优化人骨髓间充质干细胞附着在聚（ε己内酯）静电纺纱线

在此过程中，以不同的方式设置电纺 PCL 支架以确定最佳细胞接种设置。首先，将无菌支架放置在正在研究的不同设置中，包括细胞培养插入物、槽和生物反应器旋转容器。就位后，将已知数量的细胞接种到支架上，然后不受干扰地放置 20 分钟。

然后，将所有样品小心地移至培养箱中，设置 5% 二氧化碳和 37 摄氏度，并在数小时前接受静态或动态条件。在此培养时间之后，通过 DNA 测定确定附着在支架上的细胞数，以量化支架培养基和孔级分中的细胞量。最终，这是通过使用扫描电子显微镜或 SEM 定量存在于支架、孔和周围培养基中的 DNA 来观察细胞与支架的附着来实现的。

当我们知道我们的支架没有覆盖孔板的整个底部时，我们第一次有了这项研究的想法，这意味着并非所有细胞都与支架接触并因此能够附着。首先，通过打开无菌的六孔细胞培养小室并将带齿的较短环与较宽的环状体分开，在层流下设置细胞培养小室。然后拿起齿朝上的环，将四厘米脚手架中的一个悬垂在环的中心，确保它在两侧重叠。

取出带环的主体，将其放在齿环和支架上。然后向下推，确保支架保持在原位并穿过细胞培养物的中心。插入。将带有支架的细胞培养小室放入 6 孔低结合板的孔中，并向支架中加入 10 毫升培养基。

接下来，将聚四氟乙烯槽放入单个培养皿中，并向槽中加入 10 毫升培养基。使用镊子将三厘米长的脚手架之一悬垂到槽中，确保它的长度与槽的较长边缘平行。要在层流下设置生物反应器容器，请通过生物反应器容器的主端口分配 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水或 PBS。

10 分钟后，取出 PBS，用镊子更换为 8 毫升培养基。通过主端口将三个厘米的脚手架之一插入容器中。然后摆出主端口的姿势。

按照文本方案中的说明进行人间充质干细胞计数后，从离心管中吸出留下细胞沉淀的培养基，并替换为计算的培养基体积。Resus 悬浮细胞和培养基，以实现均匀混合。使用 P 200 Gilson 移液器，将移液器尖端沿支架长度和培养基液体表面下方运行，将 200 微升细胞悬液缓慢分配到每个支架中。

保持 20 分钟不受干扰，或者生物反应器容器通过主端口分配 200 μL 细胞悬液。通过注射器端口加满剩余的 2 毫升培养基，使总体积为 10 毫升。接下来，将生物反应器容器转移到旋转容器生物反应器上，并设置为旋转。

以 9 RPM 的速度，将带有细胞培养小室和槽的孔板转移到摇床板上，并设置为在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱或静态培养物中以 30 RPM 旋转。将带有细胞培养小室和槽的孔板转移到细胞培养箱的架子上。设定在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳。

四小时后，从培养箱中取出样品，置于层流下。接下来，从所有样品中去除培养基组分，并放入单独标记的离心管中。以 241 次 G 离心 5 分钟后，去除旋腹液，然后加入 3 毫升裂解缓冲液涡旋，该溶液用于分解细胞沉淀细胞沉淀的支架，固定在细胞培养小室中首先，使用支架切割靠近小室边缘的支架，以释放支架。

然后使用镊子取下支架，放入含有 3 毫升裂解缓冲液的离心管中。然后向每个支架容器中加入 3 毫升裂解缓冲液并刮擦表面。取出裂解缓冲液并放入单独标记的离心管中。

旋每个离心管约 1 分钟，以确保充分搅拌并促进细胞膜裂解。在黑色 96 孔板中，为每个样品组分支架培养基添加 100 μL 裂解缓冲液，然后在黑暗中，向所有含有裂解缓冲液的孔中加入 100 μL 细胞 DNA 溶液并混合。轻轻加入含有不含 DNA 和细胞 DNA 溶液的裂解缓冲液的孔，为孔板提供阴性和阳性对照。

使用荧光读板器，测量孔在 485 纳米激发和 520 纳米发射下的吸光度。根据制造商的说明，将数据与从 DNA 标准生成的标准曲线进行比较，以进行 SEM 固定。孵育 4 小时后，从容器中取出所有支架，并置于新的 6 孔板和层流的单独孔中。

然后用 PBS 清洗支架两次。在 PBS 中加入两毫升 1.5% 戊二醛，以确保完全覆盖支架。将板在 4 摄氏度下放置至少 30 分钟以进行 cel 固定。

取出固定液，用 PBS 洗涤支架两次。然后将支架转移到新的孔板上，在蒸馏水中用增加浓度的乙醇使其脱水，从 50% 乙醇开始，然后是 70%，然后是 90%。将支架完全浸入溶液中，静置 3 分钟，然后丢弃溶液并重复。

完全浸入溶液中并放置 5 分钟，在 100% 乙醇中脱水支架后，丢弃溶液并重复化学干燥支架。在通风柜中使用 HMDS。将支架浸入 HMDS 中，放置 5 分钟，重复一次后取下 HMDS。

拆下 HMDS 并让脚手架干燥。然后将支架安装在市售的 SEM 短头上，以便于在 SEM 涂层内观察，样品涂上金色点样涂层两分钟，以确保覆盖薄而均匀。最后，将样品放入 SEM 中，并使用 5 公斤的电子拱顶电子束可视化细胞坐着的支架。

结果突出显示了每个实验设置在接种后 4 小时后细胞的位置。该图显示了在研究所有接种设置的这段时间内附着在支架表面的细胞的百分比。细胞粘附的百分比相对较低，但对于保持在细胞培养小室中并以 30 RPM 摇动的支架，细胞粘附性最高。

最低的粘附性是固定在细胞培养小室内并保持在静态条件下的支架。培养基组分中存在大量细胞，最明显的是用于细胞培养。保持在 50% 的低结合板中的插入片段和保持在 51% 的旋转容器内保持在槽内的支架表明支架本身内存在的细胞数量增加。

48% 用于槽式摇床，50% 用于槽式静态扫描。电镜检查允许对细胞接种的支架进行视觉评估。代表性图像突出了纤维表面上细胞的有限存在，无论接种设置如何。

然而，更多的细胞和细胞聚集物存在于细胞培养小室中保持并在 30 RP M 下摇动的支架上.观看此视频后，您应该很好地理解接种已知数量的细胞并不一定等同于实际附着在支架上的细胞数量，尤其是对于不覆盖野生板整个基部的支架。对于此类支架，建议首先优化不同的细胞接种设置，以最大限度地提高细胞对支架的初始附着。