确定膜蛋白拓扑使用荧光蛋白酶保护（FPP）

该程序的总体目标是确定整合膜蛋白的拓扑结构。这是通过表达积液、绿色荧光蛋白或 GFP 与膜的氨基或羧基尾部之间的蛋白质来实现的。细胞中的目标蛋白 用于控制目的，可以表达可溶性荧光蛋白，例如 RFP。

接下来，质膜进行选择性渗透。使用去污剂挖掘，可溶性荧光蛋白将离开细胞，而膜结合的荧光蛋白将保留在细胞内。最后一步是将蛋白酶施用到通透细胞中，并测定荧光信号的保留或丢失。

最终，使用荧光显微镜成像观察到的荧光强度变化用于显示整合膜蛋白的拓扑结构和方向。与现有方法（如表位定位）相比，该技术的主要优点是该程序不需要大量可能难以获得的专业设备或各种试剂。这种方法可以帮助回答膜蛋白生物学中的关键问题，例如整合膜蛋白的哪些结构域可能位于胞质溶胶内，哪些结构域可能位于细胞器腔内，例如内质网金 G 或内体。

如文本方案中所述，从荧光蛋白 KY 的生成和验证开始此过程。然后使用任何标准的高效、低毒性转染方法（包括基于脂质、病毒或电穿孔的技术）将荧光蛋白 KY 转染到人胚胎肾细胞或 HEK 2 93 细胞中，以产生瞬时或稳定表达，然后将细胞接种在聚赖氨酸包被的盖玻片上。在具有二氧化碳能力的组织培养箱中，将细胞在 37 摄氏度的适当组织培养基中维持 5 至 48 小时。

使用落射荧光显微镜监测细胞中 GFP 融合蛋白的表达，GFP 荧光信号的内在荧光信号通常在 24 至 72 小时内达到最大值。转染后。当荧光信号达到最大水平时，使用细胞也可以使用针对目标蛋白质或 GFP 部分的抗体通过免疫印迹分析来监测蛋白质表达。

首先设置重力进料灌注系统以处理细胞。准备 50 毫升注射器，用于使用聚乙烯管的溶液，聚乙烯管连接到独立的储液槽和浴中带有单个出口的歧管。放置吸液管以保持恒定的浴液量，并通过在用于质膜渗透的灌注储液器之间手动切换来实现溶液更换。

首先，从细胞中取出细胞培养基。洗涤细胞 3 次，每次 1 分钟。在 KHM 缓冲液中，将盖玻片放在荧光显微镜载物台上并收集第一张图像，该图像代表选择性渗透质膜的对照不可渗透图像。

将 KHM 缓冲液中的 digit toin 添加到细胞中，以每分钟 5 毫升的速率用缓冲液和 digit toin 灌注细胞，持续 10 至 60 秒。通过表达可溶性 GFP 或 RFP 分子很容易确认质膜是否具有足够的渗透性，该分子很容易从膜后的细胞中扩散出来。然后渗透确认感兴趣的 GFP 蛋白嵌合体是膜整合的，方法是确认 digon 和质膜渗透后荧光信号的细胞保留。

接下来，表达有机特异性荧光蛋白，例如文本方案中引用的线粒体蛋白。像以前一样确定最佳表达条件。通过确保细胞内器官管的形态在长时间暴露中保持不变，确认挖掘和浓度适合所采用的细胞类型。

为了挖掘 toin.在 KHM 缓冲液中洗涤细胞后，将蛋白酶直接添加到细胞上。以每分钟 5 毫升的流速仔细观察细胞，使用重力进料灌注系统连续沐浴制剂。

接下来，确定荧光信号是持续存在还是降解。使用计算机控制的荧光显微镜上的视频图像捕获功能，在适当的滤光片组下收集荧光显微镜图像。量化荧光信号强度作为孵育条件的函数。

获取包围单个像元的感兴趣区域内的平均像素强度。在 30 至 60 秒内初始信号强度的损失大于 90% 与 GFP 蛋白 ky 的蛋白水解降解一致。可溶性荧光信号应在 digit toin 应用后 10 至 60 秒内完全消失。

通过注意到 digon 和渗透后荧光信号的保留，可以确认目标蛋白质与细胞内细胞器相关。膜锚定激酶 LTK 2 的羧基尾部与 GFP 融合并表达瞬时荧光 ltk。添加蛋白酶 K 后，两个 GFP 信号迅速丢失，表明 ltk 2 的羧基末端位于胞质溶胶内。

Cavi 和 GFP 是一种质膜蛋白，其 GFP 部分连接到胞质溶质结构域。与 LTK 2 一样，来自 cavi 和 GFP 的信号对手指不敏感，但对随后添加蛋白酶 DS red mito 编码红色荧光蛋白敏感，该荧光蛋白在 digon 渗透后与细胞色素 C 氧化酶的线粒体靶向序列融合，以及添加蛋白酶 K。这与 Fluor 4 在线粒体中不暴露于胞质溶胶中的情况一致。

当附着在膜蛋白上的荧光部分面向细胞外部时，如 GPI 锚定朊病毒蛋白附着在黄色荧光蛋白上。蛋白酶处理应快速淬灭荧光信号，而无需像预期的那样事先需要 dig imp 渗透。蛋白酶处理后，表达该构建体的细胞的细胞外荧光信号迅速消失。

一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在一到两个小时内完成。观看此视频后，您应该对如何确定目标膜蛋白的拓扑结构有了更深入的了解。