发现蛋白质相互作用和检定蛋白质功能使用的HaloTag技术
July 12th, 2014
的HaloTag技术是显示在小和大的蛋白质复合物从哺乳动物细胞中分离显著成功的多功能技术。在这里，我们重点介绍了这项技术的优势比现有的替代品，并展示其效用研究蛋白质功能的许多方面里面的真核细胞。
该程序的总体目标是从哺乳动物细胞中有效地分离蛋白质复合物。这是通过首先用 halo 标签融合构建体横切细胞以表达目标蛋白来实现的。第二步是切片细胞并通过 halo 标签共价捕获树脂上的蛋白质复合物。
接下来，轻轻洗涤树脂上的蛋白质复合物以去除任何非特异性相互作用。最后一步是从填料中洗脱蛋白质复合物。最终，halo tag pull-down 用于从哺乳动物系统中分离和发现新的蛋白质相互作用。
我们今天在这里向您展示的方法可以促进功能蛋白质组学领域的关键发现，包括鉴定新的蛋白质相互作用和确定细胞内的蛋白质定位。今天执行这些程序的是我们的两位高级科学家 Jackie Mendez 和 Alen Beek。首先，对于每个融合或对照，准备一个 15 厘米的培养皿，其中含有 30 毫升细胞，每毫升 3 到 4 倍 10 到 5 个细胞，或每个构建体每 1 到 1.2 倍 10 到 7 个细胞总数。
将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 18 至 24 小时。孵育后，用所需的转染试剂转染构建体。转染后 24 至 48 小时，去除培养基，用 20 至 25 mL 冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞层，去除 PBS 洗涤液，加入 25 至 30 mL 4°C 冷冻 PBS。
然后，用细胞刮刀轻轻地将细胞从培养皿上刮下来。将细胞收集到锥形管中后，将样品在 2000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 5 至 10 分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀物置于零下 80 摄氏度下至少 30 分钟或最多六个月。
对于每个融合或对照样品，制备 18 mL 树脂平衡洗涤缓冲液。通过倒置样品瓶轻轻混合树脂，以获得均匀的悬浮液。对于每个 pull-down 实验，将 200 μL 树脂分配到 1.5 mL 微量离心管中。
离心后，将样品以 800 倍 G 离心 1 分钟。小心去除上清液，不要干扰试管底部的树脂。弃去上清液后，向样品中加入 800 μL 树脂平衡洗涤缓冲液，并倒置试管数次充分混合。后。
将样品以 800 次离心 2 分钟。G.小心取出并丢弃上清液。再重复前面的步骤两次，总共洗涤 3 次。
解冻细胞沉淀后，将它们悬浮在 300 μL 先前制备的哺乳动物裂解液中。通过上下移液缓冲。然后转移到新的微量离心管中，加入 6 μL 的 50 x 蛋白酶抑制剂混合物。
然后，加入 3 μL RQ One DNA，倒置样品 10 分钟。在室温下，将样品通过 25 或 27 号注射器针头 5 到 10 次，使细胞溶解。将样品在 4 摄氏度下以 14， 000 倍 G 离心 5 分钟后，将透明裂解物转移到新试管中，并置于冰上。
接下来，向透明裂解物中额外加入 700 μL 先前制备的一种 XTBS 缓冲液，并通过上下吹打充分混合。从先前制备的平衡树脂管中取出最终洗涤液，而不会干扰每个管底部的树脂。然后向每个试管中加入 1 毫升稀释的裂解物。
将样品在 22 °C 下在试管旋转器上混合孵育 15 分钟。离心后，将树脂管以 800 倍 G 离心 2 分钟，弃去上清液后，加入 1 毫升树脂平衡洗涤缓冲液，在树脂管以 800 倍离心 2 分钟后，用手将每个树脂管倒置数次，充分混匀。G.重复前一个和洗涤步骤
三次后，丢弃洗涤液。将样品在 22 °C 下不断旋转孵育 5 分钟后，向试管中加入 1 毫升树脂平衡洗涤缓冲液，以 800 倍 G 离心树脂试管 2 分钟，然后弃去洗涤液。此时，复苏将每个样品中的树脂悬浮在 50 μL SDS 洗脱缓冲液中。在室温下用自动微量离心管振荡器摇动试管 30 分钟。
以 800 倍离心 2 分钟后 G.将 EIT 转移到新试管中进行分析对于蛋白质印迹或银染凝胶，将 5 至 10 μL 样品上样到 SDS 变性凝胶上，用于质谱分析。每个样品在零下 20 摄氏度下储存 40 微升以备将来分析。在每个融合蛋白或对照板的 8 个孔室盖玻片中，将 400 微升 HELOC 细胞放入每个孔中适当的培养基中，密度为每毫升 10 至 2 倍的 10 至 5 个细胞。
在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育细胞 18 至 24 小时后，18 至 24 小时后用所需的转染试剂转染细胞，转染后在适当的细胞培养基中稀释 TMR 配体 1 至 200。然后向每个孔中加入 100 微升此溶液并轻轻混合。接下来，将含有配体的转染细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 15 分钟。
完成后，吸出含有配体的培养基，并用 500 微升缺乏蛋白质融合标签配体的适当培养基代替，该配体已被预先警告到 37 摄氏度。一次，上一步重复两次，总共洗涤 3 次。将细胞放回培养箱中 30 分钟。
孵育 30 分钟后，吸出培养基，并更换为 500 微升已预热至 37 摄氏度的适当培养基。在此图像之后，在显微镜上使用适当的采集参数使用方案 halo、BRD four 和 halo tag 对照表达观察细胞。也可以使用带有抗晕标签抗体或诱饵蛋白抗体的 Western 印迹来检测融合蛋白表达。
Halo BRD four 和对照 pulldown 的生物学重复的银染凝胶表现出高重现性，并显示与 BRD four 蛋白相互作用的蛋白质。来自 PTF B、CDK 9 和 Cyclin T 以及 BRD 9 蛋白的高丰度组分证实了 BRD 4 复合物的特异性捕获。凝胶显示其他蛋白质被鉴定为 BRD 4 的潜在相互作用物。
作为另一个示例，使用 Halo HD one 蛋白进行了复杂分离。在这种情况下，TEV 蛋白酶用于在 Halo 标签和 H DAC 之间的接头区域裂解，释放大量 HD 单诱饵蛋白。正如所观察到的。
HD one pulldown 样品显示高水平的 HD one 活性，这被 HDA 抑制剂 saha 抑制。为了进一步证明特异性，使用 sirtuin 家族抑制剂 EX 5 27 未观察到 HDA 抑制，单独使用缓冲液未检测到信号。用 TMR 对转染 Halo BRD 4 和 Halo HDAC 1 的 He A 细胞进行荧光标记。
配体成像显示，两者都定位于细胞核，并证明标签不会改变其融合伴侣的生理细胞定位。因此，按照此程序，可以使用质谱和蛋白质印迹等各种分析方法鉴定和进一步分析分离的蛋白质及其相互作用的伴侣。
概述
HaloTag技术是一种从哺乳动物细胞中分离蛋白质复合物的多功能方法，相较于现有技术展示了优势。本文展示了它在研究真核细胞中蛋白质功能方面的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 蛋白质组学
背景
- HaloTag技术允许捕获小型和大型蛋白质复合物。
- 它提供了一种研究蛋白质相互作用和定位的方法。
- 现有方法可能无法提供相同水平的效率或特异性。
- 该技术在功能蛋白质组学中特别有用。
研究目的
- 有效地从哺乳动物细胞中分离蛋白质复合物。
- 识别新型蛋白质相互作用。
- 确定细胞内蛋白质的定位。
使用的方法
- 用HaloTag融合构建物转染细胞。
- 在树脂上共价捕获蛋白质复合物。
- 洗涤以去除非特异性相互作用。
- 洗脱蛋白质复合物以供分析。
主要结果
- 成功分离蛋白质复合物的示例。
- 实现了新型蛋白质相互作用的识别。
- 验证了方法在功能蛋白质组学中的使用。
- 在蛋白质功能方面发现重大潜力。
结论
- HaloTag技术对于研究蛋白质复合物是有效的。
- 它比传统方法提供了优势。
- 这种方法可以带来细胞生物学的新见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient discovery and characterization of protein interactions are critical for de-risking targets and advancing functional proteomics in drug discovery. HaloTag technology enables covalent, specific, and rapid isolation of protein complexes, including weak or transient interactions, supporting predictive confidence in early-stage R&D. This capability strengthens portfolio triage and accelerates mechanistic understanding in complex mammalian systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of protein interaction networks for target validation.
- Facilitates biological de-risking by capturing low-abundance and transient complexes.
- Supports predictive confidence in functional annotation of novel targets.
- Improves portfolio triage by clarifying mechanistic pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream screening workflows.
- Delivers high specificity and reproducibility in pull-down assays.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative analysis.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization and interaction data with disease-relevant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of targets.
- Provides mechanistic insights for risk-adjusted advancement decisions.
- Enhances predictive de-risking by confirming physiological relevance of targets.
Pipeline & Workflow Integration
HaloTag-based protein complex isolation integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of specific protein complexes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative pull-downs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers mass spectrometry and western blot readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Confirms cellular localization and interaction profiles in disease-relevant mammalian systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable platform for functional proteomics across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein interaction studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target biology early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein biochemistry.
- Needs access to transfection, imaging, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible pull-down and localization assays.
- Adaptable to various mammalian cell systems and protein targets.
- Dependent on validated controls and quantitative analytical methods for interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Protein Pulldowns: Preparation of Transiently Transfected Cells
2:50
Equilibration of the HaloLink Resin
4:01
Binding and Washing of Fusion Complexes
6:21
SDS Elution for Denaturing Gels, Western Blots, or Mass Spectrometry
7:07
Cellular Imaging of Fluorescently Labeled Fusion Proteins Using a Cytoplasmic and Nuclear Permeable Ligand
8:48
Results: Using HaloTag Technology to Determine Protein Interactions and Localization
10:47
Conclusion
