利用荧光蛋白酶保护法（FPP）测定膜蛋白拓扑结构

本实验的总体目标是确定整合膜蛋白的拓扑结构。该目标通过在绿色荧光蛋白（GFP）与膜蛋白的氨基端或羧基端之间表达嵌合蛋白来实现。为对照目的，可在细胞中表达目的膜蛋白，同时表达可溶性荧光蛋白（如RFP）。

接下来，细胞质膜会经历选择性通透。通过使用去垢剂处理，可溶性荧光蛋白将从细胞中释放，而膜结合的荧光蛋白则保留在细胞内。最后一步是在通透细胞上施加蛋白酶，并检测荧光信号的保留或丢失情况。

最终，通过荧光显微成像观察到的荧光强度变化可用于展示整合膜蛋白的拓扑结构和取向。与表位作图等现有方法相比，该技术的主要优势在于实验过程不需要大量专用设备或难以获得的多种试剂。该方法有助于解答膜蛋白生物学中的关键问题，例如整合膜蛋白的哪些结构域位于细胞质中，而哪些结构域位于细胞器（如内质网或早期内体）的腔内。

按照文本方案中所述，首先进行荧光蛋白 KY 的构建与验证。随后，采用任何标准的高效、低毒转染方法（包括基于脂质、病毒或电穿孔的技术），将荧光蛋白 KY 转染至人胚胎肾细胞（HEK 293 细胞）中，以实现瞬时或稳定表达。接着，将细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上。在含有二氧化碳的组织培养孵箱中，于 37 °C 条件下，使用适当的组织培养基培养细胞 5 至 48 小时。

使用落射荧光显微镜监测细胞中GFP融合蛋白的表达，GFP的内在荧光信号通常在转染后24至72小时内达到最高水平。当荧光信号达到最大强度时即可使用细胞。此外，也可通过免疫印迹分析，利用针对目标蛋白或GFP部分的抗体来监测蛋白表达水平。

首先建立重力驱动的灌流系统，用于处理细胞。使用连接至独立储液器并通向浴槽单出口的聚乙烯管路，为溶液准备50毫升注射器。放置一支吸液移液管，以维持浴槽体积恒定，并通过手动切换灌流储液器来实现细胞膜通透所需的溶液更换。

首先，从细胞中移除细胞培养基。用 KHM 缓冲液洗涤细胞三次，每次一分钟。将盖玻片置于荧光显微镜载物台上，在 KHM 缓冲液中采集第一张图像，该图像代表对照的非通透状态，用于选择性通透细胞膜前的基准图像。

向细胞中加入含洋地黄皂苷的 KHM 缓冲液，以每分钟 5 毫升的速度灌注含洋地黄皂苷的缓冲液，持续 10 至 60 秒。可通过表达可溶性 GFP 或 RFP 分子来轻松验证细胞质膜是否已充分通透，该分子在膜通透后会迅速扩散出细胞。随后，在洋地黄皂苷处理并实现质膜通透后，通过确认目的荧光蛋白融合体仍保留在细胞内，以验证其已整合至膜结构中。

接下来，表达一种器官特异性的荧光蛋白，例如文中方案所引用的线粒体蛋白。按照之前的方法确定最佳表达条件。通过确保细胞内细胞器的形态在长时间暴露下保持稳定，来确认消化程度和浓度适用于所使用的细胞类型。

为了挖掘toin。用KHM缓冲液洗涤细胞后，直接将蛋白酶加到细胞上。使用重力驱动的灌流系统，以每分钟五毫升的流速灌注细胞，持续灌流整个样本。

接下来，确定荧光信号是否持续存在或发生降解。使用计算机控制的荧光显微镜，通过其视频图像采集功能，在适当的滤光片组下采集荧光显微图像。根据孵育条件对荧光信号强度进行定量分析。

获取包含单个细胞的感兴趣区域内的平均像素强度。在30至60秒内，初始信号强度降低超过90%的情况与GFP蛋白ky的蛋白水解降解一致。在施加钙离子霉素后，可溶性荧光信号应在10至60秒内完全消失。

通过观察在去垢剂处理和通透后荧光信号是否保留，可确认目标蛋白是否与细胞内细胞器相关联。将膜锚定激酶LTK2的羧基末端与GFP融合，并瞬时表达产生荧光标记的LTK2。加入蛋白酶K后，GFP信号迅速消失，表明LTK2羧基末端位于胞质溶胶内。

Cavi和GFP是一种细胞质膜蛋白，其胞质结构域上连接有GFP基团。与LTK two类似，cavi和GFP的信号对digitonin不敏感，但对后续加入的蛋白酶敏感。DS red mito编码一种红色荧光蛋白，该蛋白与细胞色素C氧化酶的线粒体靶向序列融合，在digon透化以及加入蛋白酶K后仍可检测到信号。与DS red mito相关的荧光保持稳定，这与Fluor four位于线粒体内、未暴露于胞质溶胶的特性一致。

当连接到膜蛋白的荧光基团朝向细胞外侧时，例如与黄色荧光蛋白连接的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定型朊蛋白，蛋白酶处理应能迅速淬灭荧光信号，而无需事先进行透膜处理。在对表达该构建体的细胞进行蛋白酶处理后，细胞外的荧光信号迅速消失。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在一到两小时内完成。观看本视频后，您将更深入地理解如何确定目标膜蛋白的拓扑结构。