优化人源间充质干细胞在聚(ε-己内酯)电纺纱线上的贴附

在此实验中，通过不同方式设置静电纺丝PCL支架，以确定最佳的细胞接种方案。首先，将无菌支架置于不同的待测装置中，包括细胞培养小室、槽式装置和生物反应器旋转容器。支架放置到位后，将已知数量的细胞接种到支架上，随后静置20分钟，期间不进行扰动。

然后将所有样品小心转移至培养箱中，在5%二氧化碳、37°C条件下，进行静态或动态培养数小时。培养结束后，通过DNA检测定量支架、孔板及周围培养基中的细胞数量，以确定附着在支架上的细胞数目。最终，通过定量支架、孔板以及周围培养基中的DNA含量，评估细胞在支架上的黏附情况，并采用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。

我们最初产生这项研究的想法，是因为发现我们的支架未能覆盖整个孔板的底部，这意味着可能并非所有细胞都会与支架接触，从而无法附着。首先，在层流条件下设置细胞培养插件：打开无菌的六孔细胞培养插件，将带齿的短环与宽环形主体分离。然后取齿朝上的环，在其中心位置覆盖一块4厘米的支架，确保支架在两侧均有重叠。

取带环的主体，将其置于齿状环和支架上方，然后向下按压，确保支架位置固定，并位于细胞培养插件的中心。将带有支架的细胞培养插件放入六孔低吸附培养板的孔中，并向支架加入10毫升培养基。

接下来，将聚四氟乙烯槽放入各自的培养皿中，并向槽内加入 10 毫升培养基。用镊子将一个 3 厘米的支架放入槽内，确保其长度方向与槽的长边平行。在层流条件下设置生物反应器装置时，通过生物反应器的主要端口加入 10 毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。

10 分钟后，用镊子移除 PBS，并加入 8 毫升培养基。通过主端口将一个 3 厘米的支架放入容器中。然后关闭主端口。

按照文本方案完成人源间充质干细胞计数后，从离心管中吸除培养基，保留细胞沉淀，并替换为计算好的培养基体积。重悬细胞与培养基以获得均匀混合液。使用P 200 Gilson移液器，沿支架长度方向并在液面以下缓慢将200微升细胞悬液逐滴加入每个支架中。

静置20分钟，或通过主端口向生物反应器容器中加入200 µL细胞悬液。通过注射端口补加剩余的2 mL培养基，使总体积达到10 mL。接着，将生物反应器容器转移至旋转式反应器装置中，并设置为旋转状态。

以9 RPM的转速将带有细胞培养小室和槽的培养板转移至摇板上，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中设置为30 RPM旋转，或进行静态培养。将带有细胞培养小室和槽的培养板转移至细胞培养箱的架子上，设置条件为37摄氏度和5%二氧化碳。

四小时后，将样品从培养箱中取出，并置于层流罩下。接着，将所有样品的培养基组分移除，并分别放入已标记的离心管中。在241 × g条件下离心五分钟之后，弃去上清液，然后加入三毫升裂解缓冲液，涡旋振荡溶液以破碎细胞沉淀以及细胞培养插件中所含的支架。首先，使用刀片在靠近插件边缘处切割支架，从而将支架释放出来。

然后使用镊子取出支架，放入含有三毫升裂解缓冲液的离心管中。接着向每个支架容器中加入三毫升裂解缓冲液，并刮擦表面。收集裂解缓冲液，转移至单独标记的离心管中。

将每个离心管涡旋震荡约一分钟，以确保充分混匀并促进细胞膜裂解。在黑色96孔板中，为每份样品、组分、支架和培养基分别加入100 µL裂解缓冲液，然后在避光条件下，向所有含有裂解缓冲液的孔中加入100 µL细胞DNA溶液并混匀。轻柔地在板中设置仅含裂解缓冲液但不含DNA的孔，以及含有细胞DNA溶液的孔，作为该96孔板的阴性对照和阳性对照。

使用荧光酶标仪，在485纳米激发波长和520纳米发射波长下测定各孔的吸光度。根据制造商说明书，利用DNA标准品生成的标准曲线对数据进行比较，以完成SEM固定。孵育四小时后，将所有支架从其容器中取出，并分别置于新的六孔板和层流中的不同孔内。

然后用 PBS 每孔洗涤支架两次。每孔加入 2 毫升含 1.5% 戊二醛的 PBS，确保支架完全浸没。将培养板置于 4 摄氏度下至少 30 分钟，以固定细胞。

移除固定液，并用 PBS 清洗支架两次。然后将支架转移至新的孔板中，用蒸馏水配制的梯度浓度乙醇进行脱水处理，依次使用 50% 乙醇、70% 乙醇和 90% 乙醇，每种浓度各处理一次。将支架完全浸入溶液中，静置三分钟后弃去溶液，再进行下一步处理。

将支架完全浸入100%乙醇溶液中脱水，浸泡5分钟后弃去溶液，重复操作以化学方法干燥支架。在通风橱内使用六甲基二硅氮烷（HMDS），将支架浸入HMDS中，5分钟后取出；重复一次后弃去HMDS。

去除 HMDS 并使支架自然干燥。然后将支架安装在市售的 SEM 样品台上，以便于在扫描电镜中观察；使用金溅射仪对样品镀金两分钟，确保形成均匀且薄的导电层。最后，将样品放入扫描电镜中，利用 5 keV 的电子束观察细胞附着的支架结构。

结果展示了每种实验条件下接种后4小时的细胞分布位置。该图显示了在此期间所有研究的接种条件下，已附着于支架表面的细胞百分比。细胞附着率相对较低，但置于细胞培养插件中并在30 RPM条件下振荡的支架表现出最高的细胞黏附性。

最低的细胞黏附率出现在置于细胞培养插件中并在静态条件下培养的支架中。培养基组分中存在大量细胞，尤其是在细胞培养中。置于低吸附培养板中的插件细胞黏附率为50%，旋转培养装置中为51%。置于槽道内的支架则在其支架本身中显示出较高的细胞数量。

48%用于槽式摇床，50%用于槽式静态扫描。透射电子显微镜可用于对接种细胞的支架进行直观评估。代表性图像显示，无论接种方式如何，纤维表面的细胞附着均较为有限。

然而，在置于细胞培养插件中并以 30 RPM 振荡的支架上，附着的细胞数量及细胞聚集体数量更多。观看本视频后，您应充分理解：接种已知数量的细胞，并不一定意味着同样数量的细胞能够实际贴附到支架上，尤其是对于那些未覆盖整个培养板底部的支架。针对此类支架，建议首先优化不同的细胞接种方案，以最大程度地提高细胞在支架上的初始贴附率。