可在 2% 琼脂糖凝胶上观察（图 2B）。nrLAM-PCR 则对每个独立的连接位点产生不同长度的PCR片段，因此单克隆、寡克隆或多克隆样本在电泳图中均表现为弥散条带（涂布状），无法通过肉眼区分。在 2% 琼脂糖凝胶上观察 nrLAM-PCR 产物足以判断实验流程是否成功（图 2C）。对回收的基因组DNA进行测序后，可将其序列比对至相应的宿主基因组，以确定载体插入位点的精确位置（图 3A）。对基因组进行注释可进一步分析插入位点（IS）的特征，例如载体是否偏好插入基因编码区（图 3B）或靠近转录起...

线性扩增介导（LAM）-PCR 是一种用于确定整合性病毒载体在基因组中精确位置的方法。该技术已发展成为研究基因治疗患者克隆动态、新型载体技术的生物安全性、T细胞多样性、肿瘤干细胞模型等领域的优越方法。

线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）已开发用于研究接受基因治疗患者的基因校正细胞中的造血过程……

以下实验的总体目标是确定整合型病毒载体在基因组中的精确插入位置。该目标通过初始的线性PCR反应实现，该反应使用生物素标记的引物，在固相上从基因组DNA中富集病毒载体-基因组连接序列，并经过一系列反应生成两端均含有已知DNA序列的双链DNA产物，从而实现对病毒载体-基因组连接区域的指数级扩增。随后，将测序接头引入线性PCR产物中。为了通过深度测序对未知的侧翼DNA进行测序和表征，这些片段可揭示载体整合的精确位置。通过凝胶电泳可观察到多种扩增的连接片段。该方法可深入了解临床基因治疗患者中病毒载体整合位点的分布情况。该方法还可应用于其他研究，如插入突变、诱变筛选、病毒感染、癌症、干细胞克隆性或T细胞多样性分析。本实验步骤将由本实验室的技术员ina RA进行演示。进行此操作时，首先准备连接子片段混合物：在微量离心管中，将两种LCO引物各40微升、110微升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）以及10微升氯化镁混合。接着，将混合物置于95摄氏度的加热块中孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温，过夜。第二天，向制备好的双链连接子DNA中加入300微升水，并将其转移至微型离心管滤器上过滤。离心收集浓缩的连接子DNA于滤器底部的收集管中。随后，从滤器中取出收集管。向离心管中加入 80 微升水，并吸取 10 微升等分试样至 PCR 管中。使用 PCR 在 50 微升反应管中对羔羊的载体基因组连接区域进行预扩增。每 50 微升反应体系中加入 1 纳克至 1 微克的样本 DNA。对于 NR 羔羊，需至少加入 100 纳克 DNA。加入的 DNA 体积不得超过 25 微升。按照文中表二执行 PCR。完成之后，向每个反应中再添加 0.5 µL 的 tech，并再次运行 PCR 程序。首先，准备磁珠：将 20 µL 链霉亲和素包被的磁珠加入一个 1.5 mL 离心管中，室温下置于磁珠分离器上静置 1 分钟。然后弃去上清液。将磁珠重悬于 40 µL 含 BSA 的 PBS 中，再将磁珠放回分离器中静置 1 分钟。用 20 µL 3 M 氯化锂溶液洗涤，替换上清液。再次将磁珠置于分离器上静置一分钟，随后用50微升6摩尔/升氯化锂溶液替换上清液。然后将磁珠混合物加入PCR反应产物中，于室温下轻轻振荡孵育2小时至过夜。生物素标记的DNA、试纸条和包被的磁珠将形成复合物，可在4摄氏度下保存长达四天。由于其高灵敏度，请继续进行LAMP或NR-LAMP。如果操作不谨慎，LAMP实验容易受到污染。这是一个PCR级环境，清洁工作需格外注意，至关重要。为了在不污染样本的情况下成功扩增未知的侧翼DNA，首先将复合物置于分离器中作用一分钟，然后将DNA磁珠重悬于100微升水中。接下来，将复合物暴露于分离剂中一分钟。此次将DNA磁珠复合物重悬于混合液中，混合液包含8.25 µL水、1 µL HEXA核苷酸缓冲液、0.25 µL dNTPs以及0.5 µL cano聚合酶。将该混合物在 37 摄氏度下孵育 1 小时。然后加入 90 微升水，并将反应液置于分离器中继续处理 1 分钟。随后将 DNA 磁珠复合物重悬于 100 微升水中进行洗涤。继续使用分离器一分钟，并准备限制性内切酶反应。去除上清液后，加入8.5 µL水、1 µL限制性内切酶缓冲液和0.5 µL限制性内切酶。选择限制性内切酶时，需确保该酶在预扩增反应所用引物结合位点的内部或下游无任何酶切位点。在适宜温度下反应一小时后，加入90 µL水。混匀一分钟，用洗涤液将BDNA复合物重悬于100 µL水中。重复分离步骤，并准备连接反应。向磁珠中加入5 µL水、1 µL 10×快速连接缓冲液、1 µL TP接头、1 µL快速连接DNA连接酶，以及1 µL在实验开始时制备的接头盒（linker cassette）。在室温下让该反应进行五分钟。加入 90 µL 水并分离磁珠以终止反应，随后用 100 µL 水洗涤一次。再次分离后，用 5 µL 0.1 N 氢氧化钠重悬磁珠以变性合成的 DNA，并在室温下震荡混合物五分钟。然后将复合物分离一分钟，并收集上清液（SUP natin），其中含有预先扩增的载体基因组连接片段。立即进行指数扩增，或于-20摄氏度保存。首先使复合物与分离剂作用一分钟。将DNA磁珠重悬于100 µL水中，再次分离后弃去上清液。进行连接反应时，加入6.5 µL水、1 µL circ Ligase和10×反应缓冲液。加入0.5 µL氯化镁、0.5 µL TP、1 µL SS连接寡核苷酸以及0.5 µL环状连接酶。在60 °C下反应1小时后，加入90 µL水终止反应，使用磁珠分离器将磁珠重悬于另外100 µL的1中，再次使用分离器，并将洗涤复合物收集于10 µL水中。首先，按照文中表三所述配制PCR主混合液。在200微升PCR管中，向2微升羊源或NR羊源产物中加入48微升主混合液，并按照文中所述条件进行PCR扩增。准备更多链霉亲和素包被的磁珠，并将其重悬于6摩尔氯化锂溶液中。羊源产物使用20微升磁珠，NR羊源产物使用50微升磁珠。随后将磁珠加入等体积的PCR反应产物中，在室温下置于摇床以300转/分钟振荡孵育2小时至过夜，收集DNA-磁珠复合物，并用100微升水洗涤，操作步骤如前所述。 现在，将复合物悬浮于0.1 N氢氧化钠中，在摇床上室温孵育珠粒10分钟。随后将珠粒置于分离器上1分钟，收集含有扩增DNA的上清液至新的离心管中。以扩增的DNA为模板，取其中2 µL按照文中表四所述条件进行PCR扩增。通过凝胶电泳观察产物，以纯化产物。取40微升产物与44微升室温的am pure XP磁珠混合，孵育5分钟。然后将磁珠置于磁力架上分离2分钟。去除上清液后，用 200 微升 70% 乙醇洗涤磁珠两次，然后加入 30 微升水和 40 纳克 DNA 融合引物重悬磁珠。可使用 PCR 添加测序特异性接头。详细信息见表五。在琼脂糖凝胶上检测产物。通过高分辨率凝胶电泳观察绵羊 PCR 结果是进行诊断分析的最佳选择。尽管 2% 琼脂糖凝胶也可使用，但效果不如前者。NR LAMB的克隆性无法通过PCR产物进行肉眼判断。然而，2%琼脂糖凝胶完全足以确定该实验方案是否成功。在对PCR产物进行测序后，即可确定载体在宿主基因组中的位置。根据这些数据，可以在编码区以及转录起始位点附近记录插入位点的位置。该技术的开发为基因治疗领域的研究人员探索基因转移载体在临床前模型以及临床基因治疗试验中的生物安全性铺平了道路。

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