生理记录与黄热病蚊子Aedes aegypti味觉附器的RNA测序

本实验的总体目标是观察昆虫味觉神经元的反应，并测量味觉组织中的基因表达。首先，通过记录特定味觉毛对不同浓度多种味道的反应来实现这一目标；第二步是仔细解剖味觉组织。

然后按性别和附肢对样品进行分离。接着，从每种组织样品中提取总RNA，并为下一代测序和qPCR制备cDNA。最后一步是分析基因表达数据并提出假设，例如昆虫中表达的化学感受基因如何介导对味道的生理反应。

最终，通过电生理记录来展示昆虫味觉系统的感受范围，同时通过味觉组织的RNA测序来揭示味觉感知过程中最重要的遗传组分。通常，刚接触这些方法的研究人员会因昆虫化学感觉附器体积微小而面临操作困难。

无论是解剖还是记录小型昆虫器官，对患者进行练习都是掌握这些技术的关键。开始此操作时，在解剖显微镜下使用玻璃毛细管，用移液器拉制仪拉制出细尖的记录电极。小心地折断电极尖端，使其开口足够宽以包绕目标神经节，但又足够小以避免接触邻近结构。

接下来，将2至4只成虫置于-20摄氏度的冰箱中麻醉20秒。随后，在显微镜下，用载玻片和小条状透明胶带固定其中一只昆虫。

根据形态和位置确定目标感觉器，并调整动物体位，以便从电极进入的角度自由接触该感觉器。然后将钨丝插入其背部胸部。作为接地电极，从尖端向玻璃电极内充满感兴趣的刺激溶液。

轻弹电极尖端以排出气泡，同时保持尖端朝下。将一根银丝插入电极中，作为记录和刺激电极。随后，将电极连接至前置放大器，以缩短稳定时间，从而有效捕捉神经元活动。

前置放大器连接到装有锋电位记录软件的计算机，用于采集、存储和分析电信号。现在用对照溶液刺激神经节，以确保其功能正常。从刺激伪迹后200毫秒开始计数锋电位。

为了获得剂量反应结果，将受试化学物质的浓度逐步增加并作用于样本，并在每次刺激之间留出至少三分钟的间隔，以确保充分恢复。在此步骤中，准备一个装有干冰的浅冷却容器。

对于组织采集管，应标记1.5毫升无RNA酶的螺口离心管，用于收集不同类型的组织。保持管盖关闭，以避免产生过多冷凝。随后，将30至40只蚊子置于-20°C冰箱中冷冻15至30秒以进行麻醉。

然后将麻醉后的蚊虫转移至低温载物台，并按性别进行分选。通过捏住蚊虫的翅膀将其翻转至背面向下，注意避免损伤味觉附器。在解剖显微镜下，轻轻夹住蚊虫口器靠近喙部的位置，从雄蚊或雌蚊中分离出成对的唇瓣或跗节。

用一把镊子固定住刚毛，暴露内侧的刚毛，再用另一把镊子取下标签。随后将组织放入用于跗节组织的低温收集管中。轻轻夹住蚊子腿部胫节与第一跗节的连接处，取下跗节。

然后将组织放入预冷的标记管中。在0°C离心机中以9,000 × g离心收集管1分钟，使组织保持在管底。若在解剖过程中收集管内出现冷凝液，可加入50 µL冷的TRIol试剂覆盖并保护所收集的组织。

将试管放入装有液氮的1.5毫升试管架中冷冻。随后，在组织破碎前将紧密适配的无RNA酶研磨杵置于干冰上预冷。然后将组织研磨成细粉，并重复一次。

将三醇总体积补至1毫升并重新悬浮。通过涡旋振荡使研磨组织重悬。随后，向研磨组织中加入200 µL氯仿，并充分混匀。

室温静置5分钟后，在4°C下以11,000 × g离心15分钟。小心地将水相直接转移至基因组DNA过滤柱中，然后在11,000 × g下离心5分钟。

向流穿液中加入等体积无RNA的70%乙醇，用移液器吹打混匀。将液体转移至RNA收集柱中，继续进行RNA提取。随后，使用精密分光光度计对总RNA进行定量并评估其纯度，并采用任何标准RNA测序方法进行后续分析。

从aide的EGTI味觉感受器记录到的动作电位轨迹表明，直接使用一系列化学物质进行刺激具有良好的效果。该技术可通过在500毫秒以内的合理时间范围内，统计特定幅度和持续时间的动作电位峰数量，来量化对任何刺激性化学物质的反应。这三个峰分别对应三种具有不同敏感性的感觉神经元亚型。

RNA-Seq 数据集的生物学重复可能受限于成本或组织采集的难度。定量反转录聚合酶链式反应（Q-R-T-P-C-R）能够在较低成本下验证部分基因表达，且所需样本量更少。左侧面板中并列显示的 RNA 结果，比较了由 RN Aeq 测定的相对表达水平与由 Q-R-T-P-C-R 测定的相对表达水平。

这两种方法依赖于不同的化学原理来估计基因丰度。右侧图示中以图形方式展示的统计等价函数表明了在每种情况下的确定性限度。在观看本视频后，您应能充分理解如何解剖昆虫组织以进行RNA提取，以及如何记录活体昆虫味觉毛中的神经信号。