Name: 利用荧光显微镜追踪脂质双层中的单蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习利用荧光显微镜在脂质双层中进行单蛋白追踪的技术方法。本方案涵盖样品制备、成像设置及轨迹分析，适用于研究膜蛋白动态行为与热力学机制。

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本工作由美国空军科学研究办公室 FA9550-20-1-0324、FA9550-23-1-0583（J.A.B. 和 G.P.N.）以及 FA9550-18-1-0395（J.A.B.）资助。
G.P.N. 感谢以下资助机构： 
(1) 由大学与研究部（MUR）资助的 NEXTGENERATIONEU（NGEU）项目，国家复苏与韧性计划（NRRP），项目 MNESYS（PE0000006）——健康与疾病状态下神经系统的多尺度综合研究（DD 编号 1553，2022年10月11日） 
(2) 由大学与研究部（MUR）资助的 NEXTGENERATIONEU（NGEU）项目，国家复苏与韧性计划（NRRP），项目 CN_00000041——基于RNA技术的基因治疗与药物国家中心（DD 编号 1035，2022年6月17日）。

作者声明无任何利益冲突。

本文介绍了一种单粒子追踪方法，用于直接观察单个膜蛋白在固相支撑脂双层膜中运动及其相互作用的过程。选择水通道蛋白4（AQP4）作为代表性示例，是因为其能够形成由不同亚型调控的动态自组装结构32,33,34。上文概述了一种可靠的样品制备方法，以及在毫秒时间尺度下追踪单个膜蛋白的关键参数。具体步骤包括：（1）制备小单层脂质体（SUVs）；（2）确定合适的荧光标记程度；（3）制备固相支撑基底；（4）在固相支撑脂双层膜中构建跨膜蛋白样品；（5）制备抗荧光淬灭剂；（6）搭建简易的单分子显微镜系统；（7）采集单分子追踪数据；以及（8）使用ImageJ软件分析追踪数据。
所述的逐步方法在概念上是直接明了的；然而，每个关键步骤都有其自身的陷阱和局限性。其中，样品制备是最具挑战性的环节（步骤1-5）。因此，需牢记若干细节。首先是如何构建固相支撑的脂双层。主要有三种方法：（1）Langmuir-Blodgett（LB）法，（2）小单层囊泡（SUV）融合与破裂法，以及（3）旋涂法35,36,37,38,39。每种方法都有其优缺点。例如，Langmuir-Blodgett法能够更精确地控制脂双层的性质和化学组成，包括两个单层之间的非对称组成，并可实现多层结构的可控形成。然而，使用LB槽在技术上要求较高，且设备购置成本高、操作耗时35。旋涂法是一种相对简单的脂双层制备技术；但该方法容易产生多层结构，且需要大量材料，通常所需量大到不切实际39。囊泡融合与破裂过程操作简便，仅需少量材料即可完成。然而，构建亲水表面至关重要，且不同脂质组成通过囊泡融合形成双层膜的难易程度不同（例如，在我们的实验室中发现，带有净负电荷的囊泡只有在添加二价阳离子并延长孵育时间的条件下，才能通过囊泡融合形成脂双层）40。除了建立亲水表面（步骤3）之外，通过囊泡融合形成固相支撑脂双层时还需注意：在整合膜蛋白前后均需对新形成的脂双层进行洗涤。插入前的洗涤可去除多余的SUV及较大的多层囊泡（MLVs），而膜蛋白插入后的最终洗涤则可清除未整合的蛋白。洗涤不充分可能在追踪实验中引入背景信号。
我们已筛选了多种去垢剂，以确定其是否适用于将跨膜蛋白插入固体支撑的脂双层中，包括 C12E9、Tween-20、TritonX-100 以及许多其他去垢剂。我们首选的去垢剂是 DOTM，因为它易于去除，并且对膜最为温和（更不易破坏膜的完整性）。所添加蛋白的量至关重要。若蛋白过多，则无法观察到单个轨迹。在将本方案应用于其他跨膜蛋白时，需通过反复试验调整蛋白用量。然而，本方案中提供的用量是一个极佳的起始点。去垢剂的浓度必须保持在临界胶束浓度或以下；否则，脂双层将被溶解并从石英基底上脱落。
将膜蛋白插入支撑脂双层需要针对每组实验条件进行优化。然而，实现这一过程的常见方法有几种，包括使用蛋白脂质体以及将膜蛋白直接掺入已形成的脂双层41。蛋白脂质体是一种含有嵌入蛋白的脂质体，例如小单层囊泡（SUV）。这些蛋白脂质体可以与预先形成的固相支撑脂双层发生融合，或在脂双层形成过程中与SUV同时掺入42。融合会导致囊泡破裂，从而将蛋白释放到膜中。该方法操作简便，但会导致膜蛋白的取向随机。这可能引起蛋白与固相支撑物之间的强烈相互作用，从而导致扩散特性因蛋白取向不同而产生差异3。本实验方案描述了一种采用直接掺入的方法，可使水通道蛋白4（AQP4）及其他在一侧具有较大亲水结构域的膜蛋白在插入时呈现取向偏好2,5,43,44。
直接观察是科学发现中一种强大的工具。在膜蛋白生物物理学领域，单分子动态成像尤为重要，通过观察单个蛋白质的运动和相互作用，可用于验证假说或提出更准确描述蛋白质行为的新假说。本文所述的实验方案和方法特别适用于二维固相支撑脂双层体系，但也可拓展至包含多种组分的更复杂环境2、活细胞34,45,46,47以及三维体系48。单分子追踪技术为许多其他实验打开了大门，包括双色单分子追踪49、单分子FRET50,51，以及动态超分辨率成像技术，如随机光学重建显微镜（STORM）和点累积纳米级成像拓扑（PAINT）。通过扩展仪器以实现温度控制，还可进一步研究膜蛋白的热力学性质26,43,52。

在天然生物条件下，膜蛋白被复杂的相互作用网络所包围，包括其他膜蛋白、细胞内和细胞外液体中的蛋白质、多种类型的脂质和胆固醇、底物或配体、溶液中的相互作用，以及细胞外基质与细胞内基质之间的相互作用。一种经典的生物物理研究方法旨在深入理解这些特异性和协同性相互作用，其策略始于单一组分，随后逐个引入额外组分，直至体系复杂性接近天然环境—— &#34;分而治之&#34; 生物物理学研究方法。一种现代的分子尺度研究这些相互作用的方法是通过延时单分子荧光成像直接观察单个蛋白质在其环境中运动和相互作用的过程。本文中，我们描述了该方法的基本步骤，包括在石英盖玻片上形成脂双层，以及将一种大型膜蛋白以适用于单分子成像的方式插入预先制备的脂双层中。随后将介绍一种用于在支撑脂双层中追踪单个蛋白质的“主力”实验方案。

关键词：生物物理学，单分子荧光成像，脂双层，石英盖玻片，膜蛋白，延时成像，单蛋白追踪，支撑脂双层
本文介绍了如何利用在亲水性石英盖玻片上破裂的小型单层囊泡（SUVs）制备固相支撑的脂双层。石英表面可通过酸洗或紫外（UV）臭氧清洗进行预处理。用于制备SUVs的脂质应尽可能与目标生物膜的主要化学成分相匹配（例如，水通道蛋白-4（AQP4）存在于星形胶质细胞的质膜中，其主要成分为POPC（46.4%）、POPE（8.5%）、PS（5.6%）、胆固醇（30%）、PI（2.5%）和SM（5.6%））1,2。为防止与固相基底发生相互作用，可添加如聚乙二醇（PEG）修饰的脂质等添加剂，使脂双层与表面分离3,4。每种添加剂的用量必须仔细调整，以确保既不妨碍蛋白质扩散，又能提供足够的支撑力使膜脱离基底表面。PEG化脂质类添加剂通常表现出两种相态：“刷状相”和“蘑菇相”。当PEG浓度较高时形成刷状相，此时聚合物直立排列以减少空间位阻；而在低浓度下则形成蘑菇相，此时聚合物间距足够大，呈无规线团状态存在。通常情况下，刷状相会阻碍扩散，而蘑菇相提供的支撑作用较弱。介于刷状相与蘑菇相之间的浓度最为理想，可在对扩散影响最小的前提下提供足够的支撑3,4。
某些膜蛋白会自发插入固相支撑的脂质膜中，例如P450和细胞色素P450还原酶5，而其他蛋白则需要借助去污剂插入，这一过程较为精细。必须小心清洗以去除这些去污剂以及任何未结合的蛋白质，因为它们可能干扰单分子追踪——该过程将在下文详细描述。本文的主要重点是利用延时荧光成像技术制备用于单分子追踪（SMT）的样品。这需要配备高放大倍数和高数值孔径（NA）的物镜——通常为100倍、1.45 NA的油浸物镜6,7。同时还需要快速且高灵敏度的相机（EMCCD、CMOS或ICCD相机）以及激光激发光源。激光激发需覆盖足够大的视场，以测量较长的蛋白运动轨迹，通常可通过全内反射产生约50 μm × 100 μm的隐逝场，或使用光束整形光学元件（高斯到平顶）的落射照明实现约80 μm × 80 μm的视场8，亦或采用高度倾斜层状光片（HILO）技术，其视场与TIRF类似。全内反射荧光（TIRF）显微镜的优势在于可降低背景信号。下文将介绍一种简单且相对低成本的TIRF显微镜设计。通过添加温度控制装置，还可测量多种热力学性质，如焓、熵和吉布斯自由能9。该技术还要求对膜蛋白进行荧光标记，且标记程度应确保大多数膜蛋白携带荧光标签。
本文关注的跨膜蛋白是AQP4。AQP4是一种水通道蛋白，在星形胶质细胞的终足以及其他中枢神经系统血管区域具有极性分布10。它每秒可转运多达30亿个水分子，参与水稳态调节、细胞迁移、脑水肿、以及通过突触可塑性介导的学习和记忆形成11。AQP4功能失调已被证实与多种神经系统疾病相关，包括脑水肿、视神经脊髓炎和癫痫12,13,14,15。AQP4是一种分子量为32–37 kD的蛋白质，具体大小取决于其亚型，具有四聚体的四级结构，包含八个由连接环连接的疏水性跨膜结构域、一个胞内N端结构域和一个较大的胞内C端结构域16。AQP4主要有两种亚型：M1和M23；两者的差异源于起始翻译位点分别为甲硫氨酸1残基或甲硫氨酸23残基。研究表明，M1亚型可根据其棕榈酰化状态与自身形成二聚体或三聚体9。M23亚型则组装成称为颗粒正交阵列（Orthogonal Arrays of Particles, OAPs）的大分子蛋白聚集体。当两种亚型共表达时，M1亚型通过在其外部形成外围蛋白包被，限制OAPs的进一步生长17,18,19。OAPs的聚集动力学可能是调节脑内水通透性和水稳态的关键因素。本文中，我们描述了在细胞膜中追踪单个AQP4分子并观察单个蛋白质-蛋白质相互作用所需的实验步骤。

<table><tbody><tr><td>1/4 波片</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>确保与激光器匹配</td></tr><tr><td>100倍油镜物镜</td><td>Olympus</td><td>12-563-659</td><td>1.45 数值孔径，复消色差</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>POPC 磷脂</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880210</td><td>铵盐</td></tr><tr><td>300 mm 透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>633 nm 氦氖激光器</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>可更换为其他光源或其他波长</td></tr><tr><td>633 nm 带通滤光片</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>需与所用激光器波长匹配</td></tr><tr><td>655 nm 长通滤光片</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>需根据染料/激光波长进行调整</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&amp;nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>ATTO 655&amp;nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655</td><td>NHS-酯修饰，任何适用于单分子实验的此类修饰染料均可使用。推荐使用ATTO染料，但也可使用Cy5/7</td></tr><tr><td>Bio-beads SM-2 树脂</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>来源于牛肝，水溶液，&amp;ge;30000 单位/毫克</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C547-1</td><td>高效液相色谱级或光谱级</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>ESCO Optics</td><td>R525000</td><td>25 mm 石英材质</td></tr><tr><td>二向色分光镜</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>需根据染料/激光波长进行调整</td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Andor&amp;nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>cellestar 细胞培养管</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>来源于黑曲霉，VII型，&amp;ge;100000 单位/克固体（无额外氧气条件下）</td></tr><tr><td>热风枪</td><td>Harbor Freight</td><td>56434</td><td>用于加热Parafilm，通常任何热风枪均可使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>低自发荧光浸油</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A452-1</td><td>高效液相色谱级或光谱级</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1.5 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>多种规格；建议配备 1000 &amp;micro;L、100 &amp;micro;L 和 10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1.5&quot; 镜筒</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>外螺纹经削薄处理，用于样品制备</td></tr><tr><td>光学平台</td><td>Newport</td><td>RPR Reliance</td><td>平台尺寸取决于可用空间</td></tr><tr><td>光学擦拭纸</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>用于清洁各种组件</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>需确认在使用过程中无荧光性气体释放</td></tr><tr><td>压电驱动器</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>气动隔振器</td><td>Newport</td><td>I-2000 系列</td><td>用于稳定光学平台，消除不平整影响&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>制冷循环浴</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>快门控制器</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>与成像软件连接</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>开关盒驱动器与控制器&amp;nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>载物台控制器</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 材质，25 mm，0.2 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>TEC 元件</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>用于连接帕尔贴热泵与样品架及物镜环</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Meerstetter Engineering</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>温度检测器</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>热敏电阻</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Tube-O-Dialyzer 透析装置</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>截留分子量 4K</td></tr><tr><td>紫外臭氧清洗仪</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro 系列 - 数字型&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>变焦光学组件&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

直接观察是科学发现与理解的基本方法。延时单分子荧光成像技术能够观察单个蛋白质在其周围环境中移动和相互作用的过程，使那些在群体测量中通常被掩盖的状态得以显现。单蛋白追踪特别适用于研究膜蛋白，因其二维特性可实现具有单荧光团灵敏度的快速、宽场成像。利用模拟跨膜蛋白或外周膜蛋白所在环境（如不同类型细胞的质膜或细胞器膜）的人工脂双层，可在接近天然的环境中测量特定相互作用。该方法还允许逐次逐步增加体系复杂性，同时抑制来自荧光和拉曼散射的背景干扰。通过引入温度控制，还可进一步测定单颗粒相互作用的热力学性质。本文中，我们描述了一种基于水通道蛋白-4（Aquaporin-4）在脂双层中进行膜蛋白轨迹的样品制备、数据采集、单分子荧光追踪及分析的实验方案。本研究可作为基础范例，并可推广应用于不同蛋白质和脂双层组成体系的研究。

如方案第2部分所述，使用与荧光染料分子偶联的NHS酯（NHS-染料）对赖氨酸进行标记。蛋白质偶联后，用紫外-可见分光光度计测定染料标记率（DOL）。本实验中，AQP4四聚体的DOL为4.12。接下来，利用下方提供的泊松分布，计算每个AQP4四聚体至少带有一个染料分子的概率。
<img alt="泊松分布公式，P(n, DOL)，用于概率计算的数学方程。" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq7.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Equation 7">     (2)
其中 P 为每个 AQP4 被标记的概率，根据公式 2 计算，每个 AQP4 四聚体带有荧光标记的概率为 98%。每个四聚体上标记数目的分布如 图 2 所示，反映了样品中观察到的亮度分布情况。
本示例数据中，单个荧光染料的信噪比达到背景信号的8-9倍，最亮颗粒的信噪比可达15-20倍以上。这种差异源于激发光束中的位置以及方案步骤2中所述的标记度（DOL）。
在生成的 XML 文件中，相关列为 J、K、L 和 M，分别对应粒子编号 ID、检测到粒子的帧数、粒子的 X 坐标以及粒子的 Y 坐标（见补充文件 6）。在文件的第二个工作表中，计算了步长分布和平均扩散系数，其中步长是指粒子在连续帧之间的移动距离，平均扩散系数由公式3给出：
<img alt="扩散计算：平均位移公式方程。" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq8.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Equation 8">     (3)
其中 Dave 为平均扩散系数，Δt 为帧率。该方程假设为布朗运动，通常在位移较小时成立，可通过分析单个轨迹样本的均方位移随时间变化的关系来验证3,30,31。
步长的直方图显示了扩散颗粒的分布情况，可归因于不同大小的OAPs（图5）。
<img alt="实验室蒸馏装置；用于液体分离和纯化的玻璃仪器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：脂质干燥装置。 该装置由一个10 mL圆底烧瓶和一个真空蒸馏接头组成。氮气通过连接在黄色合成盖上的针头，经0.2 µm注射器滤器以低压通入，该滤器与真空蒸馏接头相连。压力通过连接在带有截短针头注射器上的Tygon管释放。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="概率直方图；荧光标记数量；统计分布；数据分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用公式 2 计算每个 AQP4 单体上荧光标记的预期分布。最可能的荧光分子数量为 4，且 98% 的 AQP4 分子将带有荧光标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光学组件示意图；组件包括管环、Parafilm密封垫、石英盖玻片、透镜管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 3"> 
图3：样品 holder 组件。该组件由一个1英寸SM1透镜管构成，去除了外螺纹并进行倒角处理，以避免与显微镜物镜发生干涉。组件包括石英盖玻片和Parafilm密封垫。整个组件通过SM1卡环固定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发的显微镜装置，包括EMCCD相机、示意图、XYZ载物台、透镜系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：显微镜。 右侧为显微镜的简化示意图；绿色线条表示来自激光器的激发光。从右侧开始，激光光束先通过一个1/4波片，然后由一个300 mm的透镜聚焦。光束被长通二向色镜反射至物镜，并聚焦到物镜的后孔径处。通过使用平移反射镜偏移激发光束，使光束位于物镜孔径边缘，从而在样品中产生倏逝波场。处于焦平面上的发射光由物镜收集，并以红色线条表示。发射光随后穿过二向色镜和一个长通滤光片，再由一个300 mm透镜聚焦到相机上，实现1.7倍的光学放大倍率（物镜与管镜共同提供170倍总放大倍率）。左侧为显微镜的实际图像。请注意，额外的转向反射镜用于精确调整激光光路。同时，检测光路经过优化排列，以最大程度收集来自荧光标记跨膜蛋白的光子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="步长概率图，&lt;D&gt;=0.0143 µm²/s，数据分析，概率分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图5"> 
图5：步长的直方图。 带红色圆圈的蓝色线表示所有步长的直方图。黑色线为多个扩散系数的拟合结果。步长概率分布由以下公式给出：<img alt="静态平衡方程 P(Δr)=Σf(Δr͞i/2DiΔt)e^(-Δr͞i²/4DiΔt)，数学公式。" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq9.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式9"> 其中 fi 为每种扩散粒子亚群的分数比例，假设每种粒子均进行布朗运动。该直方图及拟合结果表明，存在移动较慢和较快粒子的异质性分布，这归因于多种OAP尺寸的分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件1：用于确定SUV制备过程中摩尔百分比组成、总脂质含量以及可选的荧光/FRAP组分的电子表格计算器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/Lipid%20Blend%20Calculator.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：用于轨迹追踪的原始单分子荧光显微镜延时图像序列（TrackMate 教程的源文件）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_raw_cropped.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：原始单分子荧光数据的动画预览，显示处理前的信号强度和背景。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_raw_cropped.gif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件4：过滤后粒子路径（阈值处理后）的动画，显示随时间变化的代表性AQP4轨迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_overlayParticles.gif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件5：使用TrackMate输出结果生成的动画叠加图，展示AQP4分子的全视野粒子追踪。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_overlayALL.gif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件6：用于扩散分析的提取轨迹坐标及计算步长分布的电子表格。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/Reprentative%20Trajectoies%20and%20Step%20Sizes.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。

直接观察是科学发现与理解的基本方法。延时单分子荧光成像技术能够实现……

蛋白质在复杂的构象空间中发挥作用，其中大部分状态是隐藏的。我们利用单分子成像技术来揭示这些状态。在脂质双分子层中追踪单个膜蛋白时，主要挑战在于样品制备、光漂白以及时间分辨率。首先，将脂质柄溶液从冷冻室中取出，使其升至室温。从烘箱中取出一个洁净的10毫升烧瓶，待其冷却至室温。向冷却后的圆底烧瓶中加入900微升光谱纯氯仿和100微升光谱纯甲醇。然后向烧瓶中加入适量的每种脂质，并轻轻旋转以充分混匀。现在将真空蒸馏接头置于圆底烧瓶上方，并将其连接至氮气干燥管线。接着打开氮气，调节压力，直至在手背处 barely 感觉到气流即可。每5微摩尔总脂质加入1毫升缓冲液至圆底烧瓶中。在烧瓶上放置玻璃塞，并用石蜡膜密封。将烧瓶用夹子固定于铁架台上，将其底部浸入60 °C的超声水浴中。确认溶液变为不透明，且烧瓶内壁无脂质残留。孵育一小时后，开启超声仪，并将振幅调至最高。在水浴中移动烧瓶，寻找振荡最强的位置，此时可观察到溶液在烧瓶内明显跳动并喷溅。将溶液超声处理30分钟。观察溶液从不透明变为透明且略带乳光的过程。从烧瓶中取出脂质溶液，并转移至微量离心管中。在4°C条件下，以100,000 G离心1小时。离心后，移去上清液并转移至新的离心管中。将25毫米石英盖玻片放入烧杯中，加入等体积的纳米纯水、30%过氧化氢和浓硝酸。将盖玻片放入已配制好的溶液中加热 30 分钟，直至开始产生气泡。每 10 分钟检查一次溶液，并轻轻摇晃，以防止盖玻片相互粘连。观察盖玻片在摇晃过程中逐渐滑动并分离。分离后，逐渐降低旋转速度以维持其分离状态，并使产生气泡的溶液均匀覆盖在盖玻片表面。随后，在轻轻旋转的同时用纯水彻底冲洗盖玻片，以去除所有化学残留物。或者，可依次使用正己烷和甲醇清洗石英盖玻片，并用镜头纸擦拭，每种溶剂使用后更换新的镜头纸。将盖玻片放入紫外臭氧清洗仪中，待处理面朝向光源。以每平方英寸五磅的压力向腔室内通入氧气，持续五分钟。随后关闭氧气流。现在打开紫外灯照射15分钟，然后让盖玻片静置至少10分钟，以使臭氧消散。将一块新清洁的盖玻片放入25毫米的样品托中。使用1/4英寸SM1镜头套管，切割一个直径为8毫米的双层Parafilm垫片，并将其置于样品托的中央。将50微升的小型单层脂质体液滴加到8毫米垫圈的中心。密封腔室后，在37°C下孵育一小时。孵育结束后，用移液器冲洗去除溶液。向双层膜中加入 50 µL 新鲜缓冲液，重复此过程共 10 次。最后一次冲洗后，从样品槽中移除缓冲液。加入 50 µL 含去垢剂的目标蛋白质等分试样，确保其浓度等于或低于临界胶束浓度。将样品在37摄氏度下孵育至少一小时，以使蛋白质充分结合，随后用缓冲液冲洗样品，去除未结合的蛋白质和去污剂。将垂直像素移位速度设置为约600纳秒，并使用超频模式提高垂直时钟电压。然后将水平像素读出速度配置为最大值。将前置放大器增益调节至2。将放大器输出设置为电子倍增模式，并将电子倍增增益调至最高水平。然后将曝光时间设置为25毫秒。确认实际帧率略高于曝光时间。然后调节激光功率，直至信号明显高于背景噪声。采集足够的成像数据，以获得每样本至少1000条轨迹。进行追踪分析时，将所有数据集裁剪为统一尺寸，并使用 Image J 进行背景校正。在 Fiji 中，将需要分析的视频或堆栈 TIFF 文件拖放到界面中。要输入像素标定信息，请转到“分析”选项卡，选择“设置标尺”，并应用针对该仪器的像素到距离的标定参数。然后保存一份数据集副本，以保留原始数据并记录所做的任何更改。从选定的感兴趣区域中减去背景，并将其应用于原始数据的保存副本。转到“处理”选项卡，选择“减去背景”。在“插件”选项卡中，依次选择“跟踪”和“TrackMate”，以启动用于跟踪分析的 TrackMate 对话窗口。使用紫外-可见光谱法计算出AQP4四聚体的标记度为4.12，泊松分布分析表明98%的四聚体至少携带一个荧光染料分子。直方图显示步长分布较广，与不同大小的正交颗粒阵列的扩散行为一致，计算得到的平均扩散系数为0.0143平方微米每秒。在本视频中，我们鉴定了对水通道蛋白4调控至关重要的关键状态及其相关的热力学作用力。本方案消除了构建含纯化跨膜蛋白的仿生膜时的经验性猜测，适用于延时单分子示踪。在拐点处运行的蛋白质机器，通过延时单蛋白追踪可直接观察其随机路径、分支及终止状态。

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科研

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生物化学

利用荧光显微镜追踪脂质双层中的单蛋白

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

我们介绍一种制备云母支撑脂双层用于高分辨率显微镜观察的方法。云母在原子尺度上透明且平整，但由于操作困难而很少用于成像；我们的制备方法实现了云母片的均匀沉积，并减少了脂双层制备所需的材料用量。...

用于高分辨率光学显微成像的云母支撑脂双层的制备

本文展示了蛋白质功能化的平面玻璃支持脂双层的制备、蛋白质在脂双层内的流动性测定以及蛋白质密度的测量方法。同时概述了构建低噪声全内反射显微镜的路线图，该显微镜能够以高时空分辨率对脂双层中单个荧光染料分子进行可视化观察。...

单分子荧光显微镜在平面支撑双层膜上的应用

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。...

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。...

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。...

单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

本方案描述了一种基于iSCAT的图像处理与单粒子追踪方法，可同时研究大分子与脂质膜相互作用时的分子质量及其扩散行为。文中提供了样品制备、质量-对比度转换、视频采集和后期处理的逐步操作指南，并给出了避免潜在问题的建议。...

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin...

在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

学习利用荧光显微镜在脂质双层中进行单蛋白追踪的技术方法。本方案涵盖样品制备、成像设置及轨迹分析，适用于研究膜蛋白动态行为与热力学机制。

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

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