Name: 一个协议，用于基于蛋白质 - 蛋白质相互作用的鉴定 15 N代谢标记，免疫沉淀法，的定量质谱法和亲和调制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 学习利用¹⁵N代谢标记、免疫沉淀和定量质谱技术鉴定蛋白质相互作用的方法。该技术通过ATP状态调控亲和力，有效区分真实相互作用与污染蛋白，适用于Chlamydomonas细胞的可溶性和膜蛋白组分分析。

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我们感谢Olivier Vallon提供针对CF1β的抗血清。本工作由马克斯·普朗克学会以及德国研究基金会（Schr 617/5-1）和德国联邦教育与研究部（系统生物学计划FORSYS，项目GoFORSYS）的资助支持。

1. 抗体吸附
<ol>
	<li>在15 ml锥形管（Falcon）中称取120 mg Protein A Sepharose。由于每次免疫沉淀（IP）需要15 mg Protein A Sepharose，此量足够进行8次IP。加入5 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4），于4 °C孵育30分钟，使Protein A Sepharose充分溶胀。</li>
</ol>
（注意：从这一步开始的所有操作均需佩戴手套，以避免角蛋白污染，并在冰上进行，以防止蛋白质降解或复合物解离。）
<ol start="2">
	<li>在 1,000 × g 和 4 °C 条件下离心 60 秒，使膨胀的 Protein A Sepharose 沉淀。小心弃去上清液，并将珠粒重悬于 5 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。重复此步骤三次，以充分洗涤珠粒。</li>
	<li>最后一次离心后，弃去上清液，保留约 0.5 ml 磷酸盐缓冲液。加入 0.9 ml 0.5 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、400 μl 针对目标蛋白（此处为 HSP70B）的亲和纯化一抗（每项免疫沉淀使用 50 μl），以及 16 μl 针对对照蛋白（此处为 CF1β）的抗体。用 ddH2O 补充至总体积为 5 ml。</li>
</ol>
（注意应使用亲和纯化的抗体，以减少非特异性IgG的污染，因为这些IgG会干扰纳米液相色谱-质谱分析——相关实验方案参见Willmund等（2005）10。CF1β被用作上样对照，因其含量丰富，且在细胞裂解后存在于可溶性组分和膜组分中。或者，也可利用污染蛋白的水平来校正上样量的不均一性。）
<ol start="4">
	<li>将 Protein A Sepharose 珠子在 25 °C 下于管式滚轴混合仪（CAT RM5W，36 rpm）上孵育 1 小时，使其吸附 IgG。</li>
	<li>在 1,000 × g 和 4 °C 条件下离心 60 秒，沉淀 Protein A Sepharose 珠子。小心弃去上清液，并将珠子重悬于 5 ml 0.1 M 硼酸钠缓冲液（pH 9.0）中。重复此步骤三次，以彻底去除会淬灭交联剂的胺类物质。</li>
	<li>称取 25.9 mg 新鲜的固体二甲基戊二咪酯，溶于 5 ml 0.1 M 硼酸钠缓冲液（pH 9.0）中，得到终浓度为 20 mM 的溶液。将该溶液加入 Protein A Sepharose 珠子中。</li>
	<li>在 25 °C 下于管式滚轴混合仪上孵育 30 分钟，使 IgG 与 Protein A 发生交联。</li>
	<li>在 1,000 × g 和 4 °C 条件下离心 60 秒，沉淀珠子。小心弃去上清液，并将珠子重悬于 5 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）中以淬灭未反应的交联剂。重复此步骤一次，并在 25 °C 下孵育 2 小时，或在 4 °C 下孵育 12–24 小时（使用管式滚轴混合仪）。</li>
	<li>可选：若偶联了 IgG 的 Protein A Sepharose 珠子不立即用于免疫沉淀（IP），可保存最多一周。此时，在 1,000 × g 和 4 °C 条件下离心 60 秒沉淀珠子，小心弃去上清液，将珠子重悬于含 0.02% 叠氮化钠的 5 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中，4 °C 保存至后续使用。</li>
</ol>
2. 细胞裂解、交联和样品制备
<ol>
	<li>在含有 7.5 mM 的培养基中培养两份衣藻（Chlamydomonas）培养物 14NH4氯或 15NH4Cl 作为氮源，密度约为 5 x 106 细胞/毫升。细胞需经过至少十个世代的培养才能实现完全标记。此处，细胞在TAP培养基中进行光混合营养培养。11 在旋转摇床中 25 °C 在白光持续照射下（30 μE m-2 s-1).</li>
	<li>转移两份等分试样 14N-和 15将N标记的细胞加入四支GSA管中，在4,000 × g离心4分钟以收集细胞 4 °C （每次收获的细胞数量取决于目标蛋白的细胞浓度，需预先通过实验确定，以确保沉淀出足够量的目标蛋白。一个合适的起始点是10）9 每份样品的细胞数， 即，200 ml 培养物，其浓度为 5 x 106 细胞/毫升。 
	仅用于交联： 如果在免疫沉淀（IP）前需要对蛋白质复合物进行交联，则必须洗涤细胞以去除培养基中的胺类物质。为此，将细胞重悬于40 ml预冷的KH缓冲液（20 mM HEPES-KOH（pH 7.2），80 mM KCl）中，并转移至50 ml Falcon管。在1,000 × g条件下离心60秒。 4 °C重复此步骤一次。</li>
	<li>用 2 ml 裂解缓冲液（20 mM HEPES-KOH（pH 7.2），1 mM MgCl₂，10% 甘油，1% Triton X-100，150 mM KCl，1 mM DTT，1× 蛋白酶抑制剂）重悬细胞2，10 mM KCl，154 mM NaCl）预冷至 4 °C 转移到15 ml Falcon管中。用额外的1 ml裂解缓冲液分别收集GSA管中剩余的细胞。加入 50 μl 25倍蛋白酶抑制剂和 12.5 μl 1 M MgCl2 （至终浓度为 3.5 mM）加入各等份样品中。</li>
	<li>添加 150 μl 裂解缓冲液， 12.5 μl 1 M ATP, 833 μl 270 mM 磷酸肌酸和 7 μl 5 μg/μl 肌酸磷酸激酶（终浓度为 2.5 mM ATP、45 mM 磷酸肌酸，以及 7 μg/ml 肌酸磷酸激酶）加入至一份含有 14N-和 15N标记的细胞（这些为含ATP的等分试样）。</li>
	<li>添加 930 μl 裂解缓冲液和 70 μl 1 U/μl 将apyrase加入含有其他等分试样的管中 14N-和 15N标记的细胞（这些为-ATP等分试样）。</li>
	<li>孵育 2 分钟，温度为 25 °C 在管式滚轴仪上孵育，以建立ATP耗竭和ATP恢复状态。如果省略交联步骤，则额外加入1 ml裂解缓冲液。 
	仅用于交联： 如果所研究的蛋白质-蛋白质相互作用是瞬时的，则建议通过交联步骤将其捕获。为此，添加 500 μl 20 mM 二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP）溶于DMSO中（终浓度为2 mM），在超声处理前直接加入各管。</li>
	<li>在冰上超声破碎细胞，每次20秒，共进行四次，每次间隔20秒以冷却样品。（我们使用Bandelin Sonoplus HD2070仪器，配备KE76探头，输出功率设为75%，占空比为60%。使用其他设备、仪器或探头时，需预先确定合适的参数设置，以确保细胞完全裂解并避免样品飞溅。） 
	仅用于交联： 孵育1小时，使蛋白质复合物交联 4 °C 在管式滚轴仪上孵育。交联后，向每根试管中补充 500 μl 1 M 甘氨酸，于管式滚轴仪上再孵育15分钟 4 °C 以淬灭游离交联剂。</li>
	<li>制备四份6 ml蔗糖垫层（20 mM HEPES-KOH（pH 7.2），0.6 M蔗糖），置于SW41 Ti薄壁管（Beckman Coulter货号：344059）中，小心将约5.5 ml的全部细胞裂解液铺加在蔗糖垫层上（用裂解缓冲液平衡），在200,000 × g条件下离心30分钟 4 °C 在SW41 Ti转子中。</li>
	<li>将含有可溶性蛋白质复合物的梯度上层转移至四个15 ml Falcon离心管中（避免转移蔗糖垫部分），加入 350 μl 向每份样品中加入10% Triton X-100，使其终浓度为0.5%，轻轻混匀，再加入裂解缓冲液至每份总体积为7 ml。 
	（转移 70 μl 将每种可溶性细胞提取物加入新的1.5 ml锥形管（Eppendorf管）中，并加入 70 μl 2× SDS上样缓冲液（4% SDS，125 mM Tris-HCl（pH 6.8），20%甘油，10% 2-巯基乙醇），用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。</li>
	<li>弃去蔗糖垫，将膜沉淀物分别重悬于 3 ml 裂解缓冲液中。向每个样品中加入 1 ml 10% Triton X-100，使其终浓度为 2%，冰上超声处理以溶解沉淀物，再用裂解缓冲液补至终体积 5 ml。</li>
	<li>在SW41 Ti薄壁管中制备另外四份6 ml蔗糖垫，小心地将步骤2.10中获得的约5 ml溶解膜样品加至蔗糖垫上，于200,000 × g离心30分钟 4 °C 在SW41 Ti转子中。</li>
	<li>将含有膜蛋白复合物的梯度上层转移至四个15 ml Falcon离心管中，每管加入裂解缓冲液（含2% Triton X-100），使最终体积为7 ml。 （转移 70 μl 将每份可溶性细胞提取物转移至新的离心管中，并加入 70 μl 每份样品加入2倍体积的SDS上样缓冲液，用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。</li>
</ol>
3. 免疫沉淀
<ol>
	<li>将含有偶联抗体的Protein A Sepharose珠（来自步骤1.8或1.9）在1,000 × g、4 °C条件下离心60秒，沉淀珠子，小心移除上清液，并用4 ml裂解缓冲液重悬珠子。重复此步骤两次，使珠子在裂解缓冲液中充分平衡。</li>
	<li>用裂解缓冲液补足至8 ml，并将1 ml悬浮液分别转移至八个含有来自ATP充足和ATP耗竭的14N-和15N标记细胞的可溶性或膜蛋白复合物的15-ml Falcon管中（来自步骤2.9和2.12）。</li>
	<li>在4 °C条件下，于管式滚转仪上孵育2小时，以沉淀蛋白复合物。</li>
	<li>在1,000 × g、4 °C条件下离心60秒，沉淀珠子，弃去上清液。在珠子表面保留少量液体以便后续转移。</li>
	<li>将每个Falcon管中的珠子转移至1.5-ml锥形管（Eppendorf管）。为收集Falcon管中残留的所有珠子，向每管中加入0.8 ml含0.1% Triton的裂解缓冲液，轻轻涡旋，于1,000 × g、4 °C离心60秒，然后将含有残留珠子的缓冲液转移至Eppendorf管。更换管子是为了防止塑料管壁吸附的蛋白质造成污染。</li>
	<li>在16,100 × g、4 °C条件下离心15秒，沉淀珠子，小心移除上清液，并用1.3 ml含0.1% Triton的裂解缓冲液重悬珠子。使用含Triton的裂解缓冲液洗涤两次，再使用不含Triton的裂解缓冲液洗涤两次，以彻底清洗珠子。每次洗涤后在珠子表面保留少量液体以便转移。</li>
	<li>再次将珠子转移至新的1.5-ml Eppendorf管，以去除吸附在塑料管壁上的蛋白质。用1 ml不含Triton的裂解缓冲液冲洗原管，并将所有残留珠子转移至新管中。</li>
	<li>在16,100 × g、4 °C条件下离心15秒，先用普通移液器移除上清液，再用50-μl Hamilton注射器彻底清除残留的上清液。</li>
</ol>
4. 纳流液相色谱-串联质谱样品制备
<ol>
	<li>向每支试管中加入 100 μl 新鲜配制的洗脱缓冲液（8 M 尿素，25 mM NH4HCO3），用 100 μl 洗脱缓冲液冲洗粘附在 Hamilton 移液器上的珠子，并在恒温混匀仪中以 800 rpm 转速、65 °C 条件下孵育 10 分钟，随后在 30 °C 条件下继续孵育 20 分钟。（使用 2% SDS 洗脱并随后用 80% 丙酮沉淀，可实现更完全的结合蛋白洗脱。）</li>
	<li>在 16,100 × g 转速、25 °C 条件下离心 15 秒。使用 50-μl Hamilton 移液器将上清液转移至新的试管中。</li>
	<li>向珠子中加入 50 μl 洗脱缓冲液，用该 50 μl 洗脱缓冲液冲洗粘附在 Hamilton 移液器上的珠子，并分别重复步骤 4.1 和 4.2 的孵育和离心操作。合并相应的洗脱液。 
	（取 30 μl 洗脱液转移至新的离心管中，每管加入 30 μl 2× SDS 上样缓冲液，用于 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。）</li>
	<li>将经 +ATP 和 -ATP 处理的、14N 和 15N 标记的可溶性及膜蛋白洗脱沉淀物按以下方式组合： 
	120 μl 15N/+ATP 与 120 μl 14N/-ATP 
	120 μl 14N/+ATP 与 120 μl 15N/-ATP 
	120 μl 15N/+ATP 与 120 μl 14N/-ATP 
	120 μl 14N/+ATP 与 120 μl 15N/-ATP</li>
	<li>向上述四种组合中各加入 1.5 μl 新鲜配制的 1 M DTT，使终浓度达到 6.5 mM，以还原二硫键（包括交联剂中的二硫键），并在 25 °C 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>向各管中加入 10.5 μl 新鲜配制的 0.6 M 碘乙酰胺，使终浓度为 25 mM，用于羧甲基化还原后的巯基，并在避光条件下于 25 °C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>加入 256 μl 40 mM NH4HCO3 和 4 μl Lys-C（0.1 μg/μl），用封口膜密封试管，并在 37 °C 条件下的旋转仪上孵育至少 16 小时（过夜）。</li>
	<li>加入 470 μl 20 mM NH4HCO3、10 μl 100% 乙腈（终浓度为 1%）和 8 μl 胰蛋白酶珠，于 37 °C 旋转仪上孵育至少 16 小时。</li>
	<li>在 16,100 × g 转速、4 °C 条件下离心 5 分钟，将上清液转移至新的 2-ml 离心管中。用 50 μl 20 mM NH4HCO3、0.5% 乙酸洗涤原试管，并将洗涤液与第一次上清液合并。</li>
	<li>为进行脱盐处理，使用注射器针头从 Empore C18 材料上切下两个圆片，插入 200-μl 移液枪头中，自制 C18-StageTips。按此方法制备四个 200-μl 枪头。在四个 2-ml 离心管盖上打孔，并插入上述枪头。</li>
	<li>用 50 μl 溶液 B（80% 乙腈，0.5% 乙酸）预处理 C18-StageTips，在 800 g 转速、25 °C 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>用 100 μl 溶液 A（0.5% 乙酸，2% 乙腈）平衡 C18-StageTips，在 800 g 转速、25 °C 条件下离心 3 分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>将胰蛋白酶消化后的上清液（步骤 4.9）100 μl 加载至 C18-StageTips 上，在 800 g 转速、25 °C 条件下离心 3 分钟。重复此操作，直至全部上清液均加载至柱上。</li>
	<li>用 100 μl 溶液 A 洗涤 C18-StageTips，在 800 g 转速、25 °C 条件下离心 3 分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>用 50 μl 溶液 B 将胰蛋白酶肽段洗脱至新的 1.5-ml 离心管中，在 800 g 转速、25 °C 条件下离心 3 分钟。重复此步骤一次。使用真空浓缩仪将肽段完全干燥。</li>
	<li>可选：用封口膜密封离心管，并于 -80 °C 保存，以备后续使用。</li>
	<li>用 20 μl 溶液 A 重悬干燥的肽段，在冰上孵育至少 1 小时，期间在超声水浴中进行两次、每次 15 分钟的间歇超声处理。在 16,100 × g 转速、4 °C 条件下离心 20 分钟，将上清液用于 nano-LC-MS/MS 分析。</li>
</ol>
5. 代表性结果
如图2A中14N标记的细胞提取物所示，HSP70B和CGE1几乎完全定位于可溶性组分，且不受ATP状态影响。相比之下，CF1β存在于可溶性组分和膜富集组分中，因为超声处理会将部分位于膜上的CFo剪切下来，因此CF1β可作为这两个组分的上样对照。如图2B所示，在有或无ATP的条件下，从14N和15N标记的可溶性提取物中，用抗HSP70B抗体沉淀出的HSP70B量相近。相反，从膜组分中沉淀出的HSP70B极少，且ATP耗竭组分中沉淀出的量略高于ATP充足组分，该结果与先前研究结果一致9。在ATP充足的可溶性或膜组分中，未检测到CGE1与HSP70B共沉淀；而在ATP耗竭的可溶性组分中，大量CGE1与HSP70B共沉淀，仅少量来自ATP耗竭的膜组分。
CGE1 仅在 ADP 状态下与 HSP70B 相互作用的现象也在质谱分析中得到证实：图 3 展示了从可溶性细胞提取物中使用 HSP70B 抗血清沉淀后获得的 HSP70B 和 CGE1 肽段的代表性 MS1 谱图。图 3A 所示实验中，沉淀物来自含有 14N 标记但无 ATP 的提取物与含有 15N 标记并添加 ATP 的提取物的混合物。结果显示，HSP70B 肽段的重链和轻链标记形式检测到的信号强度相等，而 CGE1 肽段仅检测到轻链标记形式（来自无 ATP 的提取物）。图 3B 展示了反向标记的可溶性细胞提取物混合后，抗 HSP70B 沉淀中相同肽段的结果。此次仅检测到 CGE1 肽段的重链标记形式（来自无 ATP 的提取物），而 HSP70B 肽段则再次同时检测到轻链和重链标记形式。
<img alt="带有ATP、ADP标记、CoIP和LC-MS/MS鉴定过程的蛋白质纯化示意图。" src="/files/ftp_upload/4083/4083fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程。 细胞经14N和15N代谢标记至少10代后收获，并在有或无ATP的条件下进行处理。细胞裂解后，蛋白质复合物可选择性地使用DSP进行交联（X-link）。裂解物随后被分离为可溶性（Sol）和膜富集（Pel）组分。靶蛋白（此处为HSP70B）和对照蛋白（此处为CF1β）利用与蛋白A-Sepharose微珠偶联的特异性抗体（黑色）进行免疫沉淀。洗涤后，沉淀的蛋白质可直接通过免疫印迹分析，或分别将+ATP和-ATP状态下的14N和15N标记组分混合，经酶解后通过纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）分析。在本示例中，15N标记组分处于无ATP条件。因此，对照蛋白（CF1β）、靶蛋白（HSP70B）以及非特异性结合杂质的重标记肽段（深色）与轻标记肽段（浅色）的强度比应接近于1，而与靶蛋白特异性相互作用的蛋白（CGE1）该比值则预期显著升高。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4083/4083fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="蛋白质表达分析、Western blot结果、ATP对样品中αHSP70B、αCGE1、αCF1β的影响。" src="/files/ftp_upload/4083/4083fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. A HSP70B免疫沉淀输入样品分析。 从去除了ATP（-ATP）或添加了ATP及ATP再生系统（+ATP）的可溶性（Sol）和膜组分富集（Pel）提取物中提取总蛋白。取0.01%的蛋白提取物在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并通过免疫印迹分析HSP70B和CGE1蛋白水平，以加载对照CF1β为参照。 B 免疫沉淀物分析。 从含有或不含ATP的14N-和15N标记的可溶性及膜组分富集的细胞提取物中免疫沉淀HSP70B。取相当于免疫沉淀物3.3%的蛋白量在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过免疫印迹分析HSP70B和CGE1蛋白水平，以加载对照CF1β为参照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4083/4083fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="HSP70B 和 CGE1 与同位素标记 ATP 的蛋白质-配体相互作用的质谱图。" src="/files/ftp_upload/4083/4083fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 来自抗 HSP70B 免疫沉淀物的 HSP70B 和 CGE1 肽段的代表性质谱图，实验在混合可溶性组分（14N-ATP/15N+ATP）中进行。 显示了来自 HSP70B 及共免疫沉淀的 CGE1 的 14N 和 15N 标记肽段的完整质谱图，分别对应于 -ATP 和 +ATP 状态。两个肽段均为三价离子，HSP70B 肽段含有 22 个氮原子，CGE1 肽段含有 19 个氮原子，对应的质荷比（m/z）位移分别为 7.33 和 6.33。 B 反向实验（14N+ATP/15N-ATP）的代表性质谱图。 显示了相同的 14N 和 15N 标记肽段的完整质谱图，此处分别对应于 +ATP 和 -ATP 状态，来自 HSP70B 及共免疫沉淀的 CGE1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4083/4083fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。

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<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

我们最近对 QUICK 方法提出了两项改进：引入交联步骤以捕获瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用（QUICK-X），以及增加对照沉淀步骤以校正沉淀效率的差异6。本文介绍包含另外两项改进的 QUICK 实验方案：首先，我们以15N代谢标记替代SILAC5标记。其优势在于，当15N以简单的无机盐形式提供时，15N代谢标记的成本远低于SILAC。此外，采用15N代谢标记后，QUICK 方法可应用于所有氨基酸均为原养型的生物体，例如大多数植物、真菌和细菌。最后，SILAC固有的精氨酸向脯氨酸转化问题5,6在15N标记肽段的定量中不再构成干扰。适用于15N蛋白质组学数据定量分析的工具示例包括 MSQUANT12 或 IOMIQS13。
其次，我们引入亲和力调节作为一种方法，用于特异性地减少一种样品中与给定靶蛋白相互作用的蛋白量，相对于另一样品。该方法的优势在于避免了构建基因敲低突变体，而对某些模式系统而言，这类突变体难以构建，尤其当靶蛋白为必需蛋白时则根本无法构建。此外，该方法避免了因细胞对靶蛋白敲低产生应答而导致的蛋白表达差异所引起的误判：如果其他蛋白也发生下调，并且与免疫沉淀所用抗血清发生交叉反应，则可能被误判为靶蛋白的真实互作蛋白。最后，亲和力调节消除了寻找合适抗体与抗原比例的需要。
尽管我们将本实验方案以Chlamydomonas reinhardtii作为模式生物进行应用，但该方法可轻松适用于任何可在细胞培养中生长并能够利用铵盐或硝酸盐作为氮源的其他生物体。通过ATP/ADP对蛋白质复合物亲和力的调控，可直接应用于其他与底物及协作蛋白的相互作用依赖于ATP状态的分子伴侣系统，例如GroEL/HSP60/Cpn60或HSP90分子伴侣系统14,15，或任何其他由ATP调节结合亲和力的系统。对于某些特定药物可改变蛋白质相互作用亲和力的情况，该方法也应适用，例如在HSP90系统中，雷帕霉素（radicicol）或格尔德霉素（geldanamycin）的作用情形15。
本方案的一个明显局限性是需要针对已知对特定处理/药物敏感的目标蛋白的亲和纯化抗体，该处理/药物可调节该蛋白与其相互作用蛋白的亲和力。因此，该方法不属于高通量方法。

<table><tbody><tr><td>ProteinA Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3391</td><td></td></tr><tr><td>DMP（戊二酰亚胺二甲酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8388</td><td>置于干燥环境中，-20 &amp;deg;C 保存，使用前直接溶解</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（完全型，无EDTA）</td><td>Roche Applied Science</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>ATP（腺苷-5'-三磷酸）</td><td>Carl Roth</td><td>K054</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7886</td><td></td></tr><tr><td>DSP（二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯]）</td><td>Thermo Sientific</td><td>22585</td><td>置于干燥环境中，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C（内肽酶 &lt;br/&gt; Lys-C）</td><td>Roche Applied Science</td><td>11047825001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶磁珠（Poroszyme 固定化胰蛋白酶）</td><td>Applied Biosystems</td><td>2-3127-00</td><td>使用前充分振荡混匀</td></tr><tr><td>Empore C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 47 mm 圆盘</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于15n代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

蛋白质-蛋白质相互作用在细胞的许多生物学过程中起着基础性作用。因此，对其特性的表征在当前研究中具有重要意义，并已有大量方法可用于此类研究1。蛋白质-蛋白质相互作用通常具有高度动态性，并可能依赖于亚细胞定位、翻译后修饰以及局部蛋白质环境2。因此，应在自然环境中对其进行研究，而共免疫沉淀（co-immunoprecipitation）方法正是首选策略3。共沉淀的相互作用伙伴可通过靶向性的免疫印迹法，或非靶向性的质谱分析（LC-MS/MS）进行鉴定。后一种策略常因假阳性发现过多而受到不利影响，这主要源于现代质谱仪的高度敏感性，能够可靠地检测到非特异性沉淀蛋白质的微量痕迹。最近一种克服该问题的方法基于如下设想：当目标蛋白的细胞内浓度因RNA干扰（RNAi）而降低时，与其特异性结合的相互作用伙伴共沉淀的量也会相应减少，而非特异性沉淀的蛋白质的量则应不受影响。这一方法被称为QUICK（定量免疫沉淀联合敲低，QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown）4，它结合使用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（SILAC）5和质谱法，对来自野生型和敲低株系的免疫沉淀蛋白进行定量分析。在1:1比例下检测到的蛋白质可被视为污染物，而在野生型沉淀物中富集的蛋白质则可视为目标蛋白的特异性相互作用伙伴。尽管QUICK方法具有创新性，但仍存在一些局限性：首先，SILAC成本较高，且仅适用于理想情况下对精氨酸和/或赖氨酸营养缺陷的生物体。此外，当使用重链精氨酸喂养时，精氨酸向脯氨酸的转化会导致肽段中每个脯氨酸产生额外的质量偏移，并使重链精氨酸中混入少量轻链精氨酸，从而使定量过程更加繁琐且准确性降低5,6。其次，QUICK方法要求抗体的滴定需达到在敲低突变体提取物中不会因目标蛋白过量而导致饱和的程度。
本文介绍了一种改进的 QUICK 方法，该方法通过使用15N 代谢标记替代 SILAC，并通过亲和力调控蛋白-蛋白相互作用替代 RNAi 介导的基因敲低，从而克服了上述 QUICK 方法的局限性。我们以单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii为模式生物，以叶绿体分子伴侣 HSP70B 为目标蛋白，验证了该方法的适用性7（图 1）。已知 HSP70 家族蛋白仅在 ADP 结合状态下与特定的共伴侣蛋白及底物发生相互作用8。我们利用这一特性，验证 HSP70B 与其核苷酸交换因子 CGE1 的特异性相互作用9。

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

蛋白质-蛋白质相互作用对细胞内的许多生物学过程至关重要。因此，对其特征的表征在……中具有重要作用。

以下实验的总体目标是鉴定在含有可溶性蛋白和膜蛋白的细胞提取物中与特定靶蛋白特异性相互作用的蛋白质。首先，利用氮-14和氮-15对衣藻细胞进行完全代谢标记，并制备含有或不含靶蛋白（TP）的细胞裂解液。一个可选的交联步骤有助于稳定短暂的蛋白质-蛋白质相互作用。接着，将细胞裂解液分离成不同组分，富集不溶性蛋白和膜蛋白，从中分离靶蛋白及其特异性相互作用伴侣。对照蛋白和污染蛋白被免疫沉淀并洗脱。现在，将免疫沉淀的蛋白混合后进行三重消化，并通过串联液相色谱-质谱（LCMS）进行分析。该结果通过显示与目标蛋白特异性相互作用的蛋白具有不同的氮同位素（14氮和15氮）肽段比例，而其他蛋白的氮同位素比例相等，从而区分了真实的与假的相互作用蛋白伙伴。目标蛋白、对照蛋白及污染蛋白的14个氮15标记肽段比例。分析蛋白质-蛋白质相互作用的首选方法是：从细胞提取物中直接免疫沉淀目标蛋白及其相互作用伴侣，两者均处于天然构象和浓度下。然而，在此过程中，与所用抗体相互作用的污染性蛋白质也会被沉淀，这主要是因为现代质谱仪极为敏感。它们将明确鉴定出这些污染性蛋白质，从而无法区分真正的相互作用蛋白与污染物。该问题可通过本方法解决，该技术基于15N代谢标记免疫沉淀亲和力调控（此处由ATP状态介导）及定量质谱分析。该技术将由我实验室的高级博士生Stefan SCH Malinger进行演示。在对细胞标记10代后，分别取氮14和氮15标记的衣藻细胞各两份等分试样，转移至4G SA管中，通过离心收集细胞，将沉淀重悬于2毫升预冷的裂解缓冲液中，并将悬液转移至15毫升Falcon管中，再用额外的1毫升裂解缓冲液分别收集残留细胞至每个Eloqua中。每管加入50微升25倍蛋白酶抑制剂和12.5微升1摩尔氯化镁，将样品在冰上超声处理四次，每次20秒，中间间隔22秒以冷却，确保细胞完全裂解。在SW 41 TI薄壁管中制备四份6 mL蔗糖垫。将细胞裂解液的全部体积小心地铺在蔗糖垫上。用裂解缓冲液平衡后离心，以分离可溶性蛋白复合物与膜组分。将梯度顶部的可溶性蛋白质复合物转移至四个15毫升的Falcon离心管中，注意避免转移蔗糖垫的部分。然后向每个样品中加入10% Triton X-100，使其终浓度达到0.5%，轻柔混匀，并加入裂解缓冲液至总体积为7毫升。用于SDS凝胶电泳和免疫印迹分析。将每份可溶性细胞提取物各取70 µL，置于新的1.5 mL离心管中，并加入70 µL的2×SDS上样缓冲液。接着，弃去SW 41 TI超速离心管中的蔗糖垫，向每份沉淀中加入3 mL裂解缓冲液。加入一毫升10%的Triton X-100，使其终浓度为2%。每个沉淀经超声溶解后，加入裂解缓冲液至总体积为五毫升，然后离心。与之前相同，将膜蛋白复合物的上清部分收集至15毫升的Falcon管中。加入含有2% Triton X-100的裂解缓冲液，使总体积达到七毫升。使用 70 微升这些样品进行 SDS 凝胶电泳和免疫印迹分析。首先用裂解缓冲液将抗体偶联的蛋白珠平衡，用 2 次 4 毫升的裂解缓冲液洗涤，稀释至 8 毫升后分装。将1毫升悬浮液分别加入八个含有可溶性或膜蛋白复合物的15毫升Falcon管中，这些蛋白复合物来源于氮14和氮15标记的TP充足和TP缺失的细胞，于4°C在试管滚转仪上孵育两小时，以沉淀蛋白复合物。通过离心收集珠粒，弃去上清液，仅保留少量液体覆盖在珠粒表面，以防止蛋白质黏附到塑料管壁造成污染。将样品转移至新的1.5毫升锥形管中，以回收Falcon管中残留的所有珠粒。向每个样品中加入0.8毫升含有0.1% Triton的裂解缓冲液，轻轻涡旋，短暂离心后，将含有残留珠粒的缓冲液转移至Eppendorf管中。经过数次洗涤步骤后，在4°C下以16,100 × g离心15秒。首先使用普通移液器移除样品的上清液，然后用50微升Hamilton注射器彻底移除残留的上清液。向每个样品中加入100微升 freshly prepared洗脱缓冲液，在恒温混匀仪中以800 RPM孵育，并在16,100 ×g、25°C条件下离心15秒。现在使用洁净的50微升Hamilton注射器将每个上清液转移至新的离心管中。同时，向珠子中加入50微升洗脱缓冲液，操作方式与之前样品相同，并收集相应的洗脱液。请记得为所有样品的EITs保留30微升，用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。将经ATP处理和未处理的氮14与氮15标记的可溶性及膜蛋白的洗脱沉淀合并，然后按照随附文稿中所述进行还原烷基化以及初始高浓度尿素消化。接着在旋转摇床中进行三联消化，时间至少为16小时。在 37 摄氏度下。将胰蛋白酶磁珠在 4 摄氏度、16,100 ×g 条件下离心 5 分钟，收集沉淀。将上清液转移至新的 2 毫升离心管中。用 50 微升 20 毫摩尔碳酸氢铵、0.5% 乙酸洗涤旧管，并与第一次的上清液合并。为制备用于脱盐样品的自制 C18 小柱，用注射器针头从 Emcor C18 材料上切下两个圆片，插入 200 微升移液枪头中。然后在四个 2 毫升 Eppendorf 管的管盖上打孔，插入上述小柱，用 50 微升溶液 B 对 C18 固相萃取小柱进行预处理，在 800 ×g、25 °C 条件下离心 3 分钟。接下来，用 100 微升溶液平衡 C 18 阶段小柱，于 800 × g 离心 3 分钟，温度为 25 摄氏度。重复此平衡步骤一次。随后，将三联消化所得的样品上清液 100 微升上样至 C 18 阶段小柱，于 800 × g 离心 3 分钟，温度为 25 摄氏度。重复上样以确保样品上清液完全加载到柱中。用C18层析小柱洗涤后，加入50微升溶液B，将胰蛋白酶消化的肽段洗脱至新的1.5毫升离心管中，在800 ×g、25°C条件下离心3分钟。重复洗脱步骤一次，然后在真空浓缩仪中将肽段完全干燥。将干燥的多肽悬浮于20 µL溶液A中，冰上孵育至少1小时，期间在超声水浴中进行两次15分钟的间歇处理，随后在16,100 × g、4 °C条件下离心20分钟，并将Senna应用于纳米C-M-S-M-S HSP 70。已知热休克蛋白仅在无ATP条件下与特定的共伴侣蛋白和底物相互作用；在这些氮-14标记的细胞提取物中，hsP70B和CGE1几乎完全定位于可溶性组分，且不受ATP状态影响。相比之下，CF1β则同时定位于可溶性组分和膜富集组分。由于超声处理会将部分CF1β从膜结合的ATP合酶上剪切下来，因此可作为两种组分的上样对照。无论ATP状态如何，使用抗HSP70B抗体从¹⁴N和¹⁵N标记的可溶性提取物中沉淀出的HSP70B蛋白量相近。相比之下，从膜组分中沉淀出的HSP70B蛋白水平较低，且与ATP充足的膜组分相比，ATP耗竭的膜组分中沉淀出的HSP70B蛋白略多，这与CGE1对HSP70B亲和力的预期相符。P 70 B 的作用具有上下文依赖性。在 TP 充足的可溶性或膜组分中，未观察到 CGE 1 与 HS P 70 B 共沉淀。在 TP 耗尽的可溶性组分和 TP 耗尽的膜组分中，与 HS P 70 B 共沉淀的 CGE 1 蛋白量与沉淀出的 HSP 70 B 量呈定量相关。通过质谱分析也观察到，CGE 1 仅在 ADP 状态下与 HS P 70 B 发生相互作用。在本实验中，制备了不含三磷酸腺苷（TP）和氮-14标记提取物与含三磷酸腺苷（A TP）和氮-15标记提取物的混合物。热休克蛋白70B（HSP 70 B）肽的重链和轻链标记形式以相等强度被检测到，而仅在A TP耗竭的提取物中检测到CGE一肽的轻链标记形式。此处显示的是由相互标记的可溶性细胞提取物混合物获得的抗HSP 70 D DB沉淀中的相同肽段。相应地，在TP耗竭的提取物中仅检测到CGE一肽的重链标记形式，同时检测到HSP 70 B肽的轻链和重链标记形式。观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何开展用于质谱分析的共沉淀实验及样品制备。请注意，人体蛋白（尤其是角蛋白）的污染会干扰质谱仪中的蛋白质检测结果，因此在操作过程中采取手套、洁净环境以及使用液相色谱-质谱专用区域等安全预防措施至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个协议，用于基于蛋白质 - 蛋白质相互作用的鉴定<sup&gt; 15</sup&gt; N代谢标记，免疫沉淀法，的定量质谱法和亲和调制

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