培养秀丽隐杆线虫在无菌液体介质与创造转基因蠕虫通过微粒轰击

线虫通常生长在固体琼脂平板或液体培养基接种大肠杆菌大肠杆菌 。为了防止细菌副产品混杂毒理学和营养研究，我们利用的无菌液体介质，CeHR，成长和同步大量的蠕虫病毒对各种下游应用。

该程序的总体目标是在 CENIC 液体培养基中引入和发展 Sea Elegance，用于众多下游应用。这是通过首先从饥饿的琼脂平板中漂白坟虫来实现的。该程序的第二步是用抗生素将释放的卵子转移到 M-C-E-H-R，并让它们发育到严重阶段，这可能需要 7 到 10 天。

第三步是漂白坟墓，让它们第二次发展到坟墓阶段，而无需额外的抗生素。最后一步是同步 Axe 蠕虫并利用它们进行营养研究，检查蠕虫的生长和发育。最终，结果表明，野生 C 型 elegance 在 Axe 液体培养基中生长良好，并且 M-C-E-H-R 培养基可用于检查蠕虫的营养需求，而无需细菌副产物。

与现有方法（例如在琼脂平板或含有细菌的液体培养基中培养蠕虫）相比，该技术的主要优点是可以测试营养元素或毒素的影响，而不会混淆细菌副产物。通常，由于培养基制备和蠕虫对 EMIC 液体培养基的初步适应，刚接触这种方法的个体会很挣扎。该程序描述了 M-C-E-H-R-A 液体培养基的制备，该培养基允许 C elegance 在没有细菌食物来源的情况下生长。

在通风橱下使用严格无菌技术，按以下顺序混合 M-C-E-H-R 的成分。从胆碱、柠檬酸二酯开始，然后是维生素和生长因子。混合 myo 乙酰醇、人氯化物，最后加入去离子水 通过 0.22 微米过滤器用吸力过滤 M-C-E-H-R 混合物。

接下来按以下顺序，加入核酸，混合矿物质混合物、乳糖、白蛋白、水解物、必需氨基酸、非必需氨基酸、磷酸钾、deg、葡萄糖堆、钠盐和去离子水。现在再次用吸力过滤混合物。过滤后，向培养基中加入胆固醇，然后检查等分培养基的 pH 值。

pH 值应在 6 到 6.5 之间。如果溶液制备正确，则使用严格的无菌技术将 20% 体积的巴氏杀菌牛奶添加到 M-C-E-H-R 培养基中。将培养基储存在 4 摄氏度。

准备好 10 个 60 毫米 NGM 板，里面装满了 GR 蠕虫，这些蠕虫已经消耗了大部分可用的 OP 50 大肠杆菌。将这些蠕虫冲洗到 50 毫升锥形管中。每板使用 5 毫升 M 9 缓冲液，让蠕虫沉淀，然后小心去除上清液。

重复此作，再冲洗两次 通过添加 M 9 缓冲液，让蠕虫沉淀并去除上清液，然后向蠕虫聚集体中加入 6 倍体积的 0.1 正常氯化钠，现在与蠕虫悬浮液相比，制备一种含有一体积的 5 种正常氢氧化钠和两体积新鲜漂白剂的混合物。解决方案 通过将这种混合物添加到悬浮液中来漂白蠕虫。接下来涡旋，混合直到坟虫溶解，只剩下卵留在悬浮液中。

这需要 5 到 10 分钟。使用具有 10 倍物镜的相差显微镜监测管中的该反应。分离出鸡蛋后，以 800 G 的浓度沉淀 45 秒，并在 4 摄氏度下，吸出上清液并在通风橱中用 10 毫升无菌水冲洗沉淀两次，重复离心和吸液以进行这些冲洗。

接下来，用 M-C-E-H-R 培养基重悬鸡蛋沉淀，并将释放的鸡蛋转移到组织培养瓶中。向烧瓶中的鸡蛋中加入每毫升 100 微克四环素。此步骤应在层流罩中进行。

使用严格无菌技术，将液体培养物转移到 20 摄氏度的培养箱中，并在轨道平台上培养。70 RPM 的摇床每天监测蠕虫的发展。7 到 10 天后，蠕虫应发育到 Ravi 阶段，将蠕虫转移到锥形管中，并在 4 摄氏度下以 800 G 的浓度沉淀 5 分钟。

吸出上清液后，将蠕虫沉淀重悬于一体积的 0.1 摩尔氯化钠中，并让蠕虫在冰上沉淀 5 分钟。现在，重复上述漂白程序，并在 cenic 液体培养基中培养鸡蛋。和以前一样，在培养蠕虫盟友时使用无菌技术是必不可少的。

避免使用抗生素可确保 Sea Elegance 菌种确实没有污染细菌。当重复培养过程时，第二代从培养基中释放四环素。此时，可以准备同步的区域性以进行同步。

向 GR 蠕虫漂白后释放的卵中加入 10 毫升 M 9 缓冲液，让它们在 20 摄氏度的轨道平台上孵化过夜。第二天摇床，以 800 G 的浓度沉淀幼虫 5 分钟，然后重悬 L 1 幼虫。在 10 毫升 M-C-E-H-R 中，将悬浮液转移到 25 平方厘米的烧瓶中，并将它们生长至最大密度。

每隔几天检查一次蠕虫的生长是必要的，以确保蠕虫不会变得太拥挤并耗尽培养基中可用的营养物质。为了储存 axen 蠕虫培养物，将蠕虫沉淀悬浮在储存瓶中的 0.5 ml S 缓冲液中，加入一体积的 S 缓冲液和 30% 甘油。然后将小瓶转移到零下 80 摄氏度，然后在液氮中长期储存以解冻蠕虫，在 37 摄氏度下孵育小瓶，直到几乎所有的冰都融化，这大约需要两分钟。

然后在无菌条件下，将它们转移回 M-C-E-H-R 培养基中。使用 M-C-E-H-R 的一个优势是在检查蠕虫发育的确切营养需求的研究中看到的。蠕虫在 M-C-E-H-R 中生长，并补充越来越多的血红素以确定血红素的低最佳和毒性水平。

此外，使用逆血红素反应报告菌株间接评估较小浓度范围内的蠕虫的血红素状态。这些生长在 4 微摩尔血红素处的蠕虫显示出高荧光，表明蠕虫处于低血红素环境中。当血红素浓度增加到 8 微摩尔时，GFP 表达下降。

当血红素浓度增加到 10 微摩尔时，蠕虫表现出非常少的 GFP 表达，而在 20 微摩尔血红素时，它们没有表现出 GFP 表达。在尝试此程序时，重要的是要记住使用严格无菌的技术，以确保培养物是 emic 并防止细菌污染。看完这个视频后，你应该能够让 M-C-E-H-R 建立和维护一种 xenex sea elegance 文化，该文化可用于需要大量 sea elegance 的广泛应用。