一个协议，用于基于蛋白质 - 蛋白质相互作用的鉴定 15 N代谢标记，免疫沉淀法，的定量质谱法和亲和调制
2012年9月24日
我们提出了一个快速（的定量免疫共沉淀结合击倒）的方法，前面介绍的区分真假蛋白质 - 蛋白质相互作用的变化。我们的做法是根据 15N代谢标记，ATP，免疫沉淀，并定量质谱的存在/不存在的蛋白质 - 蛋白质相互作用的亲和力的调制。
以下实验的总体目标是鉴定在含有可溶性和膜蛋白的细胞提取物中与给定靶蛋白特异性相互作用的蛋白质。首先，用氮 14 和氮 15 实现衣藻细胞的完全代谢标记，并产生含有和缺乏 TP 的细胞裂解物。可选的交联步骤有助于稳定瞬时蛋白质相互作用。接下来，将细胞裂解物分离成组分，富集不溶性蛋白和膜蛋白，靶蛋白及其特异性相互作用伙伴来自这些组分。
A 对照蛋白和污染蛋白被免疫沉淀并暗示。现在，混合免疫沉淀的蛋白质并三重消化并通过串联 LCMS 分析它们。结果通过显示不同的氮、14 个氮、15 个肽比率（用于与靶蛋白特异性相互作用的蛋白质）和相等的氮来区分真假相互作用伙伴。
目标蛋白、对照蛋白和污染蛋白的 14 氮 15 肽比例。分析蛋白质蛋白质相互作用的首选方法是直接对所选蛋白质与其相互作用进行免疫沉淀。来自细胞提取物的伴侣，其中两者都以天然确认和浓度出现。
然而，当这样做时，也会沉淀出污染蛋白质，主要是因为它们与所使用的抗体相互作用，因为现代质谱仪非常敏感。它们还将明确地识别污染蛋白质，因此无法区分错误与真正的交互伙伴。此处显示的技术克服了这个问题，该技术基于 A TP 状态和定量质谱介导的 15 N 代谢标记免疫沉淀亲和调节。
该技术将由 Stefan SCH Malinger 展示，他是我实验室的高年级博士生。标记细胞 10 代后，将氮 14 和氮 15 标记的衣藻细胞各两等分试样转移到 4G SA 管中，通过离心 Resus 收获，将沉淀悬浮在两毫升冰冷的裂解缓冲液中，并将悬浮液转移到 15 毫升 Falcon 管中，收集剩余的细胞，每个细胞再添加 1 毫升裂解缓冲液。加入 50 μL 25 x 蛋白酶抑制剂和 12.5 μL 1 摩尔氯化镁样品，在冰上超声处理 4 次，20 秒，用于全细胞 ISIS，中间有第 22 次中断用于冷却。
在 SW 41 TI 薄壁管中准备四个 6 毫升蔗糖垫。小心地将整个体积的细胞裂解物放在蔗糖垫上。与裂解、缓冲液和离心平衡，以从膜中分离可溶性蛋白质复合物。
将可溶性蛋白质复合物从梯度顶部转移到四个 15 mL Falcon 管中。确保避免转移部分蔗糖垫。然后向每个样品中加入 10% Triton X 100 至终浓度为 0.5%小心混合并加入裂解缓冲液至总体积为 7 毫升。
用于 SDS 页面和免疫血液分析。将 70 μL 的每种可溶性细胞提取物预留到新鲜的 1.5 mL 锥形管中，并加入 70 μL 的两种 XSDS 样品缓冲液。接下来，丢弃 SW 41 TI 薄壁管中的蔗糖垫，并向每个沉淀中加入 3 毫升裂解缓冲液。
加入 1 毫升 10% tritton X 100 至终浓度为 2%通过超声处理溶解每个沉淀后，加入裂解缓冲液至总体积为 5 毫升并离心。和以前一样，将膜蛋白复合物的顶部部分收获到 15 毫升 falcon 管中。加入含有 2% tritton X 100 的裂解缓冲液，使最终体积为 7 mL。
使用 70 μL 这些样品进行 SDS 页面和免疫血液分析。首先平衡抗体偶联蛋白。浆液珠与两次 4 mL 裂解缓冲液洗涤稀释至 8 mL，然后分装。
将1 毫升悬浮液加入 8 个 15 毫升 falcon 管中，每个管含有来自 TP 填充的可溶性或膜蛋白复合物，以及 TP 耗尽的氮 14 和氮 15 标记的细胞，在 4 摄氏度下在管辊上孵育 2 小时，以沉淀蛋白质复合物，通过离心沉淀珠子， 弃去上清液，在珠子顶部留下少量液体，以防止粘附在塑料壁上的蛋白质污染。将样品转移到新鲜的 1.5 ml 锥形管中，以收集 falcon 管中所有剩余的珠子。向每个涡旋中再加入 0.8 毫升含有 0.1% tritton 的裂解缓冲液，轻轻离心，并将带有残留珠子的缓冲液转移到埃inor管中经过几个洗涤步骤后，将样品在 16、100 倍 G 和 4 摄氏度下离心 15 秒。
首先用普通移液器去除样品上清液。然后用 50 微升 Hamilton 注射器完全去除任何剩余的上清液。向每个样品中加入 100 微升新鲜制备的洗脱缓冲液，并在热混合器中以 800 RPM 的速度孵育，将样品在 16、100 倍 G 和 25 摄氏度下离心 15 秒。
现在使用干净的 50 μL Hamilton 注射器将每个上清液转移到新管中。与之前的样品一样，还要向珠子过程中添加 50 微升洗脱缓冲液，并合并相应的 elates。请记住保留 30 微升的所有样品 EIT 用于 SDS 页面和免疫血液分析。
现在将来自正负 A TP 处理的氮 14 和氮 15 标记的可溶性和膜蛋白的逃避沉淀物混合在一起。然后按照随附手稿中的描述进行还原烷基化和初始高尿素消化。在旋转轮上进行三联文消化至少 16 小时。
在 37 摄氏度。在 16、100 倍 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟，使 tripsin 珠沉淀。将上清液转移到新鲜的 2 毫升 einor 管中。
用 50 微升 20 毫摩尔碳酸氢铵、0.5% 乙酸洗涤旧试管，并与第一上清液混合。为了制备用于脱盐的自制 C 18 吸头，请用注射器针头从 emcor C 18 材料上切下两个圆盘，然后将它们插入 200 微升移液器吸头中。然后在四个 2 mL 规格管的盖子上打孔，并插入吸头，用 50 μL 溶液 B 预处理 C 18 stage 吸头，在 800 G 和 25 摄氏度下离心 3 分钟。
接下来，用 100 微升溶液平衡 C 18 样品台吸头，在 800 G 和 25 摄氏度下离心 3 分钟。再次重复此平衡步骤。继续在 C 18 载物吸头上加载 100 μL 来自三联酶解的样品上清液，在 800 G 和 25 摄氏度下离心 3 分钟。
重复上样色谱柱以完全应用样品上清液。清洗 C 18 阶段吸头后，将胰蛋白酶肽洗脱到装有 50 微升溶液 B 的新鲜 1.5 毫升规格管中，在 800 G 和 25 摄氏度下离心 3 分钟。重复 Elucian 步骤一次，然后在 speed VAC reus 中将肽干燥至完成。
将干燥的肽悬浮在 20 微升溶液 A 中，在冰上孵育至少 1 小时，中间在超声浴离心机中以 16、100 倍 G 和 4 摄氏度孵育 20 分钟，然后将番泻叶涂覆到纳米 C-M-S-MS HSP 70 上。已知热休克蛋白仅在这些氮 14 标记的细胞提取物 hs P 70 B 和 CGE one 中不存在 TP 的情况下与特定的 cos 伴侣和底物相互作用，几乎完全定位于独立于 A TP 状态的可溶性组分。相比之下，CF one β 定位于可溶性和膜富集组分。
由于超声处理从位于 A TP Synthes 的膜中剪切出 CF 一 β 的一部分，因此它用作两种馏分的上样对照。来自氮 14 和氮 15 标记的可溶性提取物的抗 HSP 70 B 抗体沉淀出相似量的 H HSP 70 B，而与 A TP 状态无关。相比之下，从膜级分中沉淀出的低水平 HS P 70 B 蛋白，与 TP 充满级分相比，来自 TP 耗尽的膜级分的量略大，这是 CGE E 对 hs 的预期亲和力。
P 70 B 取决于上下文。没有 CGE 1 与 HS P 70 共沉淀 B.In TP 充满可溶性或膜组分。从 TP 耗尽的可溶性级分和 TP 耗尽的膜级分中与 HS P 70 B 共沉淀的 CGE one 蛋白的量与沉淀的 HSP 70 B 的量定量相关.在质谱分析中也观察到仅在 A DP 状态下 CGE one 与 HS P 70 B 的相互作用。
在本实验中，为缺乏 TP 的氮 14 标记提取物和氮的混合物制备沉淀物，15 种标记提取物含有 A TP。虽然以相同强度检测到 HS P 70 B 肽的重标记形式和轻标记形式，但仅检测到来自 A TP 耗尽提取物的 CGE one 肽的轻标记形式。此处显示了来自互贴标记的可溶性细胞提取物混合物的抗 HS P 70 D DB 沉淀物的相同肽。因此，仅检测到 TP 耗尽提取物中 CGE one 肽的重标记形式，以及轻标记和重标记的 HSP 70 B 肽。
看完这个视频后，您应该对如何进行 coun precipitation 实验和质谱分析的样品制备有一个良好的印象。不要忘记，人类蛋白质（尤其是角蛋白）的污染会干扰您在质谱仪中的预防性测量，因此在执行此程序时，手套、清洁环境和 LCMS 等级区域等安全预防措施至关重要。
概述
本研究提出了一种改进的QUICK方法，利用15N代谢标记来区分真实和假蛋白-蛋白相互作用。该方法结合了ATP调控、免疫沉淀和定量质谱分析。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质组学
背景
- 蛋白-蛋白相互作用对细胞功能至关重要。
- 传统方法常常无法区分真实相互作用和污染物。
- QUICK方法旨在提高这些相互作用的识别准确性。
- 15N代谢标记提高了分析的特异性。
研究目的
- 开发一种能够准确识别特定蛋白相互作用的方法。
- 利用代谢标记改善相互作用伴侣的检测。
- 解决现有免疫沉淀技术的局限性。
所用方法
- 用氮同位素对衣藻细胞进行全面代谢标记。
- 将细胞裂解物分离为可溶和膜蛋白部分。
- 目标蛋白及其相互作用伴侣的免疫沉淀。
- 定量质谱分析用于评估相互作用的肽比率。
主要结果
- 成功区分了真实的相互作用伴侣和污染物。
- 显示了相互作用蛋白的不同氮同位素比率。
- 验证了ATP调控在相互作用分析中的有效性。
- 为未来蛋白相互作用研究提供了一个稳健的协议。
结论
- 改进的QUICK方法显著提高了蛋白相互作用的识别。
- 15N标记结合免疫沉淀提供了一种可靠的方法。
- 这种技术可以应用于各种生物系统以获得更深入的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate identification of specific protein-protein interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. This protocol enhances predictive confidence by distinguishing true interactors from contaminants using 15N metabolic labeling and ATP-dependent affinity modulation. The approach supports reliable assay development and screening readiness in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming specific interactions under defined nucleotide states.
- Operational Value: Reduces false positives in interaction mapping, improving target confidence and pathway clarification.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative evidence of binding specificity and context-dependent interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative peptide ratio data that enables discrimination between specific and nonspecific binding.
- Operational Value: Produces reproducible, label-based readouts compatible with mass spectrometry workflows for assay standardization.
- Scalability: Uses metabolic labeling compatible with large-scale culture systems, supporting consistent reagent preparation across teams.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated in a disease-relevant model system (Chlamydomonas) using a conserved chaperone-cofactor pair, supporting mechanistic insights.
- Mechanistic De-risking: Confirms interaction dependency on nucleotide state (ATP/ADP), reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Alignment: Enables assessment of interaction dynamics that may inform biomarker strategies or functional readouts in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, where interaction specificity informs hit validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by modulating target protein state to isolate condition-specific interactors.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative mass spectrometry outputs that distinguish true signals from background.
- Analytics: Delivers peptide isotope ratio measurements that allow objective comparison of interaction strength across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating interactions in a native-like environment with defined cofactor dependence.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, label-based interaction profiling platform applicable across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from false-positive interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through isotopic labeling and controlled affinity modulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative, context-specific interaction data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated, condition-dependent interaction networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metabolic labeling, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.
- Dependence on instrumentation for LC-MS/MS and isotope ratio analysis.
- Needs standardized protocols for cell labeling, lysis, and fractionation across teams.
- Adaptation considerations for non-microbial or mammalian systems may require optimization of labeling efficiency.
- Practical limitation: ATP modulation efficacy depends on target protein’s known nucleotide-dependent conformational changes.
