利用 HaloTag 技术发现蛋白质相互作用并表征蛋白质功能

本实验的总体目标是从哺乳动物细胞中高效分离蛋白质复合物。首先通过将细胞转染带有Halo标签融合构建体的质粒，使目标蛋白得以表达；第二步是裂解细胞，并利用Halo标签将蛋白质复合物共价捕获于树脂上。

接下来，用缓冲液轻柔洗涤树脂上的蛋白质复合物，以去除任何非特异性相互作用。最后一步是从树脂中洗脱蛋白质复合物。最终，HaloTag 下拉实验可用于从哺乳动物系统中分离并发现新的蛋白质相互作用。

我们今天向您展示的方法能够推动功能蛋白质组学领域的关键发现，包括鉴定新的蛋白质相互作用以及确定蛋白质在细胞内的定位。今天进行这些实验操作的是我们的两位高级科学家，Jackie Mendez 和 Alen Beek。首先，针对每种融合蛋白或对照组，准备一个 15 厘米的培养皿，加入 30 毫升细胞悬液，细胞密度为每毫升 3 至 4 × 10⁵ 个细胞，即每种构建体总共 1 至 1.2 × 10⁷ 个细胞。

在37摄氏度、5% CO2条件下孵育细胞18至24小时。孵育结束后，使用目标转染试剂对构建物进行转染。转染后24至48小时，吸除培养基，用20至25毫升冰冻PBS轻柔洗涤细胞层，移除PBS洗涤液后，加入25至30毫升4摄氏度预冷的PBS。

随后，用细胞刮棒轻轻将细胞从培养皿上刮下。待细胞收集至锥形管中后，在4°C条件下以2000 × g离心5到10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀置于-80°C环境中，冷冻时间至少30分钟，最长可至六个月。

对于每个融合蛋白或对照样本，准备18毫升树脂平衡洗涤缓冲液。通过轻轻颠倒试剂瓶的方式混匀树脂，以获得均匀的悬浮液。每次下拉实验，将200微升树脂分装至1.5毫升微量离心管中。

在800 × g条件下离心样品1分钟。离心结束后，小心移去上清液，注意不要扰动管底的树脂。弃去上清液后，向样品中加入800 µL树脂平衡洗涤缓冲液，并通过反复倒置试管数次充分混匀。

在800 × g条件下离心样品2分钟。小心移除并弃去上清液。重复上述步骤两次，共洗涤三次。

解冻细胞沉淀后，将其重悬于300 µL预先配制的哺乳动物裂解缓冲液中，通过反复吹打混匀。然后转移至新的微量离心管中，并加入6 µL 50×蛋白酶抑制剂混合物。

随后，加入三微升 RQ1 DNase，将样品颠倒混匀10分钟。在室温下，通过将样品反复吹打5至10次穿过25或27号针头的注射器来裂解细胞。样品在4°C、14,000 × g条件下离心5分钟后，将澄清的裂解液转移至新离心管中，并置于冰上。

接着，向澄清裂解液中加入 700 微升先前配制的 1×TBS 缓冲液，通过上下吹打充分混匀。从先前准备好的平衡树脂管中移除最后一次洗涤液，注意不要扰动每管底部的树脂。然后向每根管中加入 1 毫升稀释后的裂解液。

将样品在22摄氏度下于试管旋转仪上混匀孵育15分钟。随后，将树脂管在800 × g条件下离心2分钟。弃去上清液后，加入1毫升树脂平衡洗涤缓冲液，手动反复倒置各树脂管数次以充分混匀，然后将树脂管在800 × g条件下再次离心2分钟。上述洗涤步骤重复共三次后，弃去全部洗涤液。

在样品于22摄氏度下孵育5分钟并持续旋转后，向各管中加入1毫升树脂平衡洗涤缓冲液，以800 × g离心树脂管2分钟，并弃去洗涤液。此时，将每份样品的树脂重悬于50微升SDS洗脱缓冲液中。使用自动微型离心管振荡器在室温下振荡30分钟。

在800 × g条件下离心两分钟后，将EITs转移至新的离心管中用于分析。进行Western印迹或银染凝胶时，取5至10微升样品加入SDS变性凝胶中；进行质谱分析时同样使用该方法上样。每份样品保留40微升，于-20 °C保存以备后续分析。对于每种融合蛋白或对照组，将400微升HELOC细胞悬液接种于八孔腔室载玻片的每个孔中，细胞密度为每毫升1×10⁵至2×10⁵个细胞，并使用相应的培养基。

在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞18至24小时后，使用所需的转染试剂进行转染。转染后18至24小时，将TMR配体用适当的细胞培养基按1:200稀释，然后向每孔加入100微升该溶液，并轻轻混匀。接着，将含有配体的转染细胞在37摄氏度、5% CO2条件下继续孵育15分钟。

操作完成后，吸除含有配体的培养基，并替换为500微升不含蛋白融合标签配体的适当培养基，该培养基已预热至37摄氏度。将上述步骤重复两次，共进行三次洗涤。随后将细胞放回培养箱中孵育30分钟。

孵育30分钟后，吸去培养基，并更换为500微升已预热至37摄氏度的适当培养基。随后，根据此图像，在显微镜下使用相应的采集参数，按照halo、BRD four以及halo tag对照表达方案观察细胞。融合蛋白的表达也可通过Western blot检测，使用抗halo tag抗体或针对诱饵蛋白的抗体进行检测。

Halo BRD4 蛋白及对照组的生物学重复样本经银染凝胶分析，显示出高度可重复性，并揭示了与 BRD4 蛋白相互作用的蛋白质。凝胶中 PTFB、CDK9 和 Cyclin T 组分以及 BRD9 蛋白的高丰度，证实了 BRD4 复合物被特异性捕获。凝胶还显示了其他被鉴定为 BRD4 潜在互作蛋白的蛋白质。

作为另一个示例，对 Halo HD one 蛋白进行了复杂的分离操作。在此情况下，使用 TEV 蛋白酶切割 Halo 标签与 HDAC one 之间的连接区域，从而释放出大量 HD one 捕获蛋白。结果如所观察所示。

HD1下拉样品显示出高水平的HD1活性，该活性可被HDA抑制剂SAHA抑制。为进一步证明特异性，使用去乙酰化酶家族抑制剂EX-527时未观察到HDA抑制作用，而仅使用缓冲液时则未检测到信号。转染了Halo-BRD4和Halo-HDAC1的HeLa细胞用TMR进行荧光标记。

配体成像显示，两者均定位于细胞核内，并证明标签未改变其融合蛋白的生理细胞定位。因此，通过该实验流程，可分离目标蛋白及其相互作用伙伴，并利用多种分析方法（如质谱分析和蛋白质印迹）对其进行进一步鉴定与分析。