Name: 培养秀丽隐杆线虫在无菌液体介质与创造转基因蠕虫通过微粒轰击 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习在无菌液体培养基CeHR中培养秀丽隐杆线虫并进行同步化处理的方法。该技术可消除细菌副产物干扰，用于研究线虫营养需求与发育生物学的精确实验。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为DK85035和DK074797（I.H）。

1. 线虫品系
<ol>
	<li>获取 秀丽隐杆线虫 野生型 布里斯托尔 N2品系来自 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC）（http://www.cbs.umn.edu/cgc）并在接种有细菌的NGM平板上培养 E. coli 菌株 OP507注意：转基因线虫品系 IQ6011（Phrg-1::GFP) 的使用是按照先前所述方法构建的11. IQ6011 可向通讯作者索取。</li>
</ol>
2. 改良秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养与繁殖培养基（mCeHR）的制备
按照以下方法制备 mCeHR 液体培养基12。该无菌液体培养基可使线虫在无需额外食物来源的情况下生长。所有无菌液体培养基及无菌线虫的操作均须在严格无菌条件下进行，例如使用层流罩。
<ol>
	<li>从杂货店获取超高温灭菌的脱脂牛奶。使用冷藏产品，而非室温保存的产品。在用于 mCeHR 培养基之前，将牛奶划线接种于脑心浸出液（BHI）琼脂平板上，在 30 °C 和 37 °C 下分别孵育 3 天，以检测无菌性。将牛奶转移至 50 ml 无菌离心管中，并在 -80 °C 下保存。</li>
	<li>按以下顺序和用量分别配制各组分，以制备 1 L&#160;的 mCeHR（表 1A）：10 ml 2 mM 柠檬酸胆碱二酸、10 ml 维生素与生长因子混合液（配方见 表 1B）、10 ml 2.4 mM myo-肌醇、10 ml 2 mM 氯化血红素、250 ml 去离子水。施加负压，通过 0.22 μm 滤器过滤。</li>
	<li>加入 20 ml 核酸混合液（配方见 表 1C）、100 ml 矿物质混合液（配方见 表 1D）、20 ml 170 mg/ml 酪蛋白水解物、20 ml 必需氨基酸混合液、10 ml 非必需氨基酸混合液、20 ml 450 mM KH2PO4、50 ml 1.45 M D-葡萄糖、10 ml 1 M HEPES 钠&#160;盐、250 ml 去离子水。</li>
	<li>施加负压过滤灭菌各组分。取下滤器后，加入 1 ml 5 mg/ml 胆固醇溶液。确保培养基的 pH 值约为 6–6.5。注意：该溶液可在 -80 °C 下保存长达一年。</li>
	<li>使用前，在 mCeHR 培养基中加入 20%（v/v）超高温灭菌的有机脱脂牛奶。开启和分装牛奶时，必须严格采用无菌操作技术（例如在超净工作台内进行）。将培养基储存于 4 °C。</li>
</ol>
3. 准备秀丽隐杆线虫（C. elegans）以用于无菌mCeHR液体培养基中的培养
<ol>
	<li>在十个 60&#160;mm NGM 平板上培养线虫，直至出现大量怀卵线虫且平板上 OP50 E. coli 细菌残留极少。</li>
	<li>用 5 ml M9 缓冲液（配方见表 1F）冲洗每个平板上的线虫，并将冲洗液收集至一个 50 ml 的锥形管中。</li>
	<li>将锥形管静置 5 到 10 分钟&#160;，使线虫沉降，然后小心移除含有 E. coli 的上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.2 和 3.3 两次，以尽可能去除残留细菌，然后再继续后续操作。</li>
	<li>将线虫重悬于 0.1 N NaCl 溶液中，体积应为 3 的倍数，例如 1.5 ml、3 ml 或 6 ml，确保在管中可清晰观察到单个线虫。</li>
	<li>按照 1:2:6 的比例向线虫悬液中加入 5 N NaOH 和 5% 次氯酸钠（漂白剂）溶液进行漂白处理。例如，1 ml 5 N NaOH : 2 ml 5% 次氯酸钠 : 6 ml 线虫悬液。在加入线虫悬液前，先将 NaOH 与漂白剂混合。</li>
	<li>剧烈涡旋震荡溶液，直至怀卵线虫完全溶解，悬液中仅可见卵（约需 5 至 10 分钟）。使用 10X 物镜的相差显微镜监测该过程。</li>
	<li>线虫完全溶解后，立即在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 45 秒，使卵沉淀。弃去上清液，并用 10 ml 无菌水将沉淀清洗两次，每次均在 4 °C 条件下以 800 × g 离心 45 秒。</li>
	<li>漂白处理后，将卵沉淀转移至含有 10 ml mCeHR 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中，培养基中添加 100 μg/ml 四环素。操作过程中需采用无菌技术。如需要，可额外添加抗生素（如 250 μg/ml 萘啶酸），以防止无菌液体培养物中细菌生长。</li>
	<li>将液体培养物置于摇床培养箱中，在 20 °C、约 70 rpm 条件下培养。</li>
	<li>每日观察线虫，记录其发育阶段和生长速度。 
	注意：线虫在初始阶段生长较慢，需 7 至 10 天才能达到怀卵阶段。然而，随着线虫逐渐适应液体培养环境，野生型（N2）线虫的世代时间将缩短至约 4 天。</li>
	<li>当线虫在液体培养基中发育至怀卵阶段后，将线虫培养物转移至锥形管中，并在 4 °C 条件下使用水平转子以 800 × g 离心 5 分钟&#160;，使线虫沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，用等体积的 0.1 M NaCl 轻柔重悬线虫沉淀。例如，若线虫在 10 ml mCeHR 培养基中培养，则使用 10 ml 0.1 M NaCl。将重悬液置于冰上静置 5 分钟&#160;，使线虫沉降。</li>
	<li>按照上述步骤 3.5–3.8 所述方法进行漂白处理，并将线虫在无菌液体培养基中继续培养至第二代。如有必要，可再次添加抗生素以抑制细菌生长。</li>
	<li>再次让线虫发育至怀卵阶段，然后按照步骤 3.12 和 3.13 所述方法将线虫沉淀并重悬于 0.1 M NaCl 中，再按步骤 3.5–3.8 所述方法再次漂白，以获得同步化的群体。此后，在无抗生素的液体培养基中培养 L1 幼虫。</li>
</ol>
4. 从液体培养物中同步线虫
<ol>
	<li>按照上述步骤 3.12 和 3.13 所述，将线虫离心成团并重悬于 0.1 M NaCl 溶液中。按照上述步骤 3.5–3.8 所述进行漂白处理。</li>
	<li>将卵团重悬于 10 ml M9 缓冲液中，并在 20 °C 下于旋转摇床上过夜孵化幼虫。注意：卵将孵化为 L1 幼虫，但不会进一步发育，从而使线虫同步于 L1 阶段。</li>
	<li>为维持和传代培养线虫，将 L1 幼虫在 800 × g 下离心 5 分钟，随后重悬于 10 ml mCeHR 培养基中，并转移至 25 cm2 的培养瓶。将培养瓶置于 20 °C 下在旋转摇床上培养。为确保线虫获得充足营养，维持密度不超过 3,000 条线虫/ml/cm2。 
	注意：在此阶段，若在超净台中采用无菌操作技术进行操作，则无需添加抗生素即可维持无菌条件。应每天检查线虫以监测其生长情况。</li>
</ol>
5. 用于无菌培养基培养的线虫冻融方法
<ol>
	<li>将无菌异步培养的线虫或同步化的L1幼虫在液氮中冷冻。以800 × g离心5分钟收集线虫，然后重悬于S缓冲液（6.45 mM KHPO₄）中4，43.55 mM KHPO4，146.25 mM NaCl），每管使用0.5 ml。向每管中加入等体积含30% v/v甘油的S缓冲液，将线虫转移至-80 °C保存，随后长期储存于液氮中2. 冻存约 1 x 106 每管每毫升虫数</li>
	<li>将冻存管在37 °C孵育约2分钟，直至冰几乎完全融化，以解冻线虫。在超净工作台中，将线虫转移至含有mCeHR的无菌烧瓶中，并置于20 °C培养。</li>
</ol>
6. 确定血红素浓度对mCeHR生长和繁殖的影响
<ol>
	<li>使用无菌 mCeHR 培养基检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）的营养依赖性生长。为确定血红素浓度对线虫生长和发育的影响，使用同步化的无菌 N2 线虫或其他目标品系。按照上述第 4 节所述方法同步化 L1 幼虫。</li>
	<li>次日，离心收集并计数同步化的 L1 幼虫，用无菌培养基稀释至每 μl 含 1 条线虫。用 0.3 M NH4OH 配制 10 mM 氯化血红素，并用浓盐酸调节 pH 至 8。</li>
	<li>向 24 孔板中每孔加入 800 μl mCeHR 培养基。每孔加入 100 μl 培养基，含 100 条线虫。在每孔中加入氯化血红素，终浓度分别为 0 μM、1.5 μM 至 1,000 μM，每组设三个重复。确保所有孔中 NH4OH 的终浓度均为 0.3 M。加样前轻轻重悬线虫，以保证每孔准确加入 100 条 L1 幼虫。</li>
	<li>每天观察线虫生长情况，记录各孔中不同浓度下的生长表现。培养 9 天后计数每孔线虫数量，并绘制对应于各血红素浓度的线虫数/ml 曲线（图 1）。</li>
</ol>
7. 血红素浓度对血红素感应线虫的影响
<ol>
	<li>孵育同步化的L1期血红素感应线虫（Phrg-1::gfp) 在含有 4 μM、8 μM、10 μM 和 20 μM 血红素的 mCeHR 中</li>
	<li>使用荧光共聚焦显微镜对线虫进行成像，48 小时&#160;孵育后（图2).</li>
</ol>
8. 利用mCeHR通过微粒轰击法产生转基因C. elegans&#160;
注意：使用在mCeHR培养基中培养的unc-119(ed3)线虫进行微粒轰击的制备与操作步骤详见图313。
<ol>
	<li>线虫准备
	<ol>
		<li>在轰击前一周，将约 1 × 106 条不同步的 unc-119(ed3) 线虫转移至含有 90 ml mCeHR 培养基的 175 cm2 培养瓶中。将培养瓶置于 20 °C、约 70 rpm 的摇床上培养（图 3-1）。 
		注意：一周后，线虫密度应显著增加，出现大量成年 gravid 线虫。微粒轰击需要约 3 × 107 条线虫。</li>
		<li>将接种了 JM109 E. coli 的 10 cm NGM 平板置于冰上预冷。</li>
		<li>将无菌线虫转移至两个 50 ml 圆锥形离心管中，在 800 × g 条件下离心 2 分钟。吸除上清液，并在每管中加入 50 ml M9 缓冲液重悬线虫（图 3-2）。</li>
		<li>将成年线虫在冰上静置 10 至 15 分钟&#160;，使其自然沉降。 
		注意：此时应获得约 2 ml 的线虫沉淀，其中成年线虫比例应&#62;90%。该 2 ml 沉淀约含 5 × 106 条线虫，足够进行一次微粒轰击。</li>
		<li>用 2 ml 线虫沉淀均匀涂布于预冷的、接种 JM109 的 NGM 平板表面。待液体完全吸收后，将平板继续在冰上放置 30 分钟&#160;，再进行后续操作（图 3-3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金颗粒的制备
	<ol>
		<li>称取 30 mg 金颗粒加入硅化处理的微量离心管中，加入 1 ml 70% 乙醇，涡旋振荡 5 分钟。</li>
		<li>静置 15 分钟后，在 6,000 × g 条件下离心 10 秒使金颗粒沉淀。用移液枪头小心接触管壁远离金颗粒的一侧，吸除上清液。</li>
		<li>用 1 ml 无菌水洗涤金颗粒，涡旋 1 分钟&#160;，并在 6,000 × g 条件下短暂离心 10 秒。重复洗涤两次后，将金颗粒重悬于 0.5 ml 无菌的 50% 甘油溶液中。 
		注意：金颗粒终浓度为 60 mg/ml，可在 4 °C 保存 1 至 2 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 DNA-金颗粒混合物
	<ol>
		<li>在硅化处理的 1.5 ml 微量离心管中，加入 10 μg 目标质粒 DNA 和 10 μg unc-119 救援质粒 DNA。加入 50 μl 去离子水和 100 μl 充分重悬的金颗粒溶液，涡旋 1 分钟。</li>
		<li>加入 150 μl 2.5 M CaCl2，再次涡旋 1 分钟。向该溶液中加入 60 μl 0.1 M 亚精胺，涡旋 3 至 5 分钟。</li>
		<li>在 6,000 × g 条件下瞬时离心 10 秒，吸除上清液，加入 300 μl 70% 乙醇。充分涡旋 1&#160;分钟，在 6,000 × g 条件下瞬时离心，吸除上清液，再用 170 μl 100% 乙醇重悬。剧烈涡旋 5 至 10 分钟&#160;，再次瞬时离心并吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轰击（图 3-3） 
	注意：本方案使用材料/设备表中指定的粒子递送系统。请遵循所用粒子递送仪器的操作说明。
	<ol>
		<li>在 15 cm 培养皿中放入一张纸巾。用镊子将七个宏载体依次浸入 100% 乙醇中，取出后平放在纸巾上晾干。</li>
		<li>用 70% 乙醇彻底清洁基因枪室、宏载体架和靶板。每次轰击前均需清洁并高压灭菌阻断筛。</li>
		<li>用镊子将宏载体装入支架中，并使用 seating tool 将其压紧固定。</li>
		<li>将 20 μl DNA 包被的金颗粒溶液均匀涂布于每个宏载体中心，待其完全干燥。</li>
		<li>用乙醇清洁压力分配器的两个部件，并与经乙醇清洁的破裂盘组装。将组装好的压力分配器和破裂盘旋入轰击室中。</li>
		<li>将高压灭菌后的阻断筛与宏载体架组装，并将装置放置于指定金属架上并锁紧。</li>
		<li>将组装好的宏载体装置插入基因枪室中压力分配器下方的指定插槽，并与压力分配器对齐。</li>
		<li>用胶带将含有线虫的敞口 NGM 平板固定在靶板架上，关闭轰击室门。</li>
		<li>进行轰击时，调节压力至足以击破破裂盘的水平。开启真空至 28 英寸汞柱压力，然后按下发射按钮直至破裂盘破裂。</li>
		<li>释放真空，取出 NGM 平板。将线虫从平板上洗下，并重新分配至二十个接种 JM109 E. coli 的 10 cm NGM 平板中（图 3-4）。</li>
		<li>将线虫在 25 °C 培养 10 至 14 天，直至平板上食物耗尽。能够从 unc-119 缺陷中被拯救的线虫将表现出正常运动能力，此时可进行识别。从不同的平板中挑选至少 10 条“野生型”线虫进行进一步分析，这些代表独立的转基因品系（图 3-5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。

在本方案中，我们介绍了一种改良的无菌液体培养基mCeHR，可实现快速生长 秀丽隐杆线虫 大量产虫，具有多种优势，例如在无污染条件下培养线虫 E. coli 或细菌代谢产物，并可在营养学和毒理学研究中加以利用。其在营养学和毒理学研究中的应用 E. coli 在这些研究中使用其他细菌存在若干缺点。例如，细菌的生长可能在不同条件下发生变化，且细菌可能代谢正在检测的分子，从而干扰结果的解读。因此，开发一种成分明确的培养基来开展这些研究具有显著优势。
尽管先前的研究已在液体培养基中培养 C. elegans15，但在秀丽隐杆线虫维持培养基（CeMM）中生长的线虫表现出明显的世代时间延迟16，这与我们在 mCeHR 培养基中观察到的情况不同。我们的主要目标是利用 C. elegans 研究营养稳态，特别关注血红素和金属代谢。基于这一目标，我们课题组开发的 mCeHR 及其改良版本成功实现了该目的，并直接促成了多个维持线虫血红素稳态所需基因的发现，这些发现最终也适...

土壤线虫， 秀丽隐杆线虫，是一种在遗传学至毒理学等多个研究领域中广泛使用的强大模式生物。由于其体长约1毫米、繁殖周期仅需四天、易于培养且子代数量众多，这些线虫已被广泛应用于多种遗传学和药理学筛选研究中1,2研究人员利用这种蠕虫来鉴定在脊椎动物系统中保守的分子和信号通路，这些通路包括细胞死亡信号、衰老与代谢通路，以及神经系统。3-6。此外，透明度的 秀丽隐杆线虫 可利用荧光蛋白报告基因生成转基因品系，通过直接观察荧光信号来分析基因表达模式和蛋白质定位。
在许多研究中，这种线虫通常在固体琼脂培养基表面培养，使用线虫生长培养基（NGM）平板，或在液体培养基中接种大肠杆菌（Escherichia coli）作为食物来源7,8。这些细菌性食物来源可能因细菌副产物的干扰而影响生化和毒理学研究的结果解读。为避免这些混杂效应，可将秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养于无菌的液体培养基中，该培养基不含细菌作为食物来源。利用该培养基，我们成功培养了数百万条高度同步化的线虫，适用于多种标准的C. elegans实验方案，包括对暴露于不同血红素浓度下的C. elegans中差异表达基因进行微阵列分析，以及通过基因轰击法产生转基因线虫。该培养基为化学成分明确的培养基，是在Eric Clegg博士最初提出的配方基础上改良而来9。利用这种mCeHR培养基，我们已成功鉴定出参与血红素稳态调控的基因，即血红素响应基因（hrgs）10，而此类基因的发现若在常规使用接种大肠杆菌（E. coli）的NGM琼脂平板的培养条件下则无法实现。
在本方案中，我们描述了引入和维持的步骤 秀丽隐杆线虫 培养于 大肠杆菌 到无菌的 mCeHR 培养基中，并利用该方法获得大量线虫用于制备转基因个体 秀丽隐杆线虫 通过微粒轰击法转化细胞系。我们还展示了利用无菌培养基确定营养需求的研究。 秀丽隐杆线虫 以血红素为例。这些研究表明，使用 mCeHR 培养基可实现大量细胞的快速生长 秀丽隐杆线虫 适用于线虫研究人员使用的多种下游应用。

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>西格玛</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>西格玛</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸钾</td><td>西格玛</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>费舍尔</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>费舍尔</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>西格玛</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>费舍尔</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>5'-单磷酸腺苷，钠盐</td><td>西格玛</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>5'-胞苷酸</td><td>西格玛</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>2'-和3'-单磷酸鸟苷</td><td>西格玛</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>5'-尿苷酸，二钠盐</td><td>西格玛</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶</td><td>西格玛</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰葡萄糖胺</td><td>西格玛</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-丙氨酸</td><td>费舍尔</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>对氨基苯甲酸</td><td>西格玛</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>西格玛</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>氰钴胺（B-12）</td><td>西格玛</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸钙</td><td>西格玛</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>西格玛</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>西格玛</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>泛酸硫辛胺</td><td>西格玛</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>泛酸钙</td><td>西格玛</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>蝶酰谷氨酸（叶酸）</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>5'-磷酸吡哆醛</td><td>西格玛</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆胺</td><td>西格玛</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆醇</td><td>西格玛</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>核黄素5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>西格玛</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>西格玛</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-硫辛酸</td><td>西格玛</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>二酸柠檬酸胆碱</td><td>西格玛</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-肌醇</td><td>西格玛</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>西格玛</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>乳清蛋白酶水解物</td><td>西格玛</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>氯化血红素</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，钠盐</td><td>西格玛</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>英潍捷基</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM氨基酸溶液</td><td>英潍捷基</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>萘啶酸钠</td><td>西格玛</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>基因枪递送系统</td><td>伯乐</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>金颗粒（金粉）&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>或</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金颗粒 1.0 &amp;mu;m</td><td>伯乐</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

培养 秀丽隐杆线虫 在无菌液体培养基中培养及通过微粒轰击法创建转基因蠕虫

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

在本实验方案中，我们介绍了制备改良型&#160;C. elegans&#160;习服与繁殖培养基（mCeHR）所需的材料及操作步骤。此外，还描述了将生长在E. coli上的C. elegans暴露并适应无菌液体培养基的步骤。最后，通过利用无菌C. elegans开展的下游实验展示了该方法的优势。通过在含不同血红素浓度的无菌液体培养基中培养N2野生型线虫，展示了分析和确定C. elegans&#160;营养需求的能力。该方法可推广应用于其他营养物质，以确定线虫生长和发育的最适浓度，或评估药物处理的毒理学效应。通过定性显微观察以及定量统计在不同血红素浓度下生长的线虫数量，确定了不同血红素浓度对野生型线虫生长的影响。此外，还可利用表达荧光传感器的线虫来检测特定营养物质浓度变化所引起的影响，该传感器可响应目标营养物质的变化。此外，通过该方法可轻松获得大量线虫，用于通过微粒轰击法创制转基因C. elegans。

在无菌液体培养基中培养C. elegans有助于确定线虫所需的营养成分，同时避免了大肠杆菌（E. coli）产生的次级代谢产物的干扰。野生型N2线虫在mCeHR培养基中经过三代即可适应，其生长情况与在NGM细菌平板上培养的线虫相当。事实上，这些线虫在4天内即达到产卵期，而生长在OP50细菌上的线虫则需3.5天。
使用mCeHR的一个优势体现在对这些线虫精确营养需求的研究中14。在图1中，线虫在添加了递增浓度血红素（最高达1 mM）的mCeHR培养基中培养。观察发现，当血红素浓度低于4 μM时，线虫生长明显延迟，仅能发育至L4幼虫阶段，但在mCeHR中培养9天后无法进入产卵阶段。当血红素浓度为10 μM和20 μM时，线虫在4天内即可发育至产卵阶段，并产生大量后代。当线虫在含20 μM血红素的mCeHR中培养时，后代数量达到最大。在100 μM和500 μM血红素浓度下，线虫仍能继续发育并产生后代，但与在20 μM血红素（最佳浓度）下培养的线虫相比，其幼虫后代数量显著减少。当血红素浓度达到或超...

C. elegans 通常在接种了 E. coli 的固体琼脂平板或液体培养基中培养。为了防止细菌代谢产物对毒理学和营养学研究造成干扰，我们采用了一种无菌液体培养基 CeHR，用于大量培养并同步化线虫，以满足多种下游应用的需求。

在本方案中，我们介绍了制备改良的秀丽隐杆线虫习惯化与繁殖培养基所需的材料及步骤……

本实验的总体目标是在CENIC液体培养基中引入并培养海葵，以用于多种后续应用。首先从饥饿的琼脂平板上漂白水母幼虫，完成第一步。实验的第二步是将释放的卵转移至含抗生素的M-C-E-H-R培养基中，使其发育至水母阶段，此过程可能需要7到10天。第三步是漂白线虫并让其再次发育至成虫阶段，此过程中不再添加抗生素。最后一步是同步化Axe线虫，并将其用于研究线虫生长与发育的营养学实验。最终结果显示，野生型秀丽隐杆线虫在Axe液体培养基中生长良好，且M-C-E-H-R培养基可用于在无细菌代谢产物干扰的情况下分析线虫的营养需求。与在含有细菌的琼脂平板或液体培养基中培养线虫的现有方法相比，该技术的主要优势在于，可以在不受细菌代谢产物干扰的情况下检测营养成分或毒素的作用。通常，初次接触该方法的研究人员会因培养基的制备以及线虫对EMIC液体培养基的初始适应过程而遇到困难。本实验方案描述了M-C-E-H-R-A液体培养基的制备方法，该培养基可支持秀丽隐杆线虫（C. elegans）在无细菌食物来源的条件下生长。在超净台内采用严格无菌技术，按以下顺序混合M-C-E-H-R的各组分：首先加入胆碱、二乙酸柠檬酸盐，随后加入维生素和生长因子；接着加入肌醇乙酰、人源氯化物，最后加入去离子水。使用0.22微米滤膜在负压条件下对M-C-E-H-R混合液进行过滤。接下来按以下顺序依次加入核酸、矿物混合物、乳液、白蛋白、水解物、必需氨基酸、非必需氨基酸、磷酸钾、deg、葡萄糖堆、钠盐和去离子水。现在再次用抽滤法过滤混合物。过滤后，向培养基中加入胆固醇，然后检测部分培养基的pH值。pH 应在 6 到 6.5 之间。如果溶液配制正确，使用严格的无菌操作技术，将巴氏灭菌牛奶以 20% 的体积加入 M-C-E-H-R 培养基中。将培养基储存在 4°C。准备10个直径60毫米的NGM平板，上面已布满消耗了大部分OP50大肠杆菌的GR线虫。用50毫升锥形管收集这些线虫。每块平板加入5毫升M9缓冲液，让线虫沉降后，小心吸除上清液。重复此步骤，再用 M9 缓冲液清洗两次：加入 M9 缓冲液，待线虫沉降后移除上清液。然后向线虫沉淀中加入六倍体积的 0.1 N 氯化钠溶液。与线虫悬浮液相比，此时配制一体积 5 N 氢氧化钠与两体积新鲜次氯酸钠溶液的混合液。将该混合液加入悬浮液中以漂白线虫。接下来涡旋振荡混合物，直至成虫线虫完全溶解，仅剩卵存在于悬浮液中。此步骤需要5到10分钟。使用10倍物镜的相差显微镜在试管中监测该反应。卵子分离后，在4摄氏度下以800 ×g离心45秒，吸除上清液，并在生物安全柜中用10毫升无菌水将沉淀清洗两次，每次清洗后均重复离心和吸除操作。接下来，用 M-C-E-H-R 培养基重悬卵沉淀，并将释放的卵转移至组织培养瓶中。向培养瓶中的卵加入终浓度为 100 微克/毫升的四环素。该步骤应在超净工作台中进行。采用严格的无菌技术，将液体培养物转移至 20 摄氏度的培养箱中，并在摇床中以 70 RPM 的转速进行培养。每天监测线虫的发育情况。7 到 10 天后，线虫应发育至 Ravi 阶段，将线虫转移至锥形管中，于 4 摄氏度下，使用摆动桶转子以 800 G 离心 5 分钟，收集沉淀。吸去上清液后，将线虫沉淀重悬于一体积的 0.1 摩尔氯化钠溶液中，并将线虫置于冰上静置五分钟。随后，重复上述漂白步骤，并将卵接种于 ceinic 液体培养基中进行培养。与之前相同，在培养线虫时必须采用无菌操作技术。避免使用抗生素可确保海鞘优雅培养物中确实无污染细菌。当重复进行培养过程至第二代时，培养物会将四环素从培养基中清除。此时，可制备同步化培养物以进行同步化处理。向经过漂白处理的 GR 蚕虫释放的卵中加入 10 毫升 M9 缓冲液，置于 20 摄氏度的旋转摇床上过夜孵化。次日震荡混匀，以 800 ×g 离心 5 分钟收集幼虫，重悬 L1 幼虫。将其转移至含 10 毫升 M-C-E-H-R 培养基的 25 平方厘米培养瓶中，培养至其达到最大密度。每隔几天检查一次蠕虫的生长情况是必要的，以确保蠕虫不会过于拥挤而耗尽培养基中的营养物质。储存无菌蠕虫培养物时，将蠕虫沉淀重悬于储存小瓶中的 0.5 毫升 S 缓冲液中，再加入等体积含 30% 甘油的 S 缓冲液。然后将小瓶转移至 -80°C，随后长期保存于液氮中。复苏蠕虫时，将小瓶在 37°C 下孵育，直至几乎所有的冰融化，大约需要两分钟。然后在无菌条件下，将其转移回 M-C-E-H-R 培养基中。使用 M-C-E-H-R 的一个优势体现在研究线虫发育对营养物质精确需求的研究中。通过在 M-C-E-H-R 中添加不同浓度的血红素培养线虫，以确定血红素的最低适宜浓度和毒性水平。此外，使用了一种血红素响应反转的报告菌株，以在较低浓度范围内间接评估线虫的血红素状态。在4 µM血红素条件下培养的这些线虫表现出强烈的荧光，表明线虫处于低血红素环境。当血红素浓度升高至8 µM时，GFP表达量下降。当血红素浓度增加至 10 微摩尔时，线虫表现出极少的 GFP 表达；而在 20 微摩尔血红素条件下，则未观察到 GFP 表达。在进行该实验操作时，必须始终注意采用严格的无菌技术，以确保培养物无菌并防止细菌污染。观看本视频后，您应能够制备 M-C-E-H-R，建立并维持秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养体系，该体系可用于多种需要大量线虫的研究应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

培养秀丽隐杆线虫在无菌液体介质与创造转基因蠕虫通过微粒轰击

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C.

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C.

通过基因枪转化法产生转基因 C. elegans

RNAi 铺板用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）饲喂：一种在大肠杆菌（E. coli）中诱导靶向 dsRNA 表达的技术

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫...

一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

本方案描述了一种利用紫外线（UV）照射将转基因染色体外阵列整合到Caenorhabditis...

一种将高传递率附加体阵列快速整合到 C. elegans 基因组的实验方案

本方案描述了如何研究细胞命运转换过程中的细胞活动 体内秀丽隐杆线虫利用转基因动物，通过热激启动子驱动神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 的过表达，并结合RNAi介导的染色质调控因子 LIN-53 的耗竭，可观察到生殖细胞向神经元的重编程过程 体内.<br...

在 C. elegans 中应用 RNAi 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元

遗传学上易于操作的线虫Caenorhabditis...

使用EGFR和RAS抑制剂的鉴定 秀丽隐杆线虫

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。...

培养与遗传操作昆虫病原线虫

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

本文介绍了一种在固体培养基上培养单个分离线虫并对其进行终生生理参数监测和荧光定量的实验方案。该培养系统在单虫培养孔周围设置棕榈酸屏障，以防止线虫逃逸，从而允许使用具有厌恶性干预条件，包括致病菌和化学应激物。...

长期培养个体细胞 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行纵向荧光监测和厌恶干预

学习在无菌液体培养基CeHR中培养秀丽隐杆线虫并进行同步化处理的方法。该技术可消除细菌副产物干扰，用于研究线虫营养需求与发育生物学的精确实验。

培养秀丽隐杆线虫在无菌液体培养基中培养及通过微粒轰击法创建转基因蠕虫

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培养 秀丽隐杆线虫 在无菌液体培养基中培养及通过微粒轰击法创建转基因蠕虫

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