一种新的澄清方法，以可视化胆道变性在肝癌变态海七鳃鳗（ Petromyzon马里努斯）
2014年6月6日
海七鳃鳗失去变态在胆囊和胆管，类似于人类的胆道闭锁的过程。一种新的固定和澄清方法（CLARITY）进行了修改，使用可视化激光扫描共聚焦显微镜在整个胆道系统。这种方法提供了一个强大的工具来研究胆管变性。
该程序的总体目标是阐明整个肝脏以及与肠道的连接处，用于胆道变性的整体、结构和细胞分析。在C 七鳃鳗中。这是通过首先将组织固定在水凝胶单体溶液中来实现的。
接下来，水凝胶与固定的组织聚合。然后去除固定组织的质膜，组织变得透明。最后，免疫荧光染色最终进行激光皮肤，共聚焦显微镜用于显示c Lampry 胆道变性过程中的整体结构和细胞变化。
这种方法可以帮助回答生物医学领域的关键问题，例如中枢神经系统中的连接组，以及我们的例子中血清点过程中的胆道变性。该技术的意义延伸到人类胆道或闭锁的治疗或诊断，因为这种罕见的先天性婴儿疾病与血清点过程中的变性具有相似的特征。当我们在 Nature 上找到一篇新闻文章并在实验室会议上展示了在线视频来演示该程序时，我们第一次想到了这种方法，我们将是我们实验室的研究生 Ann Scott 根据文本协议制作磷酸盐缓冲盐水和磷酸盐缓冲液或 pb。
在通风橱中，通过混合蒸馏水、40% 丙烯酰胺、2% 双丙烯酰胺 10 XPBS、16% 多聚甲醛、醛、皂苷和每硫酸盐铵来制备 400 毫升水凝胶。准备 1 升由 4%SDS 和 0.2 摩尔硼酸组成的澄清溶液，并制备 500 毫升 80% 甘油，以在通风橱中制备组织。将 10 毫升水凝胶单体溶液 Eloqua 放入 15 毫升离心管中。
解剖组织样本，并将组织放入每管水凝胶中，在 4 摄氏度下固定两天。在通风橱下孵育后，通过添加 5 μL temid 聚合固定的组织。然后充分混合，让样品在室温下孵育 2 到 3 小时。
孵育后，彻底去除多余的凝胶以清除组织样品。将每个样品放入 15 毫升透明溶液中，并在 50 摄氏度和 70 RPM 下孵育数天，直到它们变得透明。每天至少更换一次透明溶液，并去除多余的凝胶。
将样品在 15 毫升 0.1 摩尔 PB 和 0.1%Triton X 100 中在 37 摄氏度和 70 RPM 下转移过夜。用新鲜缓冲液再重复孵育两次。现在组织已清除且没有任何多余的凝胶，将样品浸入 PB tritton X 100 中的一抗中，并在 37 摄氏度和 70 RPM 下孵育两天，孵育后使用 15 毫升 PB 和 0.1%tritton X 100 在 37 摄氏度和 70 RPM 下洗涤组织样品过夜。
去除最终洗涤缓冲液后重复洗涤 3 次，在含有 0.1%Trix 100 和封闭血清的 PB 中加入荧光二抗溶液，并在 37 摄氏度和 70 RPM 的黑暗中孵育一天。在 10 毫升 PB tritton X 100 中以 37 摄氏度和 70 RPM 的速度洗涤样品 3 次过夜后，在 PBS 中进行 3 次过夜洗涤。最后，将澄清的组织在覆盖有铝箔的 80% 甘油中孵育过夜。
然后在黑暗或昏暗的光线下进行共聚焦显微镜成像，但本视频中的灯是开着的，以便进行可视化。在 c lampre过程中，HEPA 胆道系统发生了几个重要的发育事件，例如，如此处所示，胆管和胆囊发生凋亡和退化。使用改良的澄清方法并用肝细胞标志物细胞角蛋白 19 抗凋亡标志物染色后，使用 BCL 两种激光扫描共聚焦显微镜对完整肝脏进行光学切片。
染色显示，退行性过程发生在第二到第四个阶段。顶部面板来自前端，下面板来自后端。这里显示的是胆道树，这里是深色树突状凋亡细胞以及肝脏中周围的小管和导管工具。
该图表示重建的三维图像，即在阶段 2 和 3 之间的三个肝脏的共聚焦 Z 系列，用抗细胞角蛋白 19 和 BCL 抗体标记，胆道树和深色树突状凋亡细胞以及周围的小管和导管工具分别用白色和黑色箭头标记。这里显示的是阶段 2 和 3 之间标本胆管的共聚焦光学切片，管腔中有胆液滴。观看此视频后，您应该对如何澄清整个组织以进行进一步的成像分析有很好的了解。
不要忘记，使用多聚甲醛和聚丙烯酰胺溶液可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和使用通风橱。
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概述
本研究调查了海灯笼鱼在变态过程中胆囊和胆管的丧失，类似于人类胆道闭锁。采用改良的CLARITY方法结合激光扫描共聚焦显微镜来可视化胆树，为胆道变性提供了洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 比较解剖学
背景
- 海灯笼鱼在变态过程中经历显著的解剖学变化。
- 胆囊和胆管的丧失是这一过程中的关键方面。
- 这一现象类似于人类胆道闭锁中观察到的条件。
- 理解这些变化可以提供胆道变性的洞见。
研究目的
- 明确海灯笼鱼的肝脏及其与肠的连接。
- 分析胆道变性过程中的全局结构和细胞变化。
- 开发一种可视化整个胆树的方法。
使用的方法
- 在水凝胶单体溶液中固定组织。
- 与固定组织聚合水凝胶。
- 去除质膜以实现组织透明化。
- 免疫荧光染色，随后进行激光扫描共聚焦显微镜。
主要结果
- 改良的CLARITY方法成功可视化了胆树。
- 在变态过程中观察到显著的结构和细胞变化。
- 该研究为研究胆道变性提供了新工具。
- 获得的洞见可能对理解人类相似条件有影响。
结论
- 该研究增强了对海灯笼鱼胆道变性的理解。
- 改良的CLARITY方法有效用于可视化复杂的生物结构。
- 研究结果可能对更广泛的人类胆道闭锁研究做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Clarifying and visualizing biliary degeneration in sea lamprey using a modified CLARITY protocol enables high-resolution, three-dimensional analysis of tissue remodeling relevant to rare human diseases such as biliary atresia. This approach supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery by providing a unique comparative model for hepatic and biliary system degeneration. The method enhances predictive confidence for translational research by enabling quantitative, reproducible imaging of complex tissue changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biliary degeneration mechanisms in a disease-relevant comparative model.
- Supports functional target validation by visualizing cellular and structural changes during organ remodeling.
- Facilitates mechanistic de-risking for hepatic disease pathways by providing direct visualization of degeneration events.
Screening & Assay Development
- Prepares clarified, immunostained tissues suitable for quantitative imaging and downstream analysis.
- Standardizes tissue processing for reproducible, high-content confocal microscopy outputs.
- Enables scalable imaging workflows for comparative studies across developmental stages or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling biliary atresia-like degeneration in a vertebrate organism.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker localization and quantification.
- De-risks translational hypotheses by enabling direct visualization of tissue-level outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This modified CLARITY protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven imaging of tissue degeneration, supporting both mechanistic studies and translational biomarker research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for biliary system degeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-resolution, three-dimensional readouts for statistical comparison of degeneration stages.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by modeling disease-relevant tissue changes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and clarification workflow for diverse tissue analysis needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in hepatic disease modeling.
- Operational Value: Standardizes tissue clarification and imaging for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative tissue-level data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hepatic and biliary disease targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clarification, immunostaining, and confocal microscopy.
- Needs access to hydrogel reagents, clearing solutions, and advanced imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different tissue types or developmental stages.
- Involves safety precautions due to hazardous reagents such as paraformaldehyde and acrylamide.
