线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

以下实验的总体目标是确定整合型病毒载体在基因组中的精确插入位置。该目标通过初始的线性PCR反应实现，该反应使用生物素标记的引物，在固相上从基因组DNA中富集病毒载体-基因组连接序列，并经过一系列反应生成两端均含有已知DNA序列的双链DNA产物，从而实现对病毒载体-基因组连接区域的指数级扩增。随后，将测序接头引入线性PCR产物中。

为了通过深度测序对未知的侧翼DNA进行测序和表征，这些片段可揭示载体整合的精确位置。通过凝胶电泳可观察到多种扩增的连接片段。该方法可深入了解临床基因治疗患者中病毒载体整合位点的分布情况。

该方法还可应用于其他研究，如插入突变、诱变筛选、病毒感染、癌症、干细胞克隆性或T细胞多样性分析。本实验步骤将由本实验室的技术员ina RA进行演示。进行此操作时，首先准备连接子片段混合物：在微量离心管中，将两种LCO引物各40微升、110微升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）以及10微升氯化镁混合。接着，将混合物置于95摄氏度的加热块中孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温，过夜。

第二天，向制备好的双链连接子DNA中加入300微升水，并将其转移至微型离心管滤器上过滤。离心收集浓缩的连接子DNA于滤器底部的收集管中。随后，从滤器中取出收集管。

向离心管中加入 80 微升水，并吸取 10 微升等分试样至 PCR 管中。使用 PCR 在 50 微升反应管中对羔羊的载体基因组连接区域进行预扩增。

每 50 微升反应体系中加入 1 纳克至 1 微克的样本 DNA。对于 NR 羔羊，需至少加入 100 纳克 DNA。加入的 DNA 体积不得超过 25 微升。按照文中表二执行 PCR。

完成之后，向每个反应中再添加 0.5 µL 的 tech，并再次运行 PCR 程序。首先，准备磁珠：将 20 µL 链霉亲和素包被的磁珠加入一个 1.5 mL 离心管中，室温下置于磁珠分离器上静置 1 分钟。

然后弃去上清液。将磁珠重悬于 40 µL 含 BSA 的 PBS 中，再将磁珠放回分离器中静置 1 分钟。用 20 µL 3 M 氯化锂溶液洗涤，替换上清液。

再次将磁珠置于分离器上静置一分钟，随后用50微升6摩尔/升氯化锂溶液替换上清液。然后将磁珠混合物加入PCR反应产物中，于室温下轻轻振荡孵育2小时至过夜。

生物素标记的DNA、试纸条和包被的磁珠将形成复合物，可在4摄氏度下保存长达四天。由于其高灵敏度，请继续进行LAMP或NR-LAMP。如果操作不谨慎，LAMP实验容易受到污染。

这是一个PCR级环境，清洁工作需格外注意，至关重要。为了在不污染样本的情况下成功扩增未知的侧翼DNA，首先将复合物置于分离器中作用一分钟，然后将DNA磁珠重悬于100微升水中。

接下来，将复合物暴露于分离剂中一分钟。此次将DNA磁珠复合物重悬于混合液中，混合液包含8.25 µL水、1 µL HEXA核苷酸缓冲液、0.25 µL dNTPs以及0.5 µL cano聚合酶。

将该混合物在 37 摄氏度下孵育 1 小时。然后加入 90 微升水，并将反应液置于分离器中继续处理 1 分钟。随后将 DNA 磁珠复合物重悬于 100 微升水中进行洗涤。

继续使用分离器一分钟，并准备限制性内切酶反应。去除上清液后，加入8.5 µL水、1 µL限制性内切酶缓冲液和0.5 µL限制性内切酶。

选择限制性内切酶时，需确保该酶在预扩增反应所用引物结合位点的内部或下游无任何酶切位点。在适宜温度下反应一小时后，加入90 µL水。混匀一分钟，用洗涤液将BDNA复合物重悬于100 µL水中。

重复分离步骤，并准备连接反应。向磁珠中加入5 µL水、1 µL 10×快速连接缓冲液、1 µL TP接头、1 µL快速连接DNA连接酶，以及1 µL在实验开始时制备的接头盒（linker cassette）。

在室温下让该反应进行五分钟。加入 90 µL 水并分离磁珠以终止反应，随后用 100 µL 水洗涤一次。再次分离后，用 5 µL 0.1 N 氢氧化钠重悬磁珠以变性合成的 DNA，并在室温下震荡混合物五分钟。

然后将复合物分离一分钟，并收集上清液（SUP natin），其中含有预先扩增的载体基因组连接片段。立即进行指数扩增，或于-20摄氏度保存。首先使复合物与分离剂作用一分钟。

将DNA磁珠重悬于100 µL水中，再次分离后弃去上清液。进行连接反应时，加入6.5 µL水、1 µL circ Ligase和10×反应缓冲液。

加入0.5 µL氯化镁、0.5 µL TP、1 µL SS连接寡核苷酸以及0.5 µL环状连接酶。在60 °C下反应1小时后，加入90 µL水终止反应，使用磁珠分离器将磁珠重悬于另外100 µL的1中，再次使用分离器，并将洗涤复合物收集于10 µL水中。首先，按照文中表三所述配制PCR主混合液。

在200微升PCR管中，向2微升羊源或NR羊源产物中加入48微升主混合液，并按照文中所述条件进行PCR扩增。准备更多链霉亲和素包被的磁珠，并将其重悬于6摩尔氯化锂溶液中。羊源产物使用20微升磁珠，NR羊源产物使用50微升磁珠。随后将磁珠加入等体积的PCR反应产物中，在室温下置于摇床以300转/分钟振荡孵育2小时至过夜，收集DNA-磁珠复合物，并用100微升水洗涤，操作步骤如前所述。

现在，将复合物悬浮于0.1 N氢氧化钠中，在摇床上室温孵育珠粒10分钟。随后将珠粒置于分离器上1分钟，收集含有扩增DNA的上清液至新的离心管中。以扩增的DNA为模板，取其中2 µL按照文中表四所述条件进行PCR扩增。

通过凝胶电泳观察产物，以纯化产物。取40微升产物与44微升室温的am pure XP磁珠混合，孵育5分钟。然后将磁珠置于磁力架上分离2分钟。

去除上清液后，用 200 微升 70% 乙醇洗涤磁珠两次，然后加入 30 微升水和 40 纳克 DNA 融合引物重悬磁珠。可使用 PCR 添加测序特异性接头。详细信息见表五。

在琼脂糖凝胶上检测产物。通过高分辨率凝胶电泳观察绵羊 PCR 结果是进行诊断分析的最佳选择。尽管 2% 琼脂糖凝胶也可使用，但效果不如前者。

NR LAMB的克隆性无法通过PCR产物进行肉眼判断。然而，2%琼脂糖凝胶完全足以确定该实验方案是否成功。在对PCR产物进行测序后，即可确定载体在宿主基因组中的位置。

根据这些数据，可以在编码区以及转录起始位点附近记录插入位点的位置。该技术的开发为基因治疗领域的研究人员探索基因转移载体在临床前模型以及临床基因治疗试验中的生物安全性铺平了道路。