线性扩增介导的PCR - 未知侧翼DNA的遗传物质和表征本地化

以下实验的总体目标是确定整合病毒载体在基因组中的确切位置。这是通过使用生物素化引物进行初始线性 PCR 反应来实现的，以富集来自固相上基因组 DNA 的载体基因组连接序列在一系列反应中，产生在产物两端具有已知 DNA 序列的双链 DNA，这允许载体基因组连接呈指数扩增。接下来，将测序接头掺入羔羊 PCR 产物中。

为了通过深度测序对未知的侧翼 DNA 进行测序和表征，这些片段揭示了载体整合的确切位置。结果是通过凝胶电泳观察到的扩增连接多种多样。该方法提供了对临床基因治疗患者病毒载体整合位点分布的见解。

它也可以应用于其他研究，例如插入、诱变、筛选、病毒感染、癌症和干细胞克隆性或 T 细胞多样性。该程序将由我实验室的技术人员 ina RA 演示 对于此程序，首先准备连接盒，将两个 LCO 乐高积木中各 40 微升与 110 微升 tris 盐酸盐和 10 微升氯化镁混合在微量离心管中。接下来，将混合物在 95 摄氏度的加热块上孵育 5 分钟，然后缓慢冷却至室温过夜。

第二天，向准备好的双链接头 DNA 中加入 300 微升水，并在微量离心管上过滤。离心过滤器以收集输出中的浓缩接头 DNA。接下来，从过滤器中恢复 ouit。

向 ouit 中加入 80 μL 水并移液。将 10 μL 等分试样放入 PCR 管中。使用 PCR 在 50 μL 反应管中预扩增羊肉的载体基因组连接。

每 50 μL 反应添加 1 ng 至 1 μg 样品 DNA。对于 NR 羔羊，至少使用 100 纳克 DNA。不要添加超过 25 μL 的 根据文中的表 2 执行 PCR。

完成后，向每个反应中额外添加 0.5 μL tech，然后再次运行 PCR 程序。首先，准备磁珠。将 20 μL 链球 ENC 包被的磁珠添加到 1.5 mL 试管中，并在室温下将它们放在磁珠分离器上 1 分钟。

然后丢弃上清液发酵物。将珠子悬浮在 40 微升含 BSA 的 PBS 中，然后将珠子放回分离器上再放置一分钟。用 20 μL 的 3 摩尔氯化锂溶液洗涤液替换上清液。

再一次，将珠子放在分离器上一分钟。最后用 50 μL 六摩尔氯化锂溶液替换上清液。现在将磁珠混合物添加到 PCR 反应产物中，让该混合物在室温下孵育 2 小时至过夜，轻轻摇动。

生物素化的 DNA 和条状 tava 和包被的珠子将形成复合物，可以在 4 摄氏度下储存长达四天。继续使用羊肉或 NR 羊肉 由于其高度敏感。如果认真执行，L-A-M-P-C-R 很容易受到污染。

这是 PCR 级环境。特别注意最重要的清洁。为了在不污染样品的情况下成功扩增未知的侧翼 DNA，首先将复合物暴露在分离器中 1 分钟，然后将 DNA 珠子悬浮在 100 μL 水中。

接下来，将复合物暴露在分离器中一分钟。这次将 DNA 珠复合物重悬于含有 8.25 μL 水的混合物中。1 微升 HEXA 核苷酸缓冲液、四分之一微升 D DN NTP 和半微升 cano 聚合酶。

将此混合物在 37 摄氏度下孵育一小时。然后加入 90 微升水，将反应物暴露在分离器中再放置一分钟。然后将 DNA 珠复合物重悬于 100 μL 水洗液中。

再使用分离器一分钟，然后制备限制性内切酶反应。去除上清液后。加入 8.5 μL 水、1 μL 限制性内切酶缓冲液和半 μL 限制性内切酶。

选择限制性内切酶时，请确保它在 preem 扩增反应中使用的原始结合位点内或下游没有位点。让酶在理想温度下反应一小时后，加入 90 微升水。使用分离器一分钟，然后将 BDNA 复合物重悬于 100 微升水的洗涤液中。

重复分离并准备连接反应。向微珠中加入 5 微升水、1 微升 10 x 快速链接缓冲液。在手术开始时制作了 1 微升 TP、1 微升快速连接 DNA 连接酶和一微升接头盒。

让该反应在室温下运行 5 分钟。通过加入 90 μL 水并分离珠子来结束反应，然后在 100 μL 水中洗涤。然后进行另一次分离，使合成的 DNA 变性，将磁珠重悬于 5 μL 0.1 正常氢氧化钠中，并让混合物在室温下摇动 5 分钟。

然后分离复合物一分钟并收集 SUP natin，其中包含前导扩增的载体基因组连接。立即进行指数扩增或储存在零下 20 摄氏度。首先将复合物暴露在分离器中一分钟。

并将 DNA 珠悬浮在 100 微升水中。并再次将它们分开并去除上清液。对于连接反应，加入 6.5 μL 水、1 μL circ 连接酶、10 x 反应缓冲液。

半微升氯化镁、半微升 TP、一微升 SS 接头寡核苷酸和半微升 cir 连接酶。在 60 摄氏度下一小时后，使用珠子分离器 Resus 用 90 微升水结束反应，将珠子悬浮在另外 100 微升水中，再次使用分离器并将洗涤复合物收集在 10 微升水中。首先按照本文表 3 中的说明制备 PCR 预混液。

在 200 微升 PCR 管中将 48 微升预混液加入 2 微升羊肉或 NR 羊肉产品中，并如前所述运行 PCR，在珠子中制备更多链球并将它们重悬于 6 摩尔氯化锂中。羊肉使用 20 微升，NR 羊肉使用 50 微升。然后将磁珠加入相同体积的 PCR 反应产物中，并在摇床上以 300 RPM 的温度孵育 2 小时至在室温下过夜，收集 DNA 珠复合物并用 100 微升水洗涤，如前所述。

现在，将复合物悬浮在 0.1 正常氢氧化钠中，并在室温下在摇床上孵育微珠 10 分钟。然后将磁珠暴露在分离器中一分钟，并将含有扩增 DNA 的上清液收集到新试管中。使用扩增的 DNA 作为模板，使用 2 微升 DNA 进行 PCR，如本文表 4 所述。

通过凝胶电泳使产物可视化以纯化产物。将 40 μL 磁珠与 44 μL 室温 am 纯 XP 磁珠混合，孵育 5 分钟。然后在磁力架上分离磁珠 2 分钟。

去除上清液后，使用 200 μL 70% 乙醇洗涤珠子两次，然后使用 40 ngDNA 融合引物重悬珠子和 30 μL 水。PCR 可用于添加测序特异性接头。详情见表 5。

检查凝胶上的产物。通过高分辨率凝胶电泳查看羊肉 PCR 结果是比较诊断分析的最佳选择。虽然 2%aros 也有效，但效果不佳。

NR LAMB、PCR 产物的克隆性无法通过肉眼诊断。然而，2%agros 凝胶完全足以确定方案的成功。对 PCR 产物进行测序后，可以在宿主基因组中找到载体的位置。

从这些数据中，可以记录编码区的插入位点位置，以及靠近转录起始位点的开发后。这项技术为基因治疗领域的研究人员在临床前模型和临床基因治疗试验中探索基因转移载体的生物安全性铺平了道路。