定量比较顺调节元件（CRE）的活动，在转基因果蝇

该程序的总体目标是定量测量果蝇黑胃发育过程中 CIS 调节元件或 CRE 活性的基因调控活性。从位点特异性整合方法开始，生成转基因掺入作为报告基因转基因的 CRE 品系。使用立体显微镜，获得正确发育阶段的转基因标本。

从外部酒吧中取出标本并将它们安装在玻璃显微镜上。幻灯片继续通过共聚焦显微镜分析记录整个安装样品中荧光报告蛋白表达的水平和模式。最后，使用 Image J 软件工具量化记录的共聚焦图像的荧光报告蛋白表达水平。

这些结果分配了一定程度的基因调控活性以协助调控元件并促进对修饰的 CRE 版本的进一步比较基因表达研究。该程序可以帮助回答关键问题，并对基因调控以及基因调控如何编码感兴趣。DNA 感觉就像发育和进化生物学。

该程序的开发是为了深入了解在黑腹果蝇发育过程中起作用的顺式调节元件。然而，原则上，它可以应用于在其他发育阶段发挥作用的顺式调节元件和其他果蝇物种，甚至其他模式生物。为了扩大转基因品系，在交替的日子里设置两个小瓶，里面有几只雄性和雌性果蝇。

将果蝇从其中一个样品瓶转移到新的样品瓶中。重复此作一周。在两周结束时，验证转基因果蝇的范围从幼虫到成虫发育阶段。

当 ER 形成时，在第三龄幼虫阶段结束时开始暂存标本。请注意，标本是非移动的。ER 是柔化的白色，球形已避免指定此时间点。

作为零 HAPF。通过在身体中点附近存在位于双侧的性腺来区分雄性和雌性，这些性腺显示为半透明的圆圈，用于根据的长度进行分期。在 HAPF 为零时，使用湿润的画笔将标本转移到新的小瓶中。

加入一块 Kim 湿巾并用水润湿，以防止标本变干。现在，将样品瓶在 25 摄氏度下孵育，直到达到所需的 HAPF。或者，根据对几种形态标记的存在和位置的识别进行排序来暂存标本，如随附文本中所述。

用实验室胶带将一条包装胶带粘在解剖板上，胶带表面朝上。弄湿油漆刷，并使用油漆刷将水分涂抹在标本上。将标本转移到 Kim 擦拭中。

将标本转移到包装胶带上，并沿背面朝上粘附。让标本干燥 15 分钟。使用镊子逐渐打开 ER。

从前部或烫发开始，然后向后端进行。然后将 pui 转移到显微镜载玻片上的一滴粘性油中，并在显微镜下评估整个安装标本。使用 Forex 或 10 x 物镜聚焦标本。

使用共聚焦显微镜软件，调整所需荧光蛋白的激发波长以防止光漂白。从 5% 到 10% 的激光强度开始如果信号不佳，则根据需要增加强度以提高信噪比。对于共聚焦图像，启用软件设置，从重复扫描中平均像素测量值，例如用于定量比较 CRE 活性的卡尔曼平均法，使用荧光最强烈的剖腹产。

切换到饱和警告查找表，并将通道电压增益和偏移调整为少数像素饱和的设置。如有必要，调整共聚焦孔径。确定最佳设置后，运行 ZS 扫描以获取沿 Z 轴的一系列图像。

扫描完成后，将图像堆栈转换为投影，并将此图像文件保存为 TIF 格式。对于 CRE 活性的定量比较，对所有复制标本和报告基因转基因系使用相同的共聚焦设置。对于使用 Image J 程序启动的实验，打开要评估的 TIFF 图像。

单击徒手选择按钮，勾勒出需要定量的标本区域。要获取像素值统计数据，请单击 analyze（分析）选项卡，然后选择 measure（度量）。记录结果框中的平均像素值分数。

此外，从 CRE 未激活的背景区域收集第二个平均像素值。要得出调整后的平均像素值，请继续为重复标本生成像素值统计数据。然后，根据副本调整的平均像素值，确定 A CRE 的平均调节活性，并计算平均值的标准误差。

该实验利用白色拯救眼表型的强度使转基因系纯合。具有 A TTP 着陆位点序列的白色基因突变遗传背景用于位点特异性转基因整合。整合载体的转基因个体、半合子和纯合子通过整合的迷你白色基因的拷贝数来区分拯救的眼睛颜色表型的强度。

然后通过将眼睛颜色表型最深的雄性和雌性果蝇杂交来建立纯合系。形态学标记用于确定果蝇在从幼虫为成果蝇过程中的阶段。标本通过一系列刻板形态过渡，可用于确定性别和近似发育阶段。这里。

称为二态元件的野生型 CRE 在雌性 puy 的 ASIC 腹部段驱动高水平的 EGFP 报告基因表达。发现该 CRE 中的 13 个碱基对序列是 DSX 转录因子的结合位点，并且当该结合位点发生突变时，通过量化 CRE 的调节活性来证明该序列的体内重要性。定量分析表明，该 DSX 位点的突变将调节活性降低到野生型表达的 28 加或减 3%，以在此处使用的转基因插入位点的背景下。

类似的比较评估了特异性 CRE 等位基因或来自不同物种的自体 CRE 之间的调节活性，例如，与女性段的 EGFP 水平进行比较。由 D Melin 胃 Canin S 菌株驱动的 6 物种 D 兴奋剂和 D willi 的自体 CRE 分别具有等于 75 加或减 4% 和零加或减 0% 的调节活性。以下程序方法（如 RNA 干扰）可用于转录因子基因，以回答有关这些转录因子基因如何与 CYS 调节元件相互作用的其他问题。

这可以通过其发育后由 CIS 调节元件驱动的荧光报告蛋白表达的增加和减少来说明。该程序为基因调控领域的研究人员探索顺式调控元件基序和进化突变对基因表达的功能重要性铺平了道路。