一种基于¹⁵N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

以下实验的总体目标是鉴定在含有可溶性蛋白和膜蛋白的细胞提取物中与特定靶蛋白特异性相互作用的蛋白质。首先，利用氮-14和氮-15对衣藻细胞进行完全代谢标记，并制备含有或不含靶蛋白（TP）的细胞裂解液。一个可选的交联步骤有助于稳定短暂的蛋白质-蛋白质相互作用。接着，将细胞裂解液分离成不同组分，富集不溶性蛋白和膜蛋白，从中分离靶蛋白及其特异性相互作用伴侣。

对照蛋白和污染蛋白被免疫沉淀并洗脱。现在，将免疫沉淀的蛋白混合后进行三重消化，并通过串联液相色谱-质谱（LCMS）进行分析。该结果通过显示与目标蛋白特异性相互作用的蛋白具有不同的氮同位素（14氮和15氮）肽段比例，而其他蛋白的氮同位素比例相等，从而区分了真实的与假的相互作用蛋白伙伴。

目标蛋白、对照蛋白及污染蛋白的14个氮15标记肽段比例。分析蛋白质-蛋白质相互作用的首选方法是：从细胞提取物中直接免疫沉淀目标蛋白及其相互作用伴侣，两者均处于天然构象和浓度下。

然而，在此过程中，与所用抗体相互作用的污染性蛋白质也会被沉淀，这主要是因为现代质谱仪极为敏感。它们将明确鉴定出这些污染性蛋白质，从而无法区分真正的相互作用蛋白与污染物。该问题可通过本方法解决，该技术基于15N代谢标记免疫沉淀亲和力调控（此处由ATP状态介导）及定量质谱分析。

该技术将由我实验室的高级博士生Stefan SCH Malinger进行演示。在对细胞标记10代后，分别取氮14和氮15标记的衣藻细胞各两份等分试样，转移至4G SA管中，通过离心收集细胞，将沉淀重悬于2毫升预冷的裂解缓冲液中，并将悬液转移至15毫升Falcon管中，再用额外的1毫升裂解缓冲液分别收集残留细胞至每个Eloqua中。每管加入50微升25倍蛋白酶抑制剂和12.5微升1摩尔氯化镁，将样品在冰上超声处理四次，每次20秒，中间间隔22秒以冷却，确保细胞完全裂解。

在SW 41 TI薄壁管中制备四份6 mL蔗糖垫。将细胞裂解液的全部体积小心地铺在蔗糖垫上。用裂解缓冲液平衡后离心，以分离可溶性蛋白复合物与膜组分。

将梯度顶部的可溶性蛋白质复合物转移至四个15毫升的Falcon离心管中，注意避免转移蔗糖垫的部分。然后向每个样品中加入10% Triton X-100，使其终浓度达到0.5%，轻柔混匀，并加入裂解缓冲液至总体积为7毫升。

用于SDS凝胶电泳和免疫印迹分析。将每份可溶性细胞提取物各取70 µL，置于新的1.5 mL离心管中，并加入70 µL的2×SDS上样缓冲液。接着，弃去SW 41 TI超速离心管中的蔗糖垫，向每份沉淀中加入3 mL裂解缓冲液。

加入一毫升10%的Triton X-100，使其终浓度为2%。每个沉淀经超声溶解后，加入裂解缓冲液至总体积为五毫升，然后离心。与之前相同，将膜蛋白复合物的上清部分收集至15毫升的Falcon管中。加入含有2% Triton X-100的裂解缓冲液，使总体积达到七毫升。

使用 70 微升这些样品进行 SDS 凝胶电泳和免疫印迹分析。首先用裂解缓冲液将抗体偶联的蛋白珠平衡，用 2 次 4 毫升的裂解缓冲液洗涤，稀释至 8 毫升后分装。

将1毫升悬浮液分别加入八个含有可溶性或膜蛋白复合物的15毫升Falcon管中，这些蛋白复合物来源于氮14和氮15标记的TP充足和TP缺失的细胞，于4°C在试管滚转仪上孵育两小时，以沉淀蛋白复合物。通过离心收集珠粒，弃去上清液，仅保留少量液体覆盖在珠粒表面，以防止蛋白质黏附到塑料管壁造成污染。将样品转移至新的1.5毫升锥形管中，以回收Falcon管中残留的所有珠粒。向每个样品中加入0.8毫升含有0.1% Triton的裂解缓冲液，轻轻涡旋，短暂离心后，将含有残留珠粒的缓冲液转移至Eppendorf管中。经过数次洗涤步骤后，在4°C下以16,100 × g离心15秒。

首先使用普通移液器移除样品的上清液，然后用50微升Hamilton注射器彻底移除残留的上清液。向每个样品中加入100微升 freshly prepared洗脱缓冲液，在恒温混匀仪中以800 RPM孵育，并在16,100 ×g、25°C条件下离心15秒。

现在使用洁净的50微升Hamilton注射器将每个上清液转移至新的离心管中。同时，向珠子中加入50微升洗脱缓冲液，操作方式与之前样品相同，并收集相应的洗脱液。请记得为所有样品的EITs保留30微升，用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。

将经ATP处理和未处理的氮14与氮15标记的可溶性及膜蛋白的洗脱沉淀合并，然后按照随附文稿中所述进行还原烷基化以及初始高浓度尿素消化。接着在旋转摇床中进行三联消化，时间至少为16小时。

在 37 摄氏度下。将胰蛋白酶磁珠在 4 摄氏度、16,100 ×g 条件下离心 5 分钟，收集沉淀。将上清液转移至新的 2 毫升离心管中。

用 50 微升 20 毫摩尔碳酸氢铵、0.5% 乙酸洗涤旧管，并与第一次的上清液合并。为制备用于脱盐样品的自制 C18 小柱，用注射器针头从 Emcor C18 材料上切下两个圆片，插入 200 微升移液枪头中。然后在四个 2 毫升 Eppendorf 管的管盖上打孔，插入上述小柱，用 50 微升溶液 B 对 C18 固相萃取小柱进行预处理，在 800 ×g、25 °C 条件下离心 3 分钟。

接下来，用 100 微升溶液平衡 C 18 阶段小柱，于 800 × g 离心 3 分钟，温度为 25 摄氏度。重复此平衡步骤一次。随后，将三联消化所得的样品上清液 100 微升上样至 C 18 阶段小柱，于 800 × g 离心 3 分钟，温度为 25 摄氏度。

重复上样以确保样品上清液完全加载到柱中。用C18层析小柱洗涤后，加入50微升溶液B，将胰蛋白酶消化的肽段洗脱至新的1.5毫升离心管中，在800 ×g、25°C条件下离心3分钟。重复洗脱步骤一次，然后在真空浓缩仪中将肽段完全干燥。

将干燥的多肽悬浮于20 µL溶液A中，冰上孵育至少1小时，期间在超声水浴中进行两次15分钟的间歇处理，随后在16,100 × g、4 °C条件下离心20分钟，并将Senna应用于纳米C-M-S-M-S HSP 70。已知热休克蛋白仅在无ATP条件下与特定的共伴侣蛋白和底物相互作用；在这些氮-14标记的细胞提取物中，hsP70B和CGE1几乎完全定位于可溶性组分，且不受ATP状态影响。相比之下，CF1β则同时定位于可溶性组分和膜富集组分。

由于超声处理会将部分CF1β从膜结合的ATP合酶上剪切下来，因此可作为两种组分的上样对照。无论ATP状态如何，使用抗HSP70B抗体从¹⁴N和¹⁵N标记的可溶性提取物中沉淀出的HSP70B蛋白量相近。相比之下，从膜组分中沉淀出的HSP70B蛋白水平较低，且与ATP充足的膜组分相比，ATP耗竭的膜组分中沉淀出的HSP70B蛋白略多，这与CGE1对HSP70B亲和力的预期相符。

P 70 B 的作用具有上下文依赖性。在 TP 充足的可溶性或膜组分中，未观察到 CGE 1 与 HS P 70 B 共沉淀。在 TP 耗尽的可溶性组分和 TP 耗尽的膜组分中，与 HS P 70 B 共沉淀的 CGE 1 蛋白量与沉淀出的 HSP 70 B 量呈定量相关。通过质谱分析也观察到，CGE 1 仅在 ADP 状态下与 HS P 70 B 发生相互作用。

在本实验中，制备了不含三磷酸腺苷（TP）和氮-14标记提取物与含三磷酸腺苷（A TP）和氮-15标记提取物的混合物。热休克蛋白70B（HSP 70 B）肽的重链和轻链标记形式以相等强度被检测到，而仅在A TP耗竭的提取物中检测到CGE一肽的轻链标记形式。此处显示的是由相互标记的可溶性细胞提取物混合物获得的抗HSP 70 D DB沉淀中的相同肽段。相应地，在TP耗竭的提取物中仅检测到CGE一肽的重链标记形式，同时检测到HSP 70 B肽的轻链和重链标记形式。

观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何开展用于质谱分析的共沉淀实验及样品制备。请注意，人体蛋白（尤其是角蛋白）的污染会干扰质谱仪中的蛋白质检测结果，因此在操作过程中采取手套、洁净环境以及使用液相色谱-质谱专用区域等安全预防措施至关重要。