稳定肝细胞表型采用优化合成表面

该程序的总体目标是优化聚合物涂层表面，以保持干细胞来源的人肝细胞的长期稳定培养。这是通过首先合成聚氨酯 1 3 4 或 PU 1 3 4 来实现的。第二步是选择合适的溶剂来溶解 PU 1 34。

接下来，在玻璃盖玻片上使用 PU 1 3 4 的旋涂工艺进行优化。最后一步是优化聚合物 P 1 34 涂层玻璃盖玻片的灭菌程序，最终扫描电子显微镜、原子力显微镜和药物代谢。测定用于显示 PU 1 34 聚合物涂层对干细胞衍生肝细胞功能的影响。

与现有方法（例如在培养中使用 al Metrices 以维持具有肝细胞的 URI 有效干细胞）相比，该技术的主要优点是这些合成材料可以根据目的和 s 规模进行微调，以达到质量保证标准。此外，它们还显示批次 2 总线一致性。这项技术的影响延伸到肝脏疾病的治疗，因为它代表了如何优化合成聚合物表面以保留细胞表型的一个例子。

演示该程序的是 Jeffrey Walton 博士，他是我实验室的博士后 在开始此程序之前。在真空烘箱中，将 mono 的一个六己烷刻度盘二乙二醇和 neo PenTile 二醇在 40 摄氏度下热处理 48 小时。为了去除任何残留的水，将 22 毫摩尔的每种单体和 55 毫摩尔的 dpic 酸加入到连接到 Dean Stark 装置并配有磁力搅拌棒的双口圆底烧瓶中。

然后将整个组件置于真空下，并在 40 摄氏度下轻轻加热玻璃器皿 6 小时，以避免在向烧瓶中添加化学品时吸收水分。从烘箱中取出组件并将系统置于氮气下后，加入 0.0055 摩尔催化剂钛四，但通过注射器滴加到烧瓶中。将反应混合物在 180 摄氏度下搅拌 24 小时，收集 dean stark 捕集阱中的残留水。

让产品冷却至室温。接下来将 3.2 毫摩尔或多元醇 P-H-N-G-A-G 的当量与 6.4 毫摩尔或四个四甲基和双酚异氰酸酯的两个当量混合。在 12 mL 无水 DML 中，将双口圆底烧瓶中，该烧瓶连接到 Dean Stark 装置并配备磁性星棒。

氮气气氛下在 70 摄氏度下搅拌反应混合物。然后通过注射器滴加催化剂四氧化钛至终浓度为0.8%一小时后，加入一当量的扩链剂一四丁烷刻度盘，即得共聚物产品。将温度提高到 90 摄氏度，并在氮气气氛下饥饿 24 小时。

一旦反应混合物在室温下，将 dal 醚滴加到反应混合物中，直到观察到聚氨酯产物沉淀。将反应混合物转移到离心管中后，将溶液以 5， 300 倍 G 离心 5 分钟。倾析后，旋囊在室温下干燥，直到溶剂蒸发。

接下来作称取 200 毫克 PU 1 34 放入玻璃瓶中。用氯仿或氯仿与甲苯以一比一的比例稀释样品至终浓度为 2%的氯仿或 tetra roran 抗氯甲烷的组合。在室温下，用摇床以每分钟 200 次的速度，以一比一的比例剧烈摇动溶液 20 分钟，直到溶液变得均匀且未观察到沉淀。

完成后，将大约 15 毫米见方的玻璃盖玻片放在旋转装置上。使用移液管将 50 微升 PU 一至四溶液涂抹在盖玻片上，以 23 倍 G 的速度旋转每个盖玻片 7 秒，然后在室温下风干盖玻片至少 24 小时，然后消毒。此时，伽马射线通过使用实验室散热器施加 10 个格雷的剂量 12 分钟来照射每个聚合物涂层的盖玻片。

或者，使用 30 瓦紫外线灯泡对每个聚合物涂层盖玻片进行紫外线照射每侧 16 分钟。完成后，根据盖玻片大小，将聚合物涂层的盖玻片放入合适的组织培养板中。使用解离试剂培养和分化人胚胎干细胞系分离的细胞后，并在分化过程的第 9 天在无血清培养基扫描电子显微镜存在下将它们重放到 PU 1 34 包被的盖玻片上。

不同涂层玻璃盖玻片的图像显示，甲苯或氯仿涂层不均匀，表明 PE 1 34 沉淀的涂层不均匀。相比之下，四面体允许对更均匀的表面进行旋涂。此外，对不同聚合物涂层的原子力显微镜分析显示，与其他溶剂相比，溶解在四氢弗林蛋白酶中的 P 1 34 的粗糙度降低了 40%，表明 PU 1 34 涂层更均匀，诱导了肝脏内胚层分化，在第 9 天，肝原始细胞样细胞很明显，大多数细胞表达细胞角蛋白 19 α 胎儿蛋白和肝细胞核因子 α 和低水平白蛋白作为代谢功能的量度。

在重新接种到不同的聚合物涂层表面 4 天后评估细胞色素 P 4 50 功能。观察到在 tetra hydro fure mpu 1 3 4 包被表面上重新接种的细胞中的代谢活性增加了两倍。这些结果表明，人胚胎干细胞衍生的肝细胞代谢活性通过更均匀的 P 1 34 涂层面得到改善 造影成像显示紫外线或伽马射线照射后没有明显差异，扫描电子显微镜分析进一步证实了这一点。

与 UV 辐射的 PU 1 34 涂层玻璃盖玻片上重新接种的细胞相比，在 γ 辐射的 PU 1 34 涂层玻璃盖玻片上重新接种的人胚胎干细胞衍生的肝细胞的 CYP 活性增加了 3 a 的三倍。这些观察结果表明，伽马辐射是最佳的灭菌技术。在尝试此程序时，重要的是要记住检查不同旋涂 CLO 之间涂层的均匀性，并且不要忘记使用化学溶剂仪器可能非常危险。

执行此程序时应始终采取佩戴护目镜等应用。