生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

我们的实验室致力于研究内在无序蛋白区域的相互作用行为，以及这些区域在健康与疾病状态下人类细胞转录调控中的作用。在本实验室中，我们开发并结合使用新型单分子显微镜技术与分子生物学、生物化学及蛋白质组学方法，研究生物分子凝聚体。本实验方案可实现对特定蛋白质在活的人类细胞中与特定类型凝聚体结合动力学的定量分析，且广泛适用于参与液-液相分离的任何蛋白质相互作用动力学的测量。

在构建表达目标Halo标签蛋白和Halo-H2B的细胞系后，分别为两者制备Halo配体染色试剂。用两毫升PBS洗涤细胞。加入含有Halo配体的培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育一小时。

去除染色培养基后，用 PBS 清洗细胞四次，并将其与不含 Halo 配体的新鲜培养基孵育。重复上述清洗和孵育步骤四次后，用无菌镊子将带有细胞的盖玻片转移至与显微镜载物台兼容的腔室中。成像前向腔室中加入不含酚红的培养基。

首先，获取表达目标Halo标记蛋白和Halo-H2B的配体染色细胞。开启显微镜系统后，设置活细胞培养参数，并让系统达到平衡。在显微镜的100倍TIRF物镜上滴加一滴镜油，然后将细胞样品加载到显微镜载物台上。

为了识别形态健康的细胞，调节Z轴位置并在明场照明下对细胞样本进行成像。裁剪视野以捕获目标细胞核。使用激光照明，调节TIRF角度，以实现Hilo照明，并获得单分子的最佳信噪比。

然后将曝光时间设置为500毫秒。在帧间死区时间内，使用111微瓦的405纳米激光照射激活分子。在每次曝光期间，使用9.1毫瓦的640纳米激光激发H2B-Halo分子。

连续采集2000帧图像，并在光激活分子减少时逐步增加405纳米激光束的功率。对于目标Halo标记蛋白，使用长通二向色镜将发射光波长分至两个相机。在之前展示的相同采集参数基础上，添加JFX549通道，每10秒采集一帧，连续采集2000帧。

首先，对 Halo 标记的蛋白质凝聚体进行活细胞单分子成像。使用 Image J 将原始成像数据文件中的每个通道转换为独立的 TIFF 文件。如有需要，运行预追踪组合处理。

文本并按照提示将任何帧替换为最新的帧。要在SLIM Fast中加载单分子电影文件，请点击加载，然后选择图像堆栈。在相应的选项卡下设置定位和采集的参数。

可视化所有分子的定位信息，并使用“锁定全部”功能生成一个文件，该文件包含每一帧中所有分子的定位信息。接下来，进入加载、粒子数据，选择“slim fast”以在采集设置中加载包含定位信息的文件。使用“选项”和“片层追踪”功能，调整轨迹生成的参数。

单击“gen traj”以生成包含所有分子轨迹的文件。将已追踪的表格文件载入 eval SPT 中，并设置参数以过滤掉短于 2.5 秒的轨迹。使用“export data”功能，生成包含所有已过滤轨迹的文件。

运行 imageJmacronucleusnclustermaskv2.0.txt，对在 JFX549 通道中获取的视频所有帧进行阈值处理，生成一个时间延时视频，其中包含随时间变化的二值化掩膜，以突出显示凝聚体的位置。使用 convert ASCII slow tracking CSS 3.3 重新格式化轨迹，并运行分类版本 4。

根据分子在凝聚物中的停留时间对其进行分类。接下来，使用 plotresidencehistcss.m 从目标蛋白在凝聚物中的轨迹以及 H2B 的轨迹中提取特异性结合分子的观测解离速率和光漂白速率。

最后，计算目标蛋白特异性结合到其凝聚物上的校正平均驻留时间。来自双色单分子成像视频 TAF15-IDR-Halo-FTH1 的一帧图像显示，细胞核在 PA-JF646 和 JFX549 两个通道中均有信号。经过组装和分类后，可清晰区分出 PA-JF646 检测到的分子结合到凝聚物上的运动轨迹。

校正光漂白后，TAF15-Halo-FTH1 的计算平均滞留时间长于 Halo-TAF15。