微流控芯片中微柱结构内生物膜流束形成的实验方案

本实验的总体目标是演示在带有微柱结构的微流控装置中形成细菌流线体的过程。首先通过制备微流控芯片来实现该目标，实验的第二步是培养待测细菌，此处为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）。

最后的步骤是组装实验装置，将细菌注入微流控芯片，并收集数据。最终，结果可以通过荧光显微镜图像展示流光随时间的演化过程。对该方法的可视化演示至关重要，因为各个步骤较难掌握。

由于该实验具有跨学科性质，本实验步骤需要采用深反应离子刻蚀的硅片。应将硅片上的光刻胶清洗干净。首先对母模进行疏水处理。

向小瓶中加入两到三滴三氯乙烯，并将其与模具一同放入干燥器中，模具需倒置放置在旁边。两到三小时后，模具将完成硅烷化处理。在硅烷化过程中，准备PDMS混合物：按10比1的比例混合Sylgard 184硅胶基础剂与固化剂。

然后在真空条件下对PDMS脱气约两个小时。将硅化晶圆转移至支架上，并将PDMS倾倒于其上，确保不产生气泡。在80摄氏度下使PDMS在晶圆上固化两小时。

利用尺寸合适的硅模具制备A-P-D-M-S印章。固化完成后，在切割刀的辅助下剥离PDMS印章，然后使用切割刀将印章切割成微流控芯片。

现在，使用打孔器在印章的入口和出口位置钻孔。下一步是将印章与玻璃键合。将24毫米的盖玻片和PDMS印章置于氧气等离子体中处理30秒。

暴露后，将盖玻片贴附到 PDMS 印模的底面，形成键合。将组装好的样品置于 70 摄氏度的烘箱中加热 10 分钟。为完成本方案的流程，准备用超纯水配制的 LB 培养基平板，并在 50 至 55 摄氏度时加入终浓度为 50 微克/毫升的四环素。

倒平板时，可用火焰灼烧去除气泡。冷却凝固后的平板应标注日期，并用锡箔纸包裹后于4摄氏度保存。同时，准备好用超纯水配制并添加50微克/毫升四环素的LB肉汤。

将肉汤置于 4°C 保存，并用锡箔纸包裹。现在将保存在 -80°C 的荧光假单胞菌菌种在 LB 平板上划线，以锯齿形模式划线，并在 30°C 黑暗条件下过夜培养。次日，从平板上挑取一个菌落，接种至新鲜配制的 S 培养基中，在 30°C、150 RPM 振荡条件下过夜培养。

孵育结束后测定培养物的光密度。然后制备 S2 溶液。向一个塑料离心管中加入 5 毫升 LB 培养基，再加入适量的 S1 溶液，使 600 纳米处的光密度（OD）达到 0.1，这在生物膜实验中是典型值。

首先，使用镊子设置实验。将内径为 0.20 英寸的塑料管连接到已准备好的芯片的入口和出口。这些管子必须具有柔韧性且足够长，此处约为 20 英寸。

然后用 S2 溶液填充注射器。安装 30 号钝头针头并去除气泡。防止气泡进入通道是关键步骤，尤其是在实验持续时间较长的情况下。

气泡可能会损坏细菌形成的柔软结构。然后将注射器连接到进样管，并将出样管连接至废液容器。接着将注射器放入注射泵中，并将泵设置为所需的流速，例如每小时8 µL，在配备有细胞培养腔且温度设定为孵育温度的显微镜下进行操作。

使用40倍物镜观察微流控芯片。现在启动泵。当细菌被引入腔室时，生物膜的形成也随之开始。

生物膜将经历数小时至数天的形成与成熟过程，需拍摄图像以追踪其进展。使用SEMA制备的微流控芯片进行成像，该芯片设计有叉状入口，以均衡装置内的压力差。

还可以观察到，柱状结构的侧壁几乎呈垂直状。为了观察生物膜的形成，以每小时八微升（8 µL/h）的速度将荧光物质注入装置中。在注入稀释的细菌培养液数分钟后，生物膜的形成即开始。

然而，数小时后，在微柱之间中段附近观察到丝状结构的出现。虚线椭圆标示了正在形成的流束，这些流束一端锚定在微柱的极区位置。在两个微柱之间的对角线上也观察到了流束。

由于细胞分裂以及浮游细菌的加入，菌丝的厚度随时间增加。随着时间推移，菌丝不断增殖，占据装置内的较大体积，进而形成成熟的生物膜，可能导致装置堵塞。对流体通过该装置的力学模拟显示，菌丝最初沿流体的流线方向排列。

此外，在初始阶段，生物膜细丝在流速最高的位置开始形成。观看本视频后，您应能充分理解生物膜细丝在微流控环境中形成与演化的机制。请务必注意，操作细菌可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取生物安全防护等预防措施。