Name: 定量比较顺调节元件（CRE）的活动，在转基因果蝇 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习利用转基因果蝇定量比较顺式调控元件活性，通过位点特异性整合、共聚焦显微镜和ImageJ软件分析基因表达模式。该方法为发育生物学和遗传学研究提供可靠框架。

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感谢：Nicolas Gompel 和 Benjamin Prud'homme 对本实验方案开发所做出的贡献；Melissa Williams 及四位匿名评审人对稿件提出的宝贵意见；代顿大学研究生院为 WAR 提供的研究奖学金；代顿大学生物系及研究研究所（UDRI）为 TMW 提供的研究支持。本研究得到了美国心脏协会基金 11BGIA7280000 对 TMW 的资助。

概述：
本视频展示了一种能够定量测量Drosophila (D.) melanogaster中顺式调控元件（CRE）序列基因调控活性的实验方案。该方案可用于比较以下不同情况下的调控活性：野生型与突变型CRE形式、同一物种内自然存在的CRE等位基因，或不同物种间直系同源的CRE。
1. 将报告基因在Drosophila melanogaster基因组中的特定位点进行整合
A. 报告基因转基因构建
<ol>
 <li>第一步，必须将任何待评估的CRE单独克隆到报告载体中，该载体包含：(1) 用于位点特异性转基因整合的attB细菌附着位点序列8-11；(2) 位于(3)异源启动子上游的多克隆位点；以及紧随其后的(4)荧光蛋白编码序列（如EGFP或DsRed）。</li>
 <li>尽管可通过在载体骨架中引入attB序列使任意载体兼容phiC31介导的位点特异性整合，但载体pS3aG12-14可从addgene质粒库获取 <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">(http://www.addgene.org/pgvec1)</a>。pS3aG是P因子介导转化载体15的一种定制版本，其中两个gypsy绝缘子之一被SfIb绝缘子取代，该载体含有增强型多克隆位点，并携带一段包含attB附着位点的250个碱基对序列。感兴趣的CRE需插入多克隆位点中，位于hsp70最小启动子和EGFP基因的上游，后者编码一种定位于细胞核的增强型绿色荧光蛋白。</li>
</ol>
B. 报告基因的位点特异性整合
<ol>
 <li>对于一组需作为报告转基因载体的一部分进行活性比较的顺式调控元件（CREs），所构建的载体将被分别整合到相同的基因组着陆位点。此处，phiC31噬菌体整合酶蛋白催化细菌（attB)附着位点在转基因载体和基因组定位的噬菌体中attP) 附着位点9. 多个研究团队8-11 构建了多种包含一个的转基因品系 attP 位点（所谓着陆位点）并包含基因组来源8 表达该蛋白的phiC31果蝇品系。这些果蝇品系可从Bloomington easily获得 果蝇 保种中心 <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu/">（http://flystocks.bio.indiana.edu/）</a>. </li>
 <li>已有发表的实验方案详细描述了如何构建转基因生物 果蝇 使用 phiC31 整合酶进行位点特异性整合16. 用于制备转基因生物的设备与专业技术 果蝇 不再需要自行建立细胞系，因为已有多个供应商（表1）可提供此项外包服务。 </li>
 <li>转基因的行为在不同组织之间可能存在显著差异11因此，一个单一的 attP 着陆位点对于所有CRE、发育阶段和/或研究组织的分析并非都是最佳选择。建议在多个不同的着陆位点评估目标CRE的活性，以确定一个能够代表内源性靶基因表达模式的位点。</li>
 <li>对于获得的转基因品系，建议使其转基因位点达到纯合状态。通常，含有两个转基因拷贝的个体中CRE活性更强，而在进行定量测定时，必须确保在具有相同转基因拷贝数的个体之间进行比较。纯合个体可通过使用平衡染色体的方法获得。然而，对于特征明确的插入位点，更简便的方法是收集处女雄蝇和处女雌蝇，并将具有更强眼色表型的个体进行杂交 mini-white 基因（图1），作为 白色 由整合型转基因载体提供的突变体拯救效应在含有两个载体拷贝的个体中更为显著。</li>
</ol>
2. 获取适当发育阶段的标本或组织
在目标基因表达模式内源性出现的发育时期获取用于分析的样本，即所研究的CRE应激活报告基因表达的时间点。对于Drosophila而言，该时期可以是胚胎期、幼虫期、蛹期或成虫期。以下我们描述一种对成虫及变态期果蝇进行分期的方法；后者发生在蛹壳内，蛹壳是由坚硬的幼虫表皮形成的结构，包裹着不能活动的样本，直至其羽化为成虫。
<ol class="ualpha">
 <li>扩增转基因品系，以确保在准备通过共聚焦显微镜分析报告基因表达时，能够获得合适发育阶段的样本。每个试管中放入若干只（约5–10只）雄性和雌性果蝇，设置两个试管。每隔一天将其中一个试管中的果蝇转移至一个新的未使用的试管中。重复此操作一周。两周结束时，即可获得从幼虫到成虫各个发育阶段的转基因果蝇。</li>
 <li>成虫果蝇的分期：在25°C条件下培养时，雌性果蝇在蛹壳内的持续时间为98小时，雄性为102小时。当果蝇从蛹壳中羽化（称为羽化）时，可方便地收集成虫。此时间点可定义为羽化后0小时。果蝇可继续培养至分析所需的特定时间点。例如，在黑腹果蝇（D. melanogaster）雌性成虫的类脂细胞中调控desatF基因表达的顺式调控元件mel-oe1，在羽化后并不立即激活，而是在羽化后一天才启动活性14。当达到正确的发育阶段时，将果蝇麻醉，并置于载玻片上的卤代烷油滴中，随后进行共聚焦显微观察。</li>
 <li>变态过程中样本的分期：在三龄幼虫阶段结束时，果蝇形成蛹壳。尽管此时生物体在技术上仍属于三龄幼虫，但该发育阶段易于识别：样本不再移动，蛹壳柔软且呈白色，气门已外翻（图2A）。此时间点可定义为蛹壳形成后0小时（hAPF）。在此阶段，可通过位于身体中段两侧、呈半透明圆形结构的性腺来区分雄性和雌性（图2A中虚线框内所示，图2A"中黑箭头指示）。</li>
</ol>
1. 根据变态发育的长度进行分期：
在0小时成虫前（0 hAPF），可使用湿润的画笔将样本转移至新的试剂管或培养皿中。为防止样本干燥，可在容器内放入一片Kimwipe纸并用水润湿。随后将试剂管或培养皿置于25°C培养箱中，直至达到所需的时间点（hAPF）。
2. 根据可见的形态学特征进行分期：
在收集0 hAPF样本后，于特定时间点分析样本中CRE活性往往很不方便。另一种方法是，根据透过蛹壳或去除蛹壳后可见的若干形态学标记（如下所述）的存在及其位置，在便于分析的时间点鉴定正确发育阶段的样本（图2）。
2a. 用于估算变态阶段的形态学标准：
<ul>
 <li>0 hAPF：白色预蛹阶段，幼虫停止活动；前气门外翻（图2A中箭头所示）；侧支气管可见；蛹壳柔软呈白色（图2A）。</li>
 <li>˜14 hAPF：蛹壳已鞣化并硬化；头囊外翻；侧支气管和性腺轮廓变得不清晰；足和翅沿腹部完全伸展；马氏管尚未明显且未呈绿色（图2B中虚线框区域）；复眼无色素沉积（图2B'）。</li>
 <li>˜25 hAPF：两条平行的马氏管明显且呈绿色（图2C中虚线框区域）。</li>
 <li>˜40 hAPF：深绿黄色结构位于马氏管前端之间（图2D中红色箭头所示）。</li>
 <li>˜50 hAPF：黄色结构位于马氏管中点位置（图2E框内区域，放大见图2E''）；若white基因为野生型（该基因对红眼形成至关重要），则复眼呈琥珀色。当white突变表型由整合报告转基因载体中的mini-white基因挽救时，此阶段复眼无正常色素（图2E'）。</li>
 <li>˜70 hAPF：胸部背侧微刚毛和大刚毛可见（图2F中箭头所示）；黄色结构位于马氏管后部（图2F框内区域，放大见图2F''）；由mini-white基因挽救的复眼呈淡粉色（图2F'）。</li>
 <li>˜80 hAPF：翅尖呈灰色；马氏管位于腹部前段至中段之间（图2G框内区域，放大见图2G''）；腹节间褶皱及腹背板上的刚毛可见（图2G和2G''）；挽救后的复眼呈鲜红色（图2G'）。</li>
 <li>˜90 hAPF：翅变为黑色；马氏管及黄色结构因背板鞣化而难以观察；胸部（箭头）和腹部刚毛成熟并变深（图2H）；绿色的胎粪出现在腹部背侧后端尖部（图2H''）。</li>
</ul>
注意事项：
<ol class="lalpha">
 <li>在变态发育的晚期阶段，可通过生殖器形态（图2I和2J中的箭头所示）或雄性第一对足上是否存在深色性梳来确定标本的性别。</li>
 <li>通过参考此前描述的其他形态学标志物，可进一步提高分期的准确性17。</li>
</ol>
D. 从蛹壳中移除标本的步骤：
<ol>
 <li>使用实验室胶带将一段封箱胶带粘贴在解剖板上，胶面朝上。</li>
 <li>润湿画笔，并将水分涂抹于化蛹的标本上。用画笔将标本转移至无尘纸（Kimwipe）上。</li>
 <li>使用镊子或画笔将标本转移至封箱胶带上，使标本背面向上（即蛹壳的弯曲面朝上）并粘牢。</li>
 <li>让标本干燥约15分钟。干燥的蛹壳比湿润的更容易打开。此时可通过蛹壳上可见的形态学标志对标本进行初步的发育阶段判断。</li>
 <li>用镊子从蛹壳前端的开口（前气门盖）开始，逐步向后端展开蛹壳。若需更精细地解剖以分离特定组织，可在盛有PBS溶液的培养皿中进行。否则，将蛹转移至载玻片上的一滴高黏度HC700卤代烷油（Sigma-Aldrich）中。</li>
 <li>在体视显微镜下调整标本在载玻片上的位置，并依据上述标准（第2a节）确定标本的发育阶段。</li>
</ol>
3. 全组织样本中报告基因表达的共聚焦显微镜评估
<ol>
 <li>对于整体标本，使用 4X 或 10X 物镜。通过汞灯激发荧光，或 alternatively 在明场下观察，调节显微镜载物台以将标本置于光学视野中，然后调焦使标本清晰成像。</li>
 <li>使用共聚焦显微镜软件，调整 EGFP 的激发波长（若使用其他荧光蛋白，则选择相应合适的波长）。</li>
 <li>为防止标本发生光漂白，初始激光强度应设为 5–10%。若信号较弱，可依需逐步提高强度。</li>
 <li>为提高共聚焦图像的信噪比，启用软件设置以对多次扫描的像素测量值进行平均处理，例如卡尔曼平均（Kalman averaging）或线平均与层平均（line and stack averaging）。根据我们的经验，对三次扫描进行卡尔曼平均可在不过度延长图像采集时间的前提下有效提升信噪比。</li>
 <li>在对 CRE 活性进行定量比较时，必须确保标本的荧光强度未使大量像素达到饱和。选择荧光信号最强的 z 层切面，调节成像参数，使极少像素出现饱和。可通过切换至饱和警告查找表（saturation-warning lookup table），并调节通道的电压、增益和偏移，使饱和像素数量降至最低。最后，为充分采集标本信号，通常还需调节共聚焦针孔（confocal aperture）。</li>
 <li>确定最佳成像参数后，执行 z 扫描。</li>
 <li>扫描完成后，将图像序列转换为投影图像，并以标记图像文件格式（Tagged Image File Format）或“TIFF”格式保存该图像。</li>
</ol>
注意：
<ol type="lalpha">
 <li>在对 CRE 活性进行定量比较时，所有重复样本及报告基因转基因品系必须使用相同的共聚焦成像设置。</li>
</ol>
4. 定量分析顺式调控元件活性
尽管一些共聚焦图像采集软件允许对投影图像进行进一步处理，但我们更倾向于使用免费的 Image J 软件来分析共聚焦图像18。利用 Image J 18，可以在指定区域内将记录的 GFP 表达模式量化为像素值统计结果。虽然图像无需转换为灰度模式，但我们更倾向于这样做。
<ol>
 <li>启动 Image J 程序后，打开一个待评估的 TIFF 图像。</li>
 <li>点击自由选择工具按钮，圈选出需要进行定量分析的样本区域；例如图 3 中虚线黄色边框内的区域。（有关定量区域选择的说明，请参见下方注释 a。）</li>
 <li>为获取像素值统计结果，点击“分析”选项卡，然后选择“测量”。将弹出一个结果窗口，显示该区域的面积以及平均值、最小值和最大值像素值。记录平均像素值，并重复此步骤以获得重复样本的像素值统计数据（关于重复样本数量的说明，请参见注释 b）。</li>
 <li>我们建议从一个 CRE 不活跃的对照区域再采集一个平均像素值；例如图 3 中虚线红色边框内的区域。后者数值可从前者中减去，以消除背景效应，从而获得校正后的平均像素值。根据我们的经验，这能进一步减少重复样本之间的变异（关于对照区域大小选择的说明，请参见注释 c）。</li>
 <li>利用重复样本的校正后平均像素值，计算该 CRE 的平均调控活性及其均值标准误。该调控活性值及误差度量可用于与其他报告基因转基因进行比较，其中 CRE 的序列有所不同（例如图 3）。</li>
</ol>
注意事项：
<ol type="lalpha">
 <li>Image J 允许用户选择一个定义的形状和区域，以确定其平均像素值得分。然而，由于样本大小通常存在差异，我们更倾向于使用自由手绘选择工具为每个样本指定待评估的区域。</li>
 <li>对于给定的顺式调控元件（CRE），较高的重复次数（N）可更准确地估计其平均调控活性。我们发现，N 值在 4 到 8 之间通常已足够。</li>
 <li>根据我们的经验，所选对照区域的大小对对照区域测得的平均像素值影响较小。一般情况下，我们会选择与目标区域大小成比例的对照区域。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
野生型版本的 D. melanogaster CRE，称为双态元件13，在雌性蛹的A6腹节中驱动高水平的EGFP报告基因表达（图3A）。该元件内一段13个碱基对的序列被发现是DSX转录因子的结合位点，且 体内 该序列的重要性可通过定量分析此CRE在结合位点发生突变时的调控活性来验证。以野生型双态元件的调控活性为100±5%，该DSX位点突变后，调控活性下降至28±3%。类似的方法也可用于比较种内CRE等位基因或不同物种间同源CRE的调控活性。例如，以雌性A6节段中由该元件驱动的EGFP表达水平为参照 D. melanogaster Canton S 品系的调控活性为 100±4%，该物种的同源 CRE D. simulans 和 D. willistoni 分别具有75±4%和0±0%的调节活性（图3B）。
<img alt="果蝇遗传变异比较示意图，Drosophila 表型研究，A、B、C 样本。" src="/files/ftp_upload/3395/3395fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 利用white基因挽救眼表型的强度使转基因品系纯合。为了对报告转基因进行定量评估，确保每个个体具有相同的报告转基因基因型至关重要。（A）使用具有attP着陆位点序列的white基因突变遗传背景，以实现转基因的位点特异性整合。整合载体后，通常可根据整合的mini white基因拷贝数，通过挽救后眼色表型的强度来区分（B）半合子和（C）纯合的转基因个体。可通过将具有最深眼色表型的（C）雄性和雌性果蝇杂交，建立纯合品系。
<img alt="黑腹果蝇发育阶段图谱，展示约0-90小时成蛹后（hAPF）的形态变化" src="/files/ftp_upload/3395/3395fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 利用形态学标记确定变态阶段 果蝇在果蝇从幼虫到成虫的变态过程中，样本会经历一系列典型形态变化，这些形态可用于确定性别并大致判断发育阶段。图B-H中的样本已从其蛹壳中取出。图A、E、F、G和H中的方框分别对应于图A"、E"、F"、G"和H"的放大区域。
<img alt="果蝇野生型和DSX位点突变株中A4-A6分段的CRE分析示意图。" src="/files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. cis调控元件活性的定量比较。对所有样本，在蛹壳形成后80小时检测雌性个体中由特定两性差异元件（Dimorphic Element）介导的EGFP报告基因表达。每张图像顶部的数值表示该样本的EGFP表达水平，计算方法为A6腹节段（左上角图像中虚线黄框所示区域）的平均像素值减去A4节段（背景校正区域，左上角图像中虚线红框所示区域）的平均像素值。针对每个报告转基因，检测了四个重复样本，以计算A6节段的平均像素值。调控活性以（A）野生型或（B）Canton S品系雌性平均像素值的百分比±标准误（SEM）表示。（A）携带野生型两性差异元件等位基因以及DSX转录因子单个结合位点被敲除的突变版本的雌性个体的GFP表达。该突变结合位点使两性差异元件的活性降低至野生型序列的28±3%。（B）与D. melanogaster（Canton S品系）两性差异元件正交的序列调控活性比较。以D. melanogaster两性差异元件等位基因介导的GFP表达为100%，来自近缘物种D. simulans和D. willistoni的正交序列分别具有75±4%和0±0%的活性。

6. 材料

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>材料名称</td>
 <td>类型</td>
 <td>公司</td>
 <td>目录编号</td>
 <td>备注</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 位点特异性转基因整合</td>
 <td> 服务</td>
 <td> Best Gene</td>
 <td> Plan H</td>
 <td>选择一个插入位点，获得转化子品系</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>卤代烃油</td>
 <td>试剂</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H8898</td>
 <td>用于固定样品以进行共聚焦成像</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 镊子</td>
 <td>工具</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11252-40</td>
 <td>尖端精细且耐用，适用于解剖操作</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SZ61 变焦体视显微镜</td>
 <td>工具</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>可定制</td>
 <td>光学性能优异，适用于果蝇操作</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FluoView 共聚焦显微镜</td>
 <td>工具</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>可定制</td>
 <td>可提供高分辨率的共聚焦图像</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Davidson, E. H. The Regulatory Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Gene+Regulatory+Networks+in+Development+and+Evolution%22">Gene Regulatory Networks in Development and Evolution</a>. , Academic Press. (2006).</li>
<li>Wray, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+significance+of+cis-regulatory+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary significance of cis-regulatory mutations.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).</li>
<li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+developmental+biology+and+the+problem+of+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary developmental biology and the problem of variation.</a> Evolution. 54, 1079-1091 (2000).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134, 25-36 (2008).</li>
<li>Sethupathy, P., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+target+site+polymorphisms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA target site polymorphisms and human disease.</a> Trends Genet. 24, 489-497 (2008).</li>
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<li>Williams, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+evolution+of+a+genetic+switch+controlling+sexually+dimorphic+traits+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila.</a> Cell. 134, 610-623 (2008).</li>
<li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li>
<li>Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+and+beta-galactosidase+transformation+vectors+for+promoter%2Fenhancer+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila.</a> BioTechniques. 29, 726-732 (2000).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook%22">Drosophila: A laboratory handbook</a>. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+noncoding+variant+to+phenotype+via+SORT1+at+the+1p13+cholesterol+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.</a> Nature. 466, 714-721 (2010).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

cis调控元件编码基因组程序，决定基因表达模式，从而控制发育过程1，同时也是形态进化相关突变2-4以及人类性状表型变异5,6,19的重要位点。尽管其重要性已广为人知，但人们对调控元件（CREs）的调控机制仍知之甚少。造成这一认知不足的一个主要原因是缺乏可用于定量比较CRE功能序列的合适方法。本文介绍了一种利用黑腹果蝇（D. melanogaster）转基因技术改进方法的实验方案，从而为CRE研究引入定量分析维度。
根据我们的经验，在定量分析顺式调控元件（CRE）的调控活性时，若重复样本满足以下两个条件：（1）处于相同的发育阶段，且（2）报告转基因位于相同的基因组整合位点，则重复样本间的变异幅度不超过校正后平均像素值的10%。该变异水平与图3中所示CRE所确定的结果一致，这也意味着该定量方法仅适用于那些在调控活性上差异超过10%的不同遗传版本CRE的比较。然而需要强调的是，相较于以往研究者在描述CRE活性变化时只能使用“降低”或“增强”等定性描述，这一局限性已代表了显著的进步。</p...

transgenic drosophila melanogaster 中 cis-调控元件（cre）活性的定量比较

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

基因表达模式由 顺式-调控元件（CRE）序列，也称为增强子或顺式调控模块。典型的CRE包含多个转录因子蛋白的结合位点，这些结合位点构成一种调控逻辑，决定受调控基因在何时、何地以及以何种水平表达。动物基因组中全部CRE的集合编码了该生物体的发育与功能调控程序&prime;发展计划程序1，且实证研究与理论研究表明，顺式调控元件中的突变在形态进化中发挥了重要作用2-4此外，人类基因组全关联研究显示，顺式调控元件（CREs）中的遗传变异对表型变异具有显著贡献。5,6因此，理解调控机制以及突变如何影响这种调控机制是遗传学的核心目标之一。 
报告基因转染提供了一种强大的方法来研究 体内 CRE功能的研究。在此方法中，将已知或疑似CRE序列与异源启动子及报告基因的编码序列连接，该报告基因编码一种易于观察的蛋白质产物。当报告转基因插入宿主生物体后，CRE&prime;其活性以编码的报告蛋白形式显现。果蝇物种中的P元件介导转基因技术 黑腹果蝇（Drosophila (D.) melanogaster）7 几十年来，人们一直利用该方法将报告基因转入这种模式生物，但转基因在基因组中的插入位置是随机的。因此，报告基因的活性受到局部染色质状态和基因环境的强烈影响，限制了顺式调控元件（CRE）之间的比较，只能进行定性分析。近年来，基于phiC31的整合系统已被改造并应用于D. 黑腹果蝇 将转基因插入特定的基因组着陆位点8-10这一能力使得对基因以及此处相关的CRE活性进行定量测量成为可能11-13 可行。转基因果蝇的制备可外包完成，包括基于phiC31的整合，从而无需购买昂贵的设备和/或掌握专业的转基因显微注射技术。 
在此，我们提供一种定量评估CRE的通用方案&prime;活性，并展示如何利用该方法来检测引入的突变对CRE的影响&prime;s 活性，并比较直系同源顺式调控元件（CREs）的活性。尽管文中示例涉及果蝇变态发育期间具有活性的 CRE，但该方法可应用于其他发育阶段、果蝇物种或模式生物。最终，广泛采用此方法研究 CRE 将有助于深入理解基因调控逻辑及其变异与进化机制。

性状的表型变异可能源于顺式调控元件（CRE）序列的突变，这些突变会影响基因表达模式。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中建立的方法可用于定量比较由修饰型或天然存在的CRE变异所介导的基因表达在空间和时间上的表达水平模式。

transgenic Drosophila melanogaster 中 cis-调控元件（CRE）活性的定量比较

基因表达模式由顺式调控元件（cis-regulatory element, CRE）序列决定，这些序列也被称为增强子或顺式调控模块。一个典型的CRE……

本实验的总体目标是定量测量在黑腹果蝇变态发育过程中起作用的顺式调控元件（CIS regulatory elements）或调控元件（CRE）的基因调控活性。首先采用位点特异性整合方法，建立将CRE作为报告转基因整合的转基因品系。使用体视显微镜获取处于正确发育阶段的转基因样本。从外侧酒馆中取出标本，将其置于玻璃显微镜载玻片上，通过共聚焦显微镜分析，对整体封片样品中荧光报告蛋白的表达水平和模式进行记录。最后，使用 Image J 软件工具对所记录的共聚焦图像中荧光报告蛋白的表达水平进行定量分析。这些结果为辅助调控元件赋予了一定水平的基因调控活性，有助于进一步开展针对修饰后顺式调控元件（CRE）版本的比较性基因表达研究。该方法可帮助回答基因调控领域的关键科学问题，并加深对基因调控机制编码方式的理解。DNA 相关研究与发育生物学和进化生物学密切相关。该实验方案旨在研究在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）变态发育过程中发挥作用的顺式调控元件。然而从原理上讲，该方法也可应用于其他发育阶段或其他果蝇物种，甚至其他模式生物中发挥功能的顺式调控元件。为扩增转基因品系，需每隔一天设置两个培养瓶，每个瓶中放入若干雄性和雌性果蝇。将果蝇从其中一个试剂瓶转移到新试剂瓶中，每周重复此操作。两周结束时，确认转基因果蝇涵盖从幼虫到成虫的各个发育阶段。在三龄幼虫阶段末期，当肠壁（ER）形成时，开始对样本进行分期。注意此时样本已无活动能力。肠壁呈柔软的白色，球形结构已发生偏转，以此确定该时间点。在0小时成体后（zero HAPF），通过观察位于身体中段两侧的透明圆形性腺来区分雄性和雌性，以此作为基于变态长度的分期依据。在0小时成体后，使用湿润的画笔将样本转移至新的小瓶中。加入一片擦拭纸，并用水润湿以防止样品干燥。随后将小瓶在 25 °C 下孵育至所需的 HAPF。或者，可根据随附文本中详述的若干形态学标志物的存在与否及其位置，对样品进行分期分类。用实验室胶带将一片封箱胶带粘贴到解剖板上，胶带的粘性面朝上。润湿一把画笔，并用该画笔为标本添加水分。将标本转移至无尘纸巾上。将样本转移至封口袋胶带上，腹面朝上粘贴。让样本干燥15分钟。使用镊子逐步打开ER。从头部或前端开始，向后端移动。然后将幼虫转移到载玻片上的一滴粘性油中，通过显微镜对整体封片标本进行观察。可使用 Forex 物镜或 10 倍物镜将标本调至清晰对焦。使用共聚焦显微镜软件，调整目标荧光蛋白的激发波长，以防止光漂白。激光强度初始设置为5%至10%。如果信号较弱，则根据需要逐步增加强度，以提高信噪比。对于共聚焦图像，启用软件设置以对重复扫描的像素测量值进行平均处理（例如卡尔曼平均），用于CRE活性的定量比较，并在荧光信号最强的横截面（C-section）进行分析。切换至饱和度警告查找表，并调整通道电压增益和偏移，使极少像素达到饱和。如有必要，调整共聚焦针孔。确定最佳设置后，运行ZS扫描以获取沿Z轴的一系列图像。扫描完成后，将图像堆栈转换为投影图像，并将该图像文件以 TIF 格式保存。为定量比较 CRE 活性，所有重复样本及报告基因转基因品系均需使用相同的共聚焦设置。使用 Image J 程序进行实验时，首先打开一个待评估的 TIFF 图像。单击自由选择工具按钮，勾勒出需要进行定量分析的样本区域。要获取像素值统计结果，请单击“分析”选项卡，然后选择“测量”。从结果框中记录平均像素值。同时从CRE不活跃的背景区域采集第二个平均像素值。为获得校正后的平均像素值，继续对重复样本生成像素值统计结果。然后基于这些重复样本的校正平均像素值，确定A CRE的平均调控活性，并计算平均值的标准误差。本实验利用白色拯救眼表型的强度来获得纯合的转基因品系。实验采用具有A TTP着陆位点序列的白色基因突变遗传背景，以实现位点特异性转基因整合。通过整合的mini white基因拷贝数，可根据眼色拯救表型的强度区分杂合子与纯合子转基因个体。通过交配具有最深眼色表型的雄性和雌性果蝇，建立纯合品系。在果蝇从幼虫蜕变为成体果蝇的过程中，利用形态学标记来确定其变态阶段。该样本会经历一系列典型形态变化，可用于鉴定性别并大致判断其发育阶段。此处。一个被称为双态元件的野生型A CRE可在雌性puy的ASIC腹部节段驱动EGFP报告基因的高水平表达。研究发现，该CRE内一段13个碱基对的序列是DSX转录因子的结合位点，通过量化该结合位点突变后CRE的调控活性，可证明该序列在体内的功能重要性。定量分析表明，在本研究所用的转基因插入位点背景下，该DSX结合位点的突变使调控活性降低至野生型表达水平的28±3%。类似的比较可用于评估种内CRE等位基因之间的调控活性，或来自不同物种的同源CRE之间的调控活性，例如与雌性节段中EGFP的表达水平进行比较。由D. melanogaster胃部Cain S品系的同源CRE驱动时，D. stimulants和D. willistoni物种的六号片段其调控活性分别为75±4%和0±0%。后续可结合RNA干扰等方法作用于转录因子基因，以进一步探究这些转录因子基因如何与CYS调控元件相互作用。这将通过由 CIS 调控元件在发育后驱动的荧光报告蛋白表达的上升与下降而得以体现。该方法为基因调控领域的研究人员探索顺式调控元件基序及其进化突变对基因表达的功能重要性奠定了基础。

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科研

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Biology

生物学

定量比较顺调节元件（CRE）的活动，在转基因果蝇</em

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