Name: 生物分子缩合物中蛋白质相互作用动力学的单分子测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习单分子显微成像技术，用于定量研究活细胞中生物分子缩合物内的蛋白质相互作用动力学。该方法可测量无序蛋白在转录调控中的动态行为。

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本研究工作得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：DGE-1745301，S.Y.）、Pew-Stewart 学者奖（S.C.）、Searle 学者奖（S.C.）、Shurl 和 Kay Curci 基金会研究资助（S.C.）、Merkin 创新种子基金（S.C.）、Mallinckrodt 研究基金（S.C.）以及 Margaret E. Early 医学研究信托基金 2024 年资助（S.C.）的支持。S.C. 还获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）资助号 P30CA016042 的资助。

1. 细胞中蛋白质的标记
<ol>
	<li>在目标细胞系中表达与 HaloTag 融合的目的蛋白。</li>
	<li>使用转座子或病毒转导，在与步骤 1.1 相同类型的细胞中稳定表达 Halo 标签标记的 H2B。</li>
</ol>
2. 盖玻片的制备
<ol>
	<li>在将盖玻片用于细胞培养之前，需对其进行清洗以去除自发荧光污染物。
	<ol>
		<li>将直径为 25 mm、#1.5 的盖玻片安装在陶瓷染色架上，并放入聚丙烯容器中。</li>
		<li>将盖玻片完全浸入 1 M 的 KOH 溶液中，超声处理 1 小时。</li>
		<li>用双蒸水（ddH2O）冲洗盖玻片三次。</li>
		<li>将盖玻片完全浸入 100% 乙醇中，超声处理 1 小时。</li>
		<li>将盖玻片完全浸入用双蒸水（ddH2O）稀释的 20% 乙醇中，并在 4 °C 下保存直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 显微镜观察用细胞的制备
注意：为防止细胞污染，本节所有步骤均须在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将细胞接种于已清洁的盖玻片上。若目标 Halo 标签蛋白为瞬时表达，则在成像前 2 天进行此步骤；若 Halo 标签蛋白为稳定表达或内源性表达，则在成像前 1 天进行此步骤。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将盖玻片放入 6 孔板中（每孔放置一片盖玻片，对应一个细胞样本），并让残留的乙醇自然挥发。</li>
		<li>根据成像时达到约 70% 汇合度的要求，向每个孔中接种适当数量的细胞。另设一孔接种稳定表达 H2B-Halo 的细胞，目标汇合度相同。</li>
		<li>仅在瞬时表达目标 Halo 标签蛋白时执行此步骤。将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时，随后使用适当的转染试剂，按照生产商说明书对细胞进行转染，导入编码目标标签蛋白的质粒。</li>
		<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对表达目标 Halo 标签蛋白的细胞，同时使用非光激活型 Halo 配体（例如 JFX549）和光激活型 Halo 配体（例如 PA-JF646）进行染色；对表达 H2B-Halo 的细胞，仅使用光激活型 Halo 配体进行染色。 
	注意：此处列出的 Halo 配体浓度可作为起始参考值；最佳浓度需根据目标蛋白的表达水平及其在凝聚物内的局部浓度进行优化。
	<ol>
		<li>对于每份表达目标 Halo 标签蛋白的细胞样本，将 100 nM JFX549 Halo 配体35 和 20 nM PA-JF646 Halo 配体36 溶于 500 µL 适当的细胞培养基中；对于每份表达 H2B-Halo 的样本，仅将 20 nM PA-JF646 Halo 配体溶于 500 µL 适当的细胞培养基中。</li>
		<li>对每个孔，吸除原有培养基，加入 2 mL 1x PBS，随后吸除 PBS（此操作在本实验方案后续步骤中称为“洗涤”），然后更换为含有相应 Halo 配体的新鲜培养基。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
		<li>用 PBS 洗涤四次，并更换为不含 Halo 配体的新鲜培养基。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 15 分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.2.4 和 3.2.5 共三次（总计完成四轮洗涤-孵育循环）。</li>
		<li>使用无菌镊子将带有细胞的盖玻片转移至适用于显微镜载物台的细胞培养用盖玻片腔室中。</li>
		<li>向腔室内加入不含酚红的培养基，随后开始成像。未立即成像的样品应继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，直至需要时再取出使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 单分子成像
注意：应于多个（≥3）独立日期对 H2B 和目标蛋白的停留时间分别进行独立实验，以获得具有统计学意义的结果。在显微镜下对细胞样本进行成像前，需使用 0.1 µm 染色微球（材料表）或类似的校准标准对两个相机进行校准对齐。
<ol>
	<li>准备显微镜。
	<ol>
		<li>打开显微镜及控制显微镜的计算机。</li>
		<li>开启显微镜上的活细胞培养组件（加热器和 CO2），并将其设置为 37 °C 和 5% CO2。让系统达到平衡。</li>
		<li>在显微镜的 100 倍 TIRF 油浸物镜上滴加一滴适当的镜油，并将细胞样品加载到显微镜载物台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择待成像的细胞。
	<ol>
		<li>在明场照明下对细胞样品进行成像，并调节 z 轴位置，使细胞处于清晰对焦状态。</li>
		<li>选择一个表现出健康细胞形态特征的细胞。</li>
		<li>裁剪视野（FOV），使其仅包含目标细胞的细胞核。</li>
		<li>使用激光照明并调节 TIRF 角度，直至实现单分子信噪比最优的 HILO 照明41。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在活细胞中对 H2B-Halo 进行成像。 
	注意：本节所使用的激光功率针对本实验而设定，仅作示例。应根据讨论部分列出的标准选择合适的激光功率。
	<ol>
		<li>设置如下采集参数：曝光时间为 500 ms。在每次 500 ms 曝光期间，使用 9.1 mW、640 nm 激光激发 PA-JF646 标记的 H2B-Halo 分子。在帧间死时间（本实验所用成像系统的死时间为 158.01 µs）期间，使用 111 µW、405 nm 激光对分子进行光激活。</li>
		<li>在上述设置下连续采集 2000 帧图像。当光激活分子数量不足时，在采集过程中逐步提高 405 nm 激光的功率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在活细胞中对 Halo 标记的目标蛋白进行成像。
	<ol>
		<li>使用长通二向色镜将发射光波长分至两个相机，一个用于检测 PA-JF646，另一个用于检测 JFX549。在相机前使用相应的发射滤光片。</li>
		<li>采用 4.3.1 节所述的相同采集配置，并作如下修改：增加一个 JFX549 通道，用于随时间追踪 Halo 标记蛋白凝聚体的位置。每 10 秒在 JFX549 通道采集一帧图像（500 ms 曝光，2.1 mW，561 nm 激发），同时持续采集 PA-JF646 通道图像。这将导致信号渗漏至 PA-JF646 通道，但将在采集后的数据分析中予以校正。</li>
		<li>在上述设置下连续采集 2000 帧图像。当光激活分子数量不足时，在采集过程中逐步提高 405 nm 激光的功率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单分子成像数据的分析
注意：第5节中使用的参数是针对本实验的，仅作为示例提供。应根据讨论部分列出的标准选择适当的参数。
<ol>
	<li>为数据处理准备原始成像数据。
	<ol>
		<li>对于目标蛋白的数据，使用 ImageJ 或类似的图像处理软件，将原始成像数据文件中的每个通道转换为独立的 .tif 文件。对于 H2B 的数据，以相同方式将单通道原始成像数据文件转换为 .tif 文件。 
		注意：根据所使用的采集软件，凝聚体视频中可能存在空白帧，因为每 10 秒仅采集一帧用于凝聚体追踪。这些空白帧应填充为最近一帧的凝聚体图像（某些采集软件会自动完成此操作）。此外，若在凝聚体追踪帧期间，凝聚体通道（JFX549）对单分子通道（PA-JF646）产生显著串色，则应将相应的单分子帧替换为最近的单分子帧。</li>
		<li>若因上述原因需替换任一视频中的某些帧，请通过修改（如必要）并运行 Chong 等人1 提供的 ImageJ 宏 pretracking_comb.txt，并按照提示操作，用该视频中最近的帧进行替换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用单粒子追踪（SPT）软件（例如 SLIMfast39，即 Teves 等人42 提供的 MTT 算法38 的图形界面实现）生成单粒子轨迹。
	<ol>
		<li>点击 Load &gt; Imagestack，在 SLIMfast 中加载步骤 5.1.2 所得的单分子视频文件。</li>
		<li>点击 OPT &gt; Sheet: Localization，设置定位参数（定位误差率：10-6；迭代去重循环次数：3）。</li>
		<li>点击 OPT &gt; Sheet: Acquisition，设置采集参数（峰值发射波长：664 nm；时间滞后：500 ms）。</li>
		<li>可视化单帧中所有分子的定位结果，以确认所选参数是否合适（TEST LOC）。若不合适，则修改步骤 5.2.2 和 5.2.3 中的参数，并重复此步骤。</li>
		<li>生成包含每帧中所有分子定位信息的文件（LOC ALL）。</li>
		<li>点击 Load &gt; Particle Data &gt; SLIMfast，在 SLIMfast 中加载步骤 5.2.5 所得的文件。</li>
		<li>点击 OPT &gt; Sheet: Tracking，设置轨迹生成参数（最大预期扩散系数：0.1 µm2/s；最大竞争粒子数：5）。</li>
		<li>生成包含所有分子轨迹的文件（GEN TRAJ）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Drosopoulos 等人43 提供的 evalSPT39，过滤掉持续时间短于 tmin（2.5 s）的轨迹，以排除因追踪错误导致的人为短轨迹。
	<ol>
		<li>将步骤 5.2.8 所得文件加载至 evalSPT（+ &gt; 步骤 5.2.8 的文件 &gt; OK）。</li>
		<li>设置参数（min：5 帧；max：步骤 5.2.8 文件的最大轨迹长度），以过滤掉短于 2.5 s 的轨迹。</li>
		<li>生成包含所有过滤后轨迹的文件（EXPORT DATA）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>本步骤仅适用于目标蛋白的轨迹。将轨迹分类为位于凝聚体内部和外部的两类，并提取平均凝聚体内滞留时间。 
	注意：本节所有代码均来自 Chong 等人1。
	<ol>
		<li>对 JFX549 通道采集的视频所有帧进行阈值处理，运行 ImageJ 宏 nucleus 和 cluster mask_v2.txt，并按照提示生成一个时间序列视频，其中包含随时间演化的二值掩膜，用于标示凝聚体的位置。</li>
		<li>使用 MATLAB 脚本 ConvertASCII_SlowTracking_css3.m 重新格式化步骤 5.3.3 所生成的单分子轨迹，并根据需要调整文件名、路径和参数（参数： 曝光时间，0.5 s；空间分辨率，0.16 µm/像素）。</li>
		<li>使用 MATLAB 脚本 categorization_v4.m，根据特定分子在凝聚体中停留时间所占比例 F 对轨迹进行分类，并根据需要调整文件名和路径。</li>
		<li>仅使用位于凝聚体内的轨迹继续后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取 kobs,s 和 kpb ，并计算校正后的平均滞留时间 <img alt="静力平衡，公式 ΣFx=0, ΣFy=0, 图示，受力分析，平衡，工程概念" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 6">。
	<ol>
		<li>使用 MATLAB 脚本 PLOT_ResidenceHist_css.m，并根据需要调整文件名、路径和参数，从目标蛋白在凝聚体内的轨迹中提取 kobs,s。 
		（参数： 曝光时间，0.5 s；拟合起始帧，5 帧）。</li>
		<li>使用 MATLAB 脚本 PLOT_ResidenceHist_css.m，并根据需要调整文件名、路径和参数，从 H2B 轨迹中提取 kpb 。 
		（参数： 曝光时间，0.5 s；拟合起始帧，5 帧）。</li>
		<li>计算目标蛋白特异性结合于其凝聚体时的校正平均滞留时间 <img alt="静力平衡，公式 ΣFx=0, ΣFy=0, 图示，受力分析，平衡，工程概念" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 6">，即 
		<img alt="静力平衡方程 τ̅ₛ=1/(kₒᵦₛ,ₛ−kₚb)；公式，动力学分析，图示。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 7"> 
		注意：应进行对照实验，验证不同曝光时间（只要足够长以模糊移动粒子，例如 300 ms 和 800 ms）仍能得到相同的目标蛋白平均滞留时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Live Cell Single-Molecule Imaging-Based Quantification of Protein Interactions

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在适用于 Irgen-Gioro 等人40研究中所涉及的系统。根据具体应用，该方案的某些组分可进行调整，例如荧光标记细胞系的构建方法、荧光标记系统以及所使用的盖玻片类型。细胞中蛋白的 Halo 标记可通过两种策略实现，具体选择取决于特定实验的适用性。1）外源表达：将目标蛋白与 HaloTag 融合，并通过转染实现瞬时表达，或通过转座子或病毒转导实现稳定表达，将融合蛋白导入目标细胞系。2）基因组编辑：利用基因组编辑技术（如 CRISPR44），在目标细胞系中将 HaloTag 插入编码内源性目标蛋白的基因位点。上述两种策略的优缺点在其他文献中已有讨论45，简而言之，外源表达策略耗时较短，但产生的细胞群体中蛋白表达水平差异较大，且常为非生理水平；而基因组编辑策略耗时较长，但可在天然表达水平下对内源性表达的目标蛋白进行标记。
此外，本方案并不特别要求使用 HaloTag；实际上，它适用于任何能够在细胞内对同一蛋白质同时实现单分子和群体标记的标签。因此，该方案可修改后用于其他自标记标签，例如 SNAP-tag46。最后，可使用经过预清洁的商用细胞培养玻底培养皿（如 MatTek 培养皿（MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C））替代盖玻片腔室，前提是其与显微镜物镜及浸油兼容；然而，盖玻片可在使用前更彻底地进行清洁，因此更推荐使用。
尽管上述对实验方案的修改为可选步骤，但某些实验与分析参数必须进行优化，即 HaloTag 配体的浓度、激光功率、单分子定位与追踪参数，以及 tmin。非光激活型 HaloTag 配体的浓度应选择为使凝聚体被充分标记，以实现掩模生成。光激活型 HaloTag 配体的浓度与光激活激光功率应选择为使蛋白分子被稀疏地标记与光激活，从而获得高质量的单粒子轨迹；若每帧中定位事件过多，将导致轨迹生成不准确。在代表性结果所示实验中，通常每帧的定位事件少于五个。激发激光功率应保持足够低以尽量减少快速光漂白，同时又足够高以实现对单分子的精确定位。单分子定位与追踪参数应根据激发事件的密度以及目标蛋白预期的扩散动力学进行调整。最后，应在一系列 tmin 值（从 0 s 开始，以曝光时间的增量递增）范围内计算 <img alt="static equilibrium, formula ΣFx=0, ΣFy=0, diagram, force analysis, balance, engineering concept" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 6"> 的值。<img alt="static equilibrium, formula ΣFx=0, ΣFy=0, diagram, force analysis, balance, engineering concept" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 6"> 的值应在某个 tmin 阈值以上趋于收敛；该 tmin 应用于步骤 5.3 中。
本文所述方法能够以传统技术无法达到的精度量化蛋白质在凝聚体内的相互作用动态。此外，该方法可在活细胞中实现检测，且对样品的干扰极小。这一点至关重要，因为内在无序区（IDRs）的相互作用行为（包括其形成凝聚体的能力）高度依赖于其局部环境40。
Irgen-Gioro 等人40的研究结果展示了该方法能够提取蛋白质与其自组装的液-液相分离（LLPS）凝聚体结合时的停留时间。重要的是，该方法可轻松扩展至任何蛋白质通过同源或异源相互作用结合各类凝聚体的情况。此外，该方法不仅限于测量发生液-液相分离的蛋白质的相互作用动力学。融合致癌蛋白 EWS::FLI1 被证实可导致尤文肉瘤，其可形成局部高浓度的富集中心（hubs），在转录激活和致癌转化功能中发挥关键作用1,2。尽管这些富集中心的形成由 EWS::FLI1 的瞬时、选择性和多价无序区-无序区（IDR-IDR）相互作用驱动，但迄今为止仍缺乏充分证据表明它们是真正意义上的液-液相分离凝聚体1,2。即便如此，我们仍采用本文所述方法测量了 EWS::FLI1 在其富集中心的平均停留时间，并证明特定残基的突变以及其无序区的缺失会显著削弱 EWS::FLI1 与富集中心的结合稳定性1。
尽管该方法在表征凝聚相中蛋白质结合动力学方面具有广泛的适用性，但在特定情境下选择蛋白质结合模型时应谨慎。现有的生化数据表明，双组分指数分布通常适用于许多系统1,37,40,42，但已有研究也显示，在其他系统中该分布并不适合作为蛋白质结合的表征模型，其中三组分指数分布47,48,49和幂律分布50更符合实验观测结果。为避免得出不准确的结论，应仔细选择并合理论证所采用的模型，验证拟合质量是否支持该模型的使用，并对结果进行审慎解读。

越来越多的研究表明，生物分子凝聚体在细胞组织及多种细胞功能中发挥着重要作用，例如转录调控1,2,3,4,5、DNA损伤修复6,7,8、染色质组织9,10,11,12、X染色体失活13,14,15以及细胞内信号传导16,17,18。此外，生物分子凝聚体的失调与多种疾病相关，包括癌症19,20,21和神经退行性疾病22,23,24,25,26。凝聚体的形成通常由短暂、特异且多价的蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸或核酸-核酸相互作用驱动27。在特定条件下，这些相互作用可导致液-液相分离（LLPS），即在无膜液滴中局部富集特定生物分子的密度转变过程。此类多价相互作用通常由蛋白质的内在无序区域（IDRs）介导1,28,29。鉴于凝聚体在各类生理与病理过程中广泛存在，从分子水平上对这些相互作用进行生物物理表征，对于理解众多正常及异常的细胞功能至关重要。尽管基于共聚焦荧光显微镜的技术（如光漂白后荧光恢复，FRAP）30,31,32已被广泛用于定性展示凝聚体与其周围细胞环境之间的分子交换具有动态性，但常规共聚焦显微镜或单分子显微镜在缺乏专门数据分析方法的情况下，通常无法量化凝聚体内特定生物分子的相互作用动力学。本实验方案中描述的单粒子追踪（SPT）技术基于活细胞单分子显微镜33，为量化凝聚体内特定蛋白质之间的相互作用动力学提供了独特而强大的工具。该测量中SPT的输出结果是目标蛋白在凝聚体中的平均停留时间。
该方案可分为两个部分——数据采集与数据分析。成像数据采集的第一步是在细胞中表达目标蛋白与 HaloTag 的融合蛋白34。这使得目标蛋白可被两种荧光染料标记：其中大部分蛋白分子使用非光激活型荧光染料标记（例如 JFX549 Halo 配体35），而一小部分则使用光谱上可区分的光激活型荧光染料标记（例如 PA-JF646 Halo 配体36）。该策略可实现同时获取细胞内所有凝聚体的位置信息，并记录目标蛋白结合与解离凝聚体的单分子动态影像。与此同时，对同类型的细胞进行改造，使其稳定表达 Halo 标签标记的组蛋白 H2B（H2B-Halo），该蛋白在染色质上基本不移动。随后用 PA-JF646 Halo 配体对细胞染色，以实现 H2B 的单分子成像。如后文将详细讨论，该实验设计可校正光漂白的影响，从而实现对目标蛋白相互作用动力学的精确量化。用于成像实验的细胞需在洁净的盖玻片上培养，经 HaloTag 配体染色后，装入活细胞成像腔室。随后，在具备双通道成像与单分子检测能力的全内反射荧光（TIRF）显微镜上，采用高度倾斜与层流光学片（HILO）照明对样品进行成像。发射光被分束至两台相机，分别用于追踪凝聚体位置和单分子动态。数据采集时采用较长的积分时间（约数百毫秒），以模糊快速自由扩散的蛋白信号，仅保留因结合细胞内稳定结构而移动性较低的蛋白信号37。
数据分析的第一步是使用已建立的单粒子追踪（SPT）算法38,39，在视频的每一帧中定位单个蛋白质分子，并将这些定位结果在其可检测寿命内组装成每条分子的轨迹。随后，通过将分子在其轨迹中的定位位置与相应时间点所有凝聚体的定位位置进行比较，将轨迹分类为位于凝聚体内和凝聚体外的分子轨迹1。
接下来，利用所有凝聚相内轨迹的长度生成生存曲线（1 - CDF）。然后通过将生存曲线拟合到以下双组分指数模型来提取分子的表观平均停留时间，该模型描述蛋白质结合动力学：
<img align="center" alt="蛋白质折叠动力学的指数衰减方程；公式包含衰减常数 k&lt;sub&gt;obsns&lt;/sub&gt;、k&lt;sub&gt;obss&lt;/sub&gt;。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">，
其中 A 为非特异性结合的分子比例 k观察，无显著性 和 k观察指标, 分别为非特异性结合分子和特异性结合分子的观测解离速率。仅 k观察，s 从这里开始考虑。两种蛋白质解离的动力学，k是，s以及荧光团的光漂白， kpb，有助于 k观察指标, 作为
<img alt="观测速率常数的动力学方程图，k_obs = k_true + k_pb。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">；
因此，为了分离蛋白质解离的影响，测量前述细胞系中H2B-Halo的特异性解离速率。
<img alt="用于光谱数据拟合中动力学分析的指数衰减方程 P(t)。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 3">
H2B 是一种稳定整合在染色质中的蛋白质，在单分子成像的时间尺度上几乎不发生解离37。因此，其特异性解离速率等于 PA-JF646 Halo 配体的光漂白速率，即
<img alt="化学动力学方程，显示速率常数比较，\(k_{pb} = k_{H2B,s}\)。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 4">。
目标蛋白在冷凝物中的平均停留时间 <img alt="静态平衡，公式 ΣFx=0, ΣFy=0, 示意图, 受力分析, 平衡, 工程概念" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 5"> 为
<img alt="时间常数公式 τs=1/k_true,s=1/(k_obs,s-k_pb)，用于动力学分析的方程。" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6">。
展示了 Irgen-Gioro 等人40 的代表性结果，其中该方案被用于证明将寡聚化结构域与 IDR 融合可延长 IDR 在其缩合物中的停留时间。该结果表明，添加的寡聚化结构域可稳定驱动液-液相分离（LLPS）的 IDR 同源相互作用。原则上，采用稍作修改的类似方法，也可用于表征参与各类缩合物形成的任何蛋白质的同源或异源相互作用。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m TetraSpeck 微球</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>25 mm 直径，#1.5 盖玻片</td><td>Marienfeld Superior</td><td>111650</td><td>盖玻片制备</td></tr><tr><td>593/40 nm 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>676/37 nm 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-676/37-25</td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>6 孔 TC 培养板</td><td>Genesee</td><td>25-105MP</td><td>显微镜观察前细胞准备</td></tr><tr><td>细胞系：U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>细胞内蛋白标记</td></tr><tr><td>ConvertASCII_SlowTracking_css3&lt;br/&gt; .m</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Chong 等，2018</td></tr><tr><td>盖玻片染色架</td><td>Thomas</td><td>24957</td><td>盖玻片制备</td></tr><tr><td>氘代 Janelia Fluor 549 (JFX549)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>显微镜观察前细胞准备</td></tr><tr><td>DMEM，低糖</td><td>Gibco</td><td>10-567-022</td><td>细胞内蛋白标记：培养基配方：含 5% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Lab Alley</td><td>EAP200-1GAL</td><td>盖玻片制备</td></tr><tr><td>evalSPT</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Drosopoulos 等，2020</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cytiva</td><td>SH30396.03</td><td>细胞内蛋白标记：培养基配方：含 5% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析</td></tr><tr><td>Ikon Ultra CCD 相机</td><td>Andor</td><td>X-13723</td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>长通二向色镜分光器</td><td>Semrock</td><td>Di02-R635-25x36</td><td>单分子成像：红光/远红光分光器</td></tr><tr><td>LUN-F 激光单元</td><td>Nikon</td><td></td><td>单分子成像：405/488/561/640</td></tr><tr><td>MatTek 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>显微镜观察前细胞准备：35 mm，#1.5 盖玻片培养皿，用于细胞培养</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>单分子成像：显微镜图像采集软件</td></tr><tr><td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Chong 等，2018</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>细胞内蛋白标记：培养基配方：含 5% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>细胞内蛋白标记</td></tr><tr><td>光激活 Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>显微镜观察前细胞准备</td></tr><tr><td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Chong 等，2018</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6984-06</td><td>盖玻片制备</td></tr><tr><td>pretracking_comb.txt</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Chong 等，2018</td></tr><tr><td>SLIMfast</td><td></td><td></td><td>单分子成像数据分析：见 Teves 等，2016</td></tr><tr><td>载物台顶部培养系统</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>单分子成像：用于活细胞成像</td></tr><tr><td>TwinCam 双发射图像分光器</td><td>Cairn Research</td><td></td><td>单分子成像</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Branson</td><td>5800</td><td>盖玻片制备</td></tr></tbody></table>

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

通过液-液相分离（LLPS）形成的生物大分子凝聚体在细胞组织以及越来越多的细胞功能中被认为具有关键作用。在活细胞中表征LLPS也十分重要，因为异常的凝聚过程已被证实与多种疾病相关，包括癌症和神经退行性疾病。LLPS通常由内在无序蛋白之间具有选择性、瞬时性和多价性的相互作用驱动。人们尤其关注参与LLPS的蛋白质的相互作用动态，这些动态可通过测量其结合停留时间（RT）——即蛋白质在凝聚体内结合状态所持续的时间——得到良好表征。本文介绍了一种基于活细胞单分子成像的方法，可用于测量特定蛋白质在凝聚体内的平均停留时间（RT）。我们同时对单个蛋白质分子及其关联的凝聚体进行可视化，利用单粒子追踪（SPT）绘制单分子运动轨迹，随后将轨迹拟合到蛋白质-液滴结合模型中，从而提取该蛋白质的平均RT。最后，我们展示了代表性结果，应用该单分子成像方法比较了某一蛋白质在融合与未融合寡聚化结构域时，其在LLPS凝聚体中的平均RT。该实验方案可广泛适用于任何参与LLPS的蛋白质相互作用动态的测量。

此处展示了 Irgen-Gioro 等人40 的代表性结果，我们使用该单粒子追踪（SPT）方案比较了两种蛋白质在其各自自组装的液-液相分离（LLPS）凝聚体中的相互作用动力学。TAF15（TATA框结合蛋白相关因子15）含有一个内在无序区（IDR），在人源细胞中过表达时可发生LLPS。我们假设，将TAF15(IDR)与形成24亚基寡聚体的FTH1（铁蛋白重链1）融合，将促进更稳定的同源蛋白-蛋白相互作用，从而驱动LLPS的形成。为验证这一假设，我们在U2OS细胞中瞬时表达了Halo-TAF15(IDR)或TAF15(IDR)-Halo-FTH1融合蛋白，并按照上述方案对每种蛋白进行双色单分子成像。TAF15(IDR)-Halo-FTH1成像序列的一个代表性帧如图1A所示。在PA-JF646通道中检测到的分子被定位，并将这些定位结果组装为轨迹。随后，通过与标记凝聚体位置的二值化掩膜进行比对，将所得轨迹分为凝聚体内和凝聚体外两组（图1B）。尽管为保证可视性仅展示了少量轨迹，但结合在凝聚体内外的分子轨迹之间仍存在明显差异。接下来，对凝聚体内轨迹长度的存活曲线进行双组分指数模型拟合（图1C）。最后，提取经光漂白校正后的平均驻留时间，并对两种蛋白进行绘图（图1D）。我们发现，Halo-TAF15(IDR)在其LLPS凝聚体中的平均驻留时间为10.23 s ± 1.10 s，而TAF15(IDR)-Halo-FTH1的平均驻留时间为64.15 s ± 11.65 s。该结果表明，在TAF15(IDR)上添加寡聚化结构域确实增强了蛋白与凝聚体的结合稳定性。
<img alt="蛋白质相互作用分析、荧光标记的显微镜图像、生存曲线图、数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66169/66169fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：基于单粒子追踪（SPT）的方法可分辨蛋白质在其凝聚体中停留时间的差异。 A. TAF15(IDR)-Halo-FTH1双色单分子成像的代表性帧图像。蛋白质使用高浓度非光激活染料（100 nM JFX549，黄色）标记以显示凝聚体的位置，同时使用低浓度光激活染料（20 nM PA-JF646，品红色）标记以实现单分子可视化，从而进行单粒子追踪（SPT）。在相同成像条件下获取Halo-TAF15(IDR)的图像，并单独获取H2B-Halo的单通道PA-JF646图像。白色虚线标示细胞核边界。B. 凝聚体位置的二值化掩膜（灰色）与轨迹（多色）叠加的代表性融合图像。C. TAF15(IDR)-Halo-FTH1的代表性生存曲线，采用双组分指数模型拟合。D. Halo-TAF15在其相应凝聚体中的平均停留时间显著短于TAF15(IDR)-Halo-FTH1。每个蛋白的数据来自三个不同日期独立实验中测量的20个细胞的平均值。误差表示为平均值的标准误差，星号表示两种蛋白停留时间之间存在显著差异（p&lt;0.05，Wilcoxon秩和检验）。本图经Irgen-Gioro等人40许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66169/66169fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。

通过液-液相分离（LLPS）形成的生物分子凝聚体在细胞组织中具有重要作用，且其研究重要性正日益增加……

我们的实验室致力于研究内在无序蛋白区域的相互作用行为，以及这些区域在健康与疾病状态下人类细胞转录调控中的作用。在本实验室中，我们开发并结合使用新型单分子显微镜技术与分子生物学、生物化学及蛋白质组学方法，研究生物分子凝聚体。本实验方案可实现对特定蛋白质在活的人类细胞中与特定类型凝聚体结合动力学的定量分析，且广泛适用于参与液-液相分离的任何蛋白质相互作用动力学的测量。在构建表达目标Halo标签蛋白和Halo-H2B的细胞系后，分别为两者制备Halo配体染色试剂。用两毫升PBS洗涤细胞。加入含有Halo配体的培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育一小时。去除染色培养基后，用 PBS 清洗细胞四次，并将其与不含 Halo 配体的新鲜培养基孵育。重复上述清洗和孵育步骤四次后，用无菌镊子将带有细胞的盖玻片转移至与显微镜载物台兼容的腔室中。成像前向腔室中加入不含酚红的培养基。首先，获取表达目标Halo标记蛋白和Halo-H2B的配体染色细胞。开启显微镜系统后，设置活细胞培养参数，并让系统达到平衡。在显微镜的100倍TIRF物镜上滴加一滴镜油，然后将细胞样品加载到显微镜载物台上。为了识别形态健康的细胞，调节Z轴位置并在明场照明下对细胞样本进行成像。裁剪视野以捕获目标细胞核。使用激光照明，调节TIRF角度，以实现Hilo照明，并获得单分子的最佳信噪比。然后将曝光时间设置为500毫秒。在帧间死区时间内，使用111微瓦的405纳米激光照射激活分子。在每次曝光期间，使用9.1毫瓦的640纳米激光激发H2B-Halo分子。连续采集2000帧图像，并在光激活分子减少时逐步增加405纳米激光束的功率。对于目标Halo标记蛋白，使用长通二向色镜将发射光波长分至两个相机。在之前展示的相同采集参数基础上，添加JFX549通道，每10秒采集一帧，连续采集2000帧。首先，对 Halo 标记的蛋白质凝聚体进行活细胞单分子成像。使用 Image J 将原始成像数据文件中的每个通道转换为独立的 TIFF 文件。如有需要，运行预追踪组合处理。文本并按照提示将任何帧替换为最新的帧。要在SLIM Fast中加载单分子电影文件，请点击加载，然后选择图像堆栈。在相应的选项卡下设置定位和采集的参数。可视化所有分子的定位信息，并使用“锁定全部”功能生成一个文件，该文件包含每一帧中所有分子的定位信息。接下来，进入加载、粒子数据，选择“slim fast”以在采集设置中加载包含定位信息的文件。使用“选项”和“片层追踪”功能，调整轨迹生成的参数。单击“gen traj”以生成包含所有分子轨迹的文件。将已追踪的表格文件载入 eval SPT 中，并设置参数以过滤掉短于 2.5 秒的轨迹。使用“export data”功能，生成包含所有已过滤轨迹的文件。运行 imageJmacronucleusnclustermaskv2.0.txt，对在 JFX549 通道中获取的视频所有帧进行阈值处理，生成一个时间延时视频，其中包含随时间变化的二值化掩膜，以突出显示凝聚体的位置。使用 convert ASCII slow tracking CSS 3.3 重新格式化轨迹，并运行分类版本 4。根据分子在凝聚物中的停留时间对其进行分类。接下来，使用 plotresidencehistcss.m 从目标蛋白在凝聚物中的轨迹以及 H2B 的轨迹中提取特异性结合分子的观测解离速率和光漂白速率。最后，计算目标蛋白特异性结合到其凝聚物上的校正平均驻留时间。来自双色单分子成像视频 TAF15-IDR-Halo-FTH1 的一帧图像显示，细胞核在 PA-JF646 和 JFX549 两个通道中均有信号。经过组装和分类后，可清晰区分出 PA-JF646 检测到的分子结合到凝聚物上的运动轨迹。校正光漂白后，TAF15-Halo-FTH1 的计算平均滞留时间长于 Halo-TAF15。

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生物分子缩合物中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

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通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

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利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

本文介绍了核磁共振（NMR）方法——不可见物种的受限扩散（REstricted DIFfusion of INvisible speciEs，REDIFINE）和半固态磁化转移检测凝聚相（CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization...

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