生理录音和黄热病蚊子的味觉附属物RNA测序埃及伊蚊

使用两种方法来估计基因表达的埃及伊蚊的主要味觉附属物，我们已经确定了一套基因假定存在的潜在的神经元的反应，以苦和排斥的化合物，通过电生理检查确定。

该程序的总体目标是观察昆虫味觉神经元的反应并测量味觉组织中的基因表达。这是通过首先记录特定味觉毛发对不同浓度的几种味道的反应来实现的。第二步是仔细解剖味觉组织。

然后按性别和附件将样品分开。接下来，从每个组织样品中分离总 RNA，并制备用于下一代测序和 QPCR 的 CD NA 制备物。最后一步是分析基因表达数据并形成假设，例如表达的化疗感觉基因如何介导昆虫对味觉的生理反应。

最终，电生理记录用于显示昆虫味觉系统的感受范围，味觉组织的 RNA 测序用于突出味觉接收的最重要遗传成分。一般来说，由于昆虫化疗的体积小，刚接触这些方法的人会很挣扎。感觉附属物。

无论是解剖还是记录小昆虫器官，在患者身上进行实践都是掌握这些技术的关键。要开始此过程，请在解剖显微镜下用玻璃毛细管在移液器拉拔器中拉出一个薄尖端记录电极。小心地折断电极尖端，使其开口足够宽以包裹目标 centum，但又足够小以避免接触邻近结构。

接下来，在零下 20 摄氏度的冰箱中麻醉两到四只成年昆虫 20 秒。之后，使用带有小玻璃纸胶带的盖玻片固定其中一只昆虫。在显微镜下。

通过目标传感器的形态和位置识别目标传感器，并定位动物以允许从电极进入的角度自由接近它。然后将钨丝插入其背胸部。要用作接地电极，请从尖端填充玻璃电极，加入感兴趣的刺激溶液。

尖端的同时轻弹气泡。将银线插入电极，作为记录和刺激电极。之后，将电极连接到前置放大器，这样可以减少捕获神经元活动的稳定时间。

前置放大器连接到配备有尖峰记录软件的计算机，以收集、存储和分析电信号。现在用控制溶液刺激 centum 以确保其功能。计算刺激伪影后 200 毫秒开始的峰值。

获得剂量反应结果。将 Centum 暴露在浓度递增的实验化学品中，并在刺激之间至少间隔三分钟，以确保充分恢复。在此过程中，准备一个装有干冰的浅冷却器。

对于组织收集管，标记 1.5 mL 无 RNA 卡口盖管，用于收集不同类型的组织。保持管子关闭以避免过多的冷凝。接下来，在零下 30 摄氏度的冰箱中麻醉 40 到 20 只蚊子 15 到 30 秒。

然后将麻醉的蚊子转移到寒冷阶段并按性别分类。抓住昆虫的翅膀，将昆虫的背面朝下，小心不要损坏味觉附属物。在解剖显微镜下，通过轻轻抓住标签近端的蚊子 pro Bois，从雄性或雌性中解剖成对的标签 Bella 或 tarsi。

Bella 用一对镊子露出内部触针，并用另一对镊子去除标签。然后将组织放入跗骨组织的冷收集管中。轻轻抓住胫骨和第一跗节交界处的蚊腿，去除跗节。

然后将组织放入冷标记的试管中。将收集管在零摄氏度离心机中以 9， 000 倍重力离心一分钟，以将组织保持在管底部。如果在解剖过程中水分积聚在收集管中，请添加 50 μL 冷三醇试剂以覆盖和保护收集的组织。

将试管冷冻在含有液氮的 1.5 ml 试管架中。之后，在组织破碎之前，通过在干冰上冷却来制备紧密贴合的无 RNA 杵。然后将组织研磨成细粉，再重复一次。

将三醇的总体积调到 1 毫升并复苏。通过涡旋悬浮研磨的组织。之后，将 200 微升氯仿加入研磨组织中并充分混合。

在室温下 5 分钟后，在 4 摄氏度的离心机中以 11， 000 倍重力离心 15 分钟。小心地将水层直接添加到基因组 DNA 过滤柱中。然后以 11， 000 倍重力将其旋转 5 分钟。

向流出液中加入等体积的不含 RNA 的 70% 乙醇，并通过移液混合。将液体转移到 RNA 收集柱中，然后继续提取 RNA。之后，在精密分光光度计上定量和评估总 RNA 的纯度，并继续进行任何标准 RNA 测序方法。

助手的 E GTI 味觉 illa 的动作电位的痕量记录证明了使用一系列化学物质直接刺激的有效性。该技术可用于通过在小于 500 毫秒的合理时间范围内计算给定振幅和持续时间的尖峰来量化对任何刺激性化学物质的反应。这三个尖峰对应于具有不同敏感性的三种感觉神经元亚型。

RNA-Seq 数据集的生物学重复可能会受到组织采集成本或难度的限制。Q-R-T-P-C-R 能够以更低的成本和更少的来源验证总基因表达的小子集。左图中并排显示的 RNA 是 RN Aeq 测定的相对表达与 Q-R-T-P-C-R 测定的相对表达之间的比较。

这两种方法依赖于不同的化学成分进行基因丰度估计。右侧面板中以图形方式显示的统计等价函数演示了每种情况下的确定性极限。看完这个视频后，你应该对如何解剖昆虫组织进行RNA分离和记录活昆虫味毛的神经信号有一个很好的了解。