人诱导多潜能干细胞衍生肝细胞的药物发现方法

本实验的总体目标是以适合高通量筛选的方式将人诱导的多能干细胞分化为肝细胞样细胞。肝细胞在实验室中很难生长，但它们可以从诱导多能干细胞中产生，这为确定肝病的治疗方法提供了一个筛选平台。该技术的主要优点是可以从任何肝病患者产生无限数量的肝细胞，这些肝细胞在实验室中概括了疾病。

即使没有广泛的干细胞生物学知识，该程序也相对容易建立。其可重复性使研究人员无需复杂的机器人技术即可筛选数千种化合物。博士后研究员 Ray Liu 和研究生 Paige Lamprecht 今天将演示该程序。

首先，用含有钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 将融合蛋白 Ecad 稀释至每毫升 15 微克。用 5 mL 稀释基质包被 100 mm 悬浮组织培养皿，并在 37 摄氏度下孵育至少 1 小时。孵育后，去除底物，并更换为 5 ml iPSC 培养基。

从液氮中检索一小瓶冷冻保存的人诱导多能干细胞。在 37 摄氏度下解冻，直到留下一个小冰晶。然后，轻轻地将细胞移液到含有 4 毫升培养基的无菌 15 毫升锥形管中。

将细胞以 300 G 离心 5 分钟。去除上清液，用 5 毫升补充有 10 微摩尔 Y-27632 的培养基轻轻重悬细胞，Y-27632 是 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶的选择性抑制剂。现在，从涂有 Ecad 的 10 毫米悬浮组织培养皿中取出培养基，并加入 5 毫升细胞。

一旦 iPSC 达到约 80% 汇合度，取出培养基并用不含钙和镁的 DPBS 洗涤一次。吸出 DPBS 并加入足量的 0.02% EDTA 溶液以覆盖培养皿。然后，在室温下孵育细胞长达 3 分钟。

一旦细胞开始释放，立即去除 0.02% EDTA 溶液，并用 10 毫升 M 培养基淹没培养皿以释放细胞。通过轻柔的移液帮助 iPSC 分离。将 1/10 的悬浮细胞转移到含有 5 毫升 M 培养基的新鲜 Ecad 包被组织培养皿中。

在 37 摄氏度下，在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下孵育培养物，每天更换培养基。取取一小瓶 250 微升浓度为每毫升 2 毫克的冰冷基质原液，并在冰上解冻。接下来，使用预冷的移液器轻轻混合，使解冻的基质与 10 毫升冷 DMEM/F12 混合，使最终浓度为 0.05 毫克/毫升。

将 100 μL 稀释的基质转移到 96 孔组织培养板的每个孔中。将板在 37 摄氏度下在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下孵育至少 1 小时。孵育后，丢弃基质，用每孔 50 μL M 培养基替换，对其余板重复相同的包被程序。

现在，在 100 毫米培养皿上培养 iPSC，直到细胞接近 80% 汇合。要从每个 100 毫米板中收获 iPSC，吸出培养基并用 5 毫升 DPBS 冲洗。用 3 毫升细胞分离溶液（如 Accutase）替换冲洗液。

然后，在 37 摄氏度下在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下孵育约 2 分钟。一旦细胞开始分离，加入 7 mL M 培养基进行收获。移液数次，将细胞集落解离成约 3 至 6 个细胞的小簇。

接下来，将 iPSC 收集到 15 mL 无菌离心管中，并以 300 G 离心 5 分钟。完成后，去除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL M 培养基中。使用多通道移液器将 50 μL 悬浮细胞移液到每个孔中，将细胞均匀分配到 96 孔基质包被板上。

然后，在 37 摄氏度下在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下培养细胞过夜，并与其余板重复细胞接种程序。通过显微镜检查 96 孔板，以确保细胞覆盖每个孔表面的至少 70%。对于分化的第 1 天到第 2 天，用每孔 100 微升基于 RPMI 的分化培养基替换培养基。

然后，将细胞在 37 摄氏度的环境氧气和 5% 二氧化碳中孵育两天，每天更换培养基。对于分化的第 3 天到第 5 天，用 100 微升基于 RPMI 的分化培养基替换培养基，该培养基补充有 2%B27 和每毫升 100 纳克活性 NA。在 37 摄氏度的环境氧气和 5% 二氧化碳中培养细胞三天，每天更换培养基。在分化第 5 天，用 100 微升 0.02% EDTA 溶液处理每个孔 30 秒，然后立即去除溶液。

加入 100 微升新鲜的基于 RPMI 的分化培养基，并对其余板重复相同的程序。为了在第 6 天到第 10 天之间进行分化，用 100 微升基于 RPMI 的分化培养基替换培养基。将细胞在 37 摄氏度下在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下孵育 5 天，每天更换培养基。

对于第 11 至 15 天的分化，用 100 微升基于 RPMI 的分化培养基替换培养基，补充有 2%B27 和 20 ng/ml HGF。将细胞在 37 摄氏度下在 4% 氧气和 5% 二氧化碳下孵育 5 天，每天更换培养基。为了在第 16 至 20 天之间进行分化，用补充有 20 ng/mL 抑瘤素-M 的肝细胞细胞培养基替换培养基。

将细胞在 37 摄氏度的环境氧气和 5% 二氧化碳中孵育 5 天，每天更换培养基。在第 20 天分化完成后，用 100 微升新鲜肝细胞培养基替换培养基，每毫升补充 20 纳克抑菌素-M。孵育 24 小时后，将培养基取回新鲜的 96 孔板中，并在 20 摄氏度下储存。

对其余板重复相同的收集过程。将 90 μL 补充有 oncostatin-M 的新鲜肝细胞培养基添加到 96 孔板的每个孔中。从先前制备的工作储备液中加入 10 μL 每种选定的化合物。

向对照孔中加入 0.2% 的 DMSO，以匹配处理样品中的最终浓度。孵育 24 小时后，将培养基收集到新的 96 孔板中，并在 20 摄氏度下储存。对其余板重复相同的收集过程。

治疗 5 天后，细胞表达在 Definitive Endoderm 中特征性表达的蛋白质。再分化 5 天后，内胚层转化为肝脏命运，细胞表达 FOXA2 和 HNF 4a。添加 HGF 后，细胞表达在胎儿肝细胞中发现的蛋白质，分化完成后，细胞采用立方体形态，其细胞核包含突出的核仁和具有多个脂滴的大细胞质。

分化第 20 天检测 HNF 4a 和白蛋白的免疫染色表明，这些肝细胞蛋白在所有孔中的分布相似。使用 iPSC 筛选降低 APOB 的化合物，以提供使用 iPSC 衍生的肝细胞进行小分子筛选的示例。APOB 检测的 z 因子为 0.73，这证实了使用该平台进行药物发现的适用性。

测定每种化合物的 APOB 的给药后、给药前比率。通过 z 分数分析实现命中识别。确定了 24 个潜在命中，APOB 比率为 0.86 到 0.44。

在排除对细胞活力有负面影响的化合物后，发现两种化合物在降低 APOB 方面具有可重现性。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 25 天内完成。在尝试此过程时，请务必记住每天准备新鲜培养基。

由于降解而导致的组分浓度不正确会改变细胞分化的能力。开发后，这项技术为药物发现领域的研究人员探索使用人诱导多能干细胞治疗肝病铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何培养和维持人诱导多能干细胞以及以小表面压制形式进行肝脏分化以进行高通量筛选有很好的了解。

不要忘记，使用人诱导多能干细胞可能非常危险，并且在执行此过程时应始终佩戴个人防护设备，例如手套和实验室外套。