Name: 人诱导多潜能干细胞衍生肝细胞的药物发现方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学习将人诱导多潜能干细胞分化为肝细胞样细胞的方法，用于高通量药物筛选平台。该技术可生成无限数量的患者特异性肝细胞，为肝病治疗研究提供可重复的筛选工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（DK55743、DK087377、DK102716 和 HG006398 项目，授予 S.A.D）资助。我们感谢 Behshad Pournasr 博士、James Heslop 博士和 Ran Jing 所做的贡献。

1. 人类诱导多能干细胞的培养
<ol>
	<li>包被重组人E-钙黏蛋白Fc融合蛋白（E-cad-Fc）或其他适用于人多能干细胞（hPSC）培养的基质6
	<ol>
		<li>用含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS (+)）将E-cad-Fc稀释至15 μg/mL。</li>
		<li>在100 mm悬浮组织培养皿中加入5 mL稀释后的E-cad-Fc进行包被，并于37 ˚C孵育至少1小时。移除包被液，替换为5 mL培养基（例如，后续称为M-培养基的mTeSR1）7。 
		注意：本实验方案所用培养基的配制依据已发表的方案7。然而，已有其他多种培养基配方被报道或可商业获得，可能也适用于本实验流程。</li>
		<li>从液氮中取出一管冷冻保存的诱导多能干细胞（iPSCs），在37 ˚C水浴中解冻至仅剩微小冰晶。轻柔地将细胞吹打转移至含有4 mL M-培养基的无菌15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>以300 x g离心5分钟。弃去上清液，用5 mL添加了10 µM Y-27632（一种选择性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂）的培养基轻柔重悬细胞。</li>
		<li>移除步骤1.1.2中的M-培养基，将步骤1.1.4中获得的5 mL细胞悬液转移至已包被E-cad-Fc的100 mm悬浮组织培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人iPSCs的培养维持
	<ol>
		<li>当iPSCs达到约80%融合度时，移除培养基，用无钙镁的DPBS (-)洗涤一次。吸除DPBS (-)，加入足量0.02% EDTA溶液覆盖培养皿表面，室温孵育最多3分钟。 
		注意：在80%融合度时，培养皿中细胞数量约为2 x 107个。应避免细胞过度生长，并确保细胞保持未分化形态。可通过干细胞标志物Tra-1-60染色或等效方法检测细胞的多能性8。</li>
		<li>一旦细胞开始脱落，立即移除0.02% EDTA溶液，并加入10 mL M-培养基充分冲洗培养皿以释放细胞。通过轻柔吹打辅助iPSC脱离。 
		注意：细胞脱落的平均孵育时间约为3分钟，但需根据每种iPSC系的经验确定最佳时间。细胞应以小细胞团形式释放，每个团块包含约5–10个iPSCs。</li>
		<li>将悬浮细胞的1/10转移至新的E-cad-Fc包被的100 mm悬浮组织培养皿中，每皿含5 mL M-培养基。将培养物置于37 ˚C、4% O2/5% CO2条件下培养，并每日更换培养基。 
		注意：尽管通常在生理氧浓度条件下培养iPSCs以促进其多能性维持，但iPSCs也可在常氧条件下生长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在96孔板上将人iPSC分化为肝细胞样细胞
注意： 本部分描述了一种适用于筛选的iPSC分化方案。采用该方法，可在20天内诱导人iPSC分化并形成肝细胞样细胞。尽管此周期适用于大多数检测，但可延长培养时间以提高细胞的成熟度。
<ol>
	<li>用生长因子减少型基底膜基质包被96孔组织培养板
	<ol>
		<li>通过将基质用预冷的无菌DMEM/F12组织培养基稀释至2 mg/mL来制备储备液。将基质分装为250 μL每份，于-80 ˚C保存备用。将10 mL DMEM/F12置于冰上预冷30分钟。取一份250 μL的2 mg/mL基质储备液，于冰上解冻。</li>
		<li>将基质与10 mL冷的DMEM/F12混合，使用预冷的移液管轻轻混匀，使终浓度为0.05 mg/mL。</li>
		<li>将100 μL稀释后的基质转移至96孔组织培养板的每个孔中。在37 ˚C、4% O₂条件下孵育。2/5% CO₂2 至少 1 小时。弃去基质，每孔加入 50 μL M 培养基。于 37 °C、4% O₂ 条件下保存2/5% CO₂2 直到需要时</li>
	</ol>
	</li>
	<li>铺板细胞以进行分化
	<ol>
		<li>将iPSCs在100 mm培养皿中培养至细胞汇合度接近80%。确保培养皿中的细胞数量约为2 × 10⁶7 细胞。使用流式细胞仪或血细胞计数板确定细胞数量。 
		注意： 随着经验积累，可通过显微镜评估iPSC细胞的质量；然而，在通过FACS或免疫染色检测时，接近98%的细胞应表达多能性标志物，如TRA-1-60表位。细胞需保持活跃分裂状态，避免过度生长。</li>
		<li>从每个100 mm培养皿中收获iPSC时，吸除培养基，并用5 mL DPBS (-) 洗涤一次。弃去洗涤液后，加入3 mL细胞解离溶液（例如，accutase）在37 °C、4% O₂条件下孵育约2分钟2/5% CO₂2. 
		注意： 通过显微镜观察细胞脱落情况至关重要。使用accutase消化时切勿过度，目标是在最小处理条件下以小细胞簇的形式释放细胞。</li>
		<li>一旦细胞开始脱落，立即加入7 mL M-培养基进行收集。反复吹打数次，将细胞集落解离为含有约3–6个细胞的小型细胞簇。图1A).</li>
		<li>将iPSCs收集至15 mL无菌离心管中，以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL M-培养基中。</li>
		<li>将细胞均匀分配至96孔基质包被板中，每孔加入50 μL悬浮细胞。每块96孔板使用一块约80%融合度的100 mm iPSC培养板，其细胞数量约为5 x 106 细胞以启动分化。使用多通道移液器可加快此过程。将细胞在37 ˚C、4% O₂条件下培养过夜。2/5% CO₂2. 
		注意： 确保每个孔中接种的细胞数量相等，对于实现可重复的分化至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导细胞分化
	<ol>
		<li>在显微镜下检查96孔板，确保细胞覆盖每个孔表面至少70%的区域。若覆盖率低于70%，则更换为新鲜培养基，并在37 ˚C、4% O₂条件下继续孵育24小时。2/5% CO₂2. 
		注意： 接种细胞后若未诱导分化而培养超过48小时，通常会降低分化效率。尽管在常氧条件下也可发生分化，但其效率可能受到影响。.</li>
		<li>从分化第1天到第2天，将培养基更换为添加有2% B27（不含胰岛素）、100 ng/mL Activin A、10 ng/mL BMP4和20 ng/mL FGF2的RPMI培养基。每孔加入100 μL培养基，于37 ˚C、常氧O₂条件下培养2/5% CO₂2 每天更换培养基，持续2天。 
		注意： 处理大量96孔板时，需使用辅助移液器或机器人。12通道和96通道移液器非常适合日常的培养基更换。</li>
		<li>从分化第3天至第5天，将培养基更换为添加有2% B27（不含胰岛素）和100 ng/mL Activin A的RPMI培养基。在37 ˚C、常氧O₂条件下培养细胞2/5% CO₂2 每天更换培养基，持续3天。</li>
		<li>在分化第5天，更换新鲜培养基前，每孔加入100 μL 0.02% EDTA溶液处理30秒，随后吸除并更换为新鲜培养基。 
		注意： 如果向内胚层的分化效率较高，正在分化的细胞单层容易从培养板上脱落。用0.02% EDTA溶液进行短时间处理有助于减轻细胞脱落，该处理不影响向肝细胞的分化。</li>
		<li>在第6至10天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL BMP4和10 ng/mL FGF2的RPMI/2% B27（含胰岛素），于37 ˚C、4% O₂条件下培养2/5% CO₂2 连续5天每天更换培养基。此阶段可诱导细胞分化为肝前体细胞。</li>
		<li>在第11至15天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL HGF的RPMI/2% B27（含胰岛素）培养基。在37 ˚C、4% O₂条件下培养。2/5% CO₂2 连续培养5天，每天更换培养基。</li>
		<li>在第16至20天期间，将培养基更换为添加了20 ng/mL Oncostatin-M（OSM）的肝细胞培养基（HCM）。将细胞置于37 ˚C、常氧O2/5% CO₂2 每天更换培养基，持续5天。 
		注意： 通过ELISA法检测各孔中培养基分泌的白蛋白（Albumin）、甲胎蛋白（AFP）或载脂蛋白B（APOB）的相对水平，可有效评估个体孔间分化的可重复性（参见3.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小分子筛选
注意： 以下描述了用于鉴定可降低家族性高胆固醇血症诱导多能干细胞（iPSCs）来源的肝细胞样细胞培养基中载脂蛋白B（APOB）水平的化合物的实验步骤。该模型及其在降胆固醇药物筛选中的应用此前已有详细描述5,9。在本示例中，筛选了来自南卡罗来纳化合物库（SC3）的1,000种化合物，每种化合物的测试浓度均为2 μg/mL。
<ol>
	<li>小分子处理iPSC来源的肝细胞
	<ol>
		<li>将母液化合物库稀释，制备工作储备液板，使化合物浓度为20 μg/mL，溶于2% DMSO中，并于-20 ˚C保存。</li>
		<li>准备足够数量的96孔板iPSC来源肝细胞，以便对每种化合物进行测试。 
		注意：待筛选化合物的数量将决定所需96孔板的数量。通常，每种化合物应准备一个孔，另需额外孔用于对照样本。为减少边缘效应可能带来的数据干扰，通常避免使用板的最外层孔。可通过z分数法识别阳性结果，无需设置重复孔；若设置重复孔，则更适合采用t检验。</li>
		<li>在分化完成时（第20天，参见2.3.7），更换培养基为100 μL新鲜HCM ，并添加20 ng/mL Oncostatin-M。于37 ˚C、4% O2/5% CO2条件下精确孵育24小时。将培养基转移至新的96孔板中，于-20 ˚C保存。此样本用于测定加药前培养基中APOB的水平。</li>
		<li>向每孔加入90 μL新鲜HCM，补充20 ng/mL Oncostatin-M。通过移液混匀后，向各孔加入10 μL工作储备液中的相应化合物。对照孔中加入DMSO至终浓度0.2%，以匹配处理组的DMSO浓度，并于37 ˚C、常氧O2/5% CO2条件下精确孵育24小时。收集培养基并储存于-20 ˚C。此样本用于测定化合物处理后APOB的水平。</li>
		<li>可选步骤——剩余细胞可用于免疫染色、细胞活力检测或采用标准方法进行mRNA水平分析。 
		注意：本筛选旨在鉴定对APOB水平具有快速作用的药物。然而，根据疾病模型、下游检测或药物作用机制的不同，可能需要对样本进行多天处理更为合适。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过ELISA测定APOB水平
	<ol>
		<li>使用人APOB ELISA开发试剂盒，按照制造商提供的操作说明，测定加药前和加药后样本中的载脂蛋白B（APOB）浓度。</li>
		<li>配制以下溶液
		<ol>
			<li>洗涤缓冲液：含0.05% Tween 20的PBS，pH 7.4。4 ˚C保存至使用。</li>
			<li>孵育缓冲液：含0.05% Tween 20和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，pH 7.4。4 ˚C保存至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将APOB（mAB 20/17）抗体用PBS（pH 7.4）稀释至2 µg/mL，每孔加入100 μL稀释后的抗体，于4 ˚C孵育过夜。</li>
		<li>从检测板中移除抗体，每孔用200 μL PBS（pH 7.4）洗涤两次。</li>
		<li>每孔加入200 μL含0.05% Tween 20和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（pH 7.4），在摇床上室温孵育1小时。</li>
		<li>使用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（pH 7.4）配制8点标准曲线，APOB浓度分别为：300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL和50 ng/mL。</li>
		<li>用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（pH 7.4）将待测样本稀释1:4。</li>
		<li>孵育缓冲液封闭1小时后，弃去缓冲液，用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤检测板5次。</li>
		<li>彻底去除残留洗涤液后，将90 μL稀释后的样本及APOB标准品转移至检测板中。在摇床上室温孵育1小时。</li>
		<li>弃去样本，每孔用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤，共洗涤5次。每孔加入100 μL mAB LDL 11-生物素抗体（用含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS，pH 7.4稀释1:1,000），在摇床上室温孵育1小时。</li>
		<li>弃去试剂，每孔用200 μL洗涤缓冲液洗涤5次。每孔加入100 μL链霉亲和素-HRP抗体（用孵育缓冲液1:1,000稀释），然后在摇床上室温孵育1小时。</li>
		<li>弃去试剂，每孔用200 μL含0.05% Tween 20的PBS（pH 7.4）洗涤5次。彻底去除检测板中残留洗涤液后，每孔加入100 μL四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温孵育8分钟。</li>
		<li>不移除TMB底物，直接每孔加入100 μL终止液（1N HCl）。</li>
		<li>使用酶标仪测定450 nm处的吸光度。</li>
		<li>可采用四参数逻辑回归法建立标准曲线，并据此确定各样本中APOB的浓度10。</li>
		<li>分析每个样本加药前与加药后APOB的比值，以识别可能降低培养基中APOB水平的化合物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li>
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<li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

基于靶点的药物发现旨在筛选出能够影响特定蛋白质活性的小分子化合物，是目前许多筛选工作的重点。尽管这种方法已成功开发出多种药物，但基于逆转表型的经典药理学筛选方法在发现具有临床疗效的首创新药方面更为成功1。表型药物发现的一个缺点是其依赖于合适的疾病模型。当缺乏该疾病的细胞模型，或常用实验动物物种无法重现临床症状时，这可能构成挑战。然而，利用患者的体细胞生成诱导多能干细胞（iPSC）的能力，为在体外培养中模拟人类疾病提供了新的机遇3。对于某些疾病，例如罕见遗传病，患者数量稀少，且难以接触和获得知情同意。然而，随着基因组编辑技术的发展，将致病突变引入iPSC基因组已相对简便，使得即使是最为罕见的疾病也能够被建模研究。
获得诱导多能干细胞（iPSCs）后，必须将其分化为能够表现疾病表型的适当细胞类型。例如，影响神经功能的疾病可能需要生成神经元或胶质细胞17，而影响肝脏的疾病则可能需要肝细胞9...

成功发现可用于靶向罕见病的药物依赖于可用于筛选的检测方法的开发。基于假设或靶点的筛选（反向药理学）具有一定的应用价值，但需要对疾病的分子机制有深入的理解。表型筛选（经典药理学）则无需对生化通路有详尽的认知，而是依赖于能够准确模拟疾病病理生理学的模型的建立。尽管靶点导向的方法备受关注，但对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首创新药的分析表明，表型筛选的成功率远高于前者。

关键词：药物筛选，罕见病，反向药理学，经典药理学，表型筛选，靶点筛选，疾病模型，分子机制，首创新药，FDA批准1该方法的总体目标是建立一个可用于高通量筛选的平台，以鉴定用于治疗代谢性肝病的小分子。多个 体外 已描述的模型包括原代肝细胞、肝癌细胞和肝前体细胞2然而，这些模型大多存在局限性，亟需开发能够在体外培养中准确模拟代谢性肝功能障碍病理生理过程的新模型。近年来，人类多能干细胞结合基因编辑技术为在体外模拟极为罕见的疾病提供了可能，且无需直接获取患者样本。3尽管使用患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）作为发现治疗罕见肝病小分子的工具在概念上是合理的，但目前仅有少数研究报告证实了该方法的可行性4然而，我们最近建立了一个利用诱导多能干细胞衍生的肝细胞的平台，成功筛选出可用于治疗肝脏代谢缺陷的可重新定位药物5.
本方案介绍了在96孔板中将人iPSCs分化为肝细胞样细胞的过程，并利用这些细胞筛选小分子文库的方法。同时，以高胆固醇血症为例，描述了代谢性肝病的终点分析。该方法可用于研究小分子在传染性肝病、代谢性肝病、药物毒性及其他肝脏疾病中的作用与应用。

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm 无菌组织培养皿&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 无菌悬浮培养皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>抗人白蛋白抗体</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>抗人FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>抗人HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>抗人Oct-3/4抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>抗人SOX17</td><td>R&amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>抗人TRA-1-60 FITC偶联抗体</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A重组人蛋白&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（不含胰岛素）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（无血清）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4重组人蛋白&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离试剂StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+（含钙、镁）</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-（无钙、无镁）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12培养基，含HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>人载脂蛋白B（APOB）ELISA检测试剂盒</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子2（FGF2）</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞培养基（HCM Bullet Kit）&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞生长因子&amp;nbsp;（HGF）</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M（OSM）重组人蛋白&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>无饲养层多能干细胞培养基：mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型基底膜基质&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基，含HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere人多能干细胞定义基质（E-cad-Fc）</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA底物溶液</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>抗TRA-1-60 FITC偶联抗体</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene（EDTA）0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK抑制剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为肝细胞样细胞（HLCs）的能力为研究肝脏代谢中的先天性错误提供了新的机会。然而，为了建立一个可用于筛选潜在治疗肝病小分子的平台，该方法需要一种能够兼容数千种化合物筛选的培养体系。本文介绍了一种在完全明确的培养条件下，于96孔组织培养板中可重复地将人iPSCs分化为肝细胞样细胞的实验方案。我们还展示了利用该平台筛选能够降低家族性高胆固醇血症患者来源的iPSC衍生肝细胞所产生的载脂蛋白B（APOB）的化合物的实例。这一适用于药物发现的平台的建立，将有助于研究人员发现治疗肝脏相关疾病的新疗法。

肝细胞的生成-类似细胞： 图1 描述了人iPSCs向肝细胞样细胞分化过程中发生的变化的时间框架。在E-Cad-Fc上培养的iPSCs可形成直径约2 mm的克隆，表达多能性标志物OCT4（图1A-B）。在E-cadherin基质上培养的细胞形态会与其他表面培养的细胞略有不同，通常呈现扁平形态，胞质表面积更大（图1A）。尽管人类多能干细胞可以在多种不同的基质上高效培养11在E-钙黏蛋白基质上培养iPSC被认为可提高多能细胞群体的均一性，并可在传代过程中实现无需酶处理的细胞操作12然而，也可使用多种替代基质，包括基底膜基质、层粘连蛋白、纤连蛋白和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）...

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。

将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为肝细胞样细胞（HLCs）的能力为研究先天性...

本实验的总体目标是以适用于高通量筛选的方式，将人诱导性多能干细胞分化为类肝细胞。肝细胞在实验室中难以培养，但可通过诱导性多能干细胞生成，从而为肝病治疗方案的筛选提供平台。该技术的主要优势在于，可从任何肝病患者来源的细胞中无限量地生成具有疾病表型的肝细胞，实现在实验室中重现该疾病。该方法建立起来相对简便，即使没有干细胞生物学的深厚知识也能操作。其可重复性使研究人员能够筛选成千上万种化合物，而无需复杂的机器人系统。今天的操作将由博士后研究员 Ray Liu 和研究生 Paige Lamprecht 进行演示。首先，用含有钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将融合蛋白 Ecad 稀释至 15 微克/毫升。用 5 毫升稀释后的基质包被 100 毫米的悬浮组织培养皿，并在 37°C 下孵育至少 1 小时。孵育结束后，移除基质，替换为 5 毫升 iPSC 培养基。从液氮中取出一管冻存的人诱导多能干细胞。在37摄氏度下解冻，直至仅剩微小冰晶。然后，轻轻将细胞移入含有4毫升培养基的无菌15毫升锥形管中。将细胞在300 G条件下离心五分钟。弃去上清液，用五毫升添加了10 µM Y-27632（一种Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶的选择性抑制剂）的培养基轻柔重悬细胞。随后，移除Ecad包被的10 mm悬浮组织培养皿中的培养基，并加入五毫升上述细胞悬液。当iPSCs生长至约80%融合度时，移除培养基，并用无钙、无镁的DPBS洗涤一次。吸除DPBS，加入足量0.02%EDTA溶液覆盖培养皿。随后，于室温孵育细胞最多三分钟。一旦细胞开始脱落，立即移除0.02% EDTA溶液，并向培养皿中加入10 mL M培养基以释放细胞。通过轻柔吹打促进iPSC的脱离。将悬浮细胞的1/10转移至含有5 mL M培养基的新鲜Ecad包被的组织培养皿中。将培养物在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育，每天更换培养基。取一管250微升冰上保存的基质储备液（浓度为2毫克/毫升），在冰上解冻。随后，用预冷的移液器将解冻后的基质与10毫升冷的DMEM/F12培养基轻轻混合，使其终浓度为0.05毫克/毫升。将100微升稀释后的基质转移至96孔组织培养板的每孔中。将培养板置于37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育至少1小时。孵育结束后，弃去基质，每孔加入50微升M培养基，对剩余的培养板重复相同的包被步骤。现在，将iPSCs在100毫米培养皿中培养，直至细胞融合度接近80%。从每个100毫米培养皿中收获iPSCs时，吸除培养基，并用5毫升DPBS冲洗。弃去冲洗液后，加入3毫升细胞解离溶液（如Accutase）。然后，在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育约两分钟。一旦细胞开始脱落，立即加入7毫升M培养基进行收集。反复吹打数次，将细胞集落解离为含有约3至6个细胞的小细胞团。接下来，将iPSCs收集到一个15毫升无菌离心管中，在300 ×g条件下离心5分钟。离心结束后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升M培养基中。使用多通道移液器，每孔加入50微升细胞悬液，将细胞均匀分配至96孔基质包被板中。然后，在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下将细胞培养过夜，并对剩余的培养板重复细胞接种步骤。通过显微镜检查96孔板，确保每个孔内的细胞覆盖至少70%的孔底表面。在分化第1天至第2天，将培养基更换为每孔100 µL基于RPMI的分化培养基。然后，在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下培养细胞，每天更换培养基，持续两天。从分化第三天至第五天，将培养基更换为100微升含2% B27和100纳克/毫升活性NA的RPMI基础分化培养基。在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下继续培养三天，每天更换培养基。在分化第五天，每孔加入100微升0.02% EDTA溶液处理30秒，随后立即移除溶液。加入100微升新鲜的RPMI基础分化培养基，并对剩余的培养板重复相同操作。在第6至第10天的分化期间，将培养基更换为100微升RPMI基础分化培养基。将细胞在37°C、4%氧气和5%二氧化碳条件下培养5天，每天更换培养基。在第11至15天的分化阶段，将培养基更换为100微升基于RPMI的分化培养基，添加2% B27和20纳克/毫升HGF。将细胞在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下培养五天，每天更换培养基。在第16至20天的分化阶段，将培养基更换为添加了20纳克/毫升oncostatin-M的肝细胞培养基。将细胞在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下培养五天，每天更换培养基。在第20天完成分化后，将培养基更换为100微升新鲜的肝细胞培养基，其中添加20纳克/毫升的抑癌蛋白M。继续孵育24小时后，将培养基收集至新的96孔板中，并于20摄氏度保存。对剩余的孔板重复相同的收集步骤。向96孔板的每孔中加入90微升新鲜的肝细胞培养基，并补充oncostatin-M。从预先配制的工作储备液中，向每孔加入10微升选定的化合物。向对照孔中加入 DMSO 至终浓度为 0.2%，以与处理样品中的终浓度一致。孵育 24 小时后，将培养基收集至新的 96 孔板中，并在 -20 °C 下保存。对剩余的各块培养板重复相同的收集步骤。经过五天的处理后，细胞会表达定型内胚层特征性的蛋白。再经过五天的分化，内胚层转化为肝细胞命运，细胞表达FOXA2和HNF4a。添加HGF后，细胞表达胎儿肝细胞中常见的蛋白；分化完成时，细胞呈现立方状形态，细胞核含有明显的核仁，细胞质较大，并含有多个脂滴。在分化第20天通过免疫染色检测HNF4a和白蛋白，结果显示这些肝细胞蛋白在所有孔中的分布相似。利用iPSC筛选降低APOB的化合物，以此为例说明iPSC来源的肝细胞可用于小分子筛选。APOB检测的z因子为0.73，证实该平台适用于药物发现。针对每种化合物，计算了药物处理后与处理前的APOB比值。通过z分数分析确定了阳性结果。共鉴定出24个潜在阳性化合物，其APOB比值范围为0.86至0.44。在排除对细胞活力有负面影响的化合物后，发现有两种化合物在降低 APOB 方面具有可重复性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 25 天内完成。在进行该实验过程中，需注意每天配制新鲜培养基。由于组分降解导致的浓度不正确将改变细胞的分化能力。该技术开发完成后，为药物发现领域的研究人员利用人诱导性多能干细胞探索肝脏疾病的治疗方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和维持人诱导性多能干细胞，并在小表面积压制形式下进行肝向分化，以用于高通量筛选。请注意，操作人类诱导性多能干细胞可能具有极高的危险性，因此在进行本实验操作时，必须始终佩戴个人防护装备，例如手套和实验服。

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人诱导多潜能干细胞衍生肝细胞的药物发现方法

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本文介绍了一种可扩展且符合优良生产规范（GMP）的人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的体系。该体系为开展基础和应用型人类肝脏研究提供了成本效益高且标准化的人肝细胞样细胞制备方法。...

由人多能干细胞定义明确且可扩展地生成肝细胞样细胞

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。...

活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

学习将人诱导多潜能干细胞分化为肝细胞样细胞的方法，用于高通量药物筛选平台。该技术可生成无限数量的患者特异性肝细胞，为肝病治疗研究提供可重复的筛选工具。

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

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