利用荧光显微镜追踪脂质双层中的单蛋白
December 12th, 2025
本文详细介绍了如何在固体支持脂质双层中创建单蛋白追踪样品。它还解释了一种单分子灵敏度和高速帧率的简单荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的过程。
蛋白质处于复杂态空间，其中大部分是隐藏的。我们使用单分子成像来揭示这些状态。在追踪脂质双层中的单膜蛋白时，主要挑战是样品制备、光漂白和时间分辨率。
首先，将脂质茎溶液从冰箱取出，让它们达到室温。从烤箱取出一个干净的10毫升烧壶，冷却至室温。在冷却的圆底瓶中加入900微升光谱级氯仿和100微升光谱级甲醇。
然后将适量的脂质加入烧瓶，旋转均匀搅拌均匀。现在，在圆形底部烧瓶上放置一个真空蒸馏连接器，并将其连接到氮气干燥管线上。然后打开氮气，调整压力，直到气流几乎能感觉到手背。
每吸一毫升缓冲液，每五微摩尔总脂质注入圆形底部瓶中。在烧瓶上放一个玻璃塞，用石蜡膜封住。将烧瓶和夹子放在环架上，将其底部浸入60摄氏度的超声波浴中。
确认溶液变得不透明，且没有脂质残留在烧瓶内壁。孵化一小时后，打开超声计，将振幅调到最高。在浴缸中移动瓶子，找到溶液在瓶内明显碰撞和喷溅的最强烈搅拌点。
对溶液进行超声处理30分钟。观察从不透明到透明且略带乳白色的过渡。将脂质溶液从烧瓶中取出，转移到微型离心管中。
以100,000克离心，四摄氏度离心一小时。离心后，取出上清液并转移到新的离心管。将25毫米石英套放入烧杯中，加入等量纳米纯水、30%过氧化氢和浓硝酸。
加热盖子，放入预制溶液中30分钟，直到开始冒泡。每10分钟检查一次溶液，轻轻旋转以防止盖子滑动。观察盖子滑动时滑动和分离。
分离后，逐渐降低旋转速度，保持分离，让冒泡溶液均匀覆盖盖子。然后用净化水彻底冲洗盖子，同时轻轻搅拌以去除所有化学残留物。或者，用正己烷清洗石英盖片，再用甲醇清洗，再用晶状物组织擦拭每种溶剂。
将盖子放入紫外线臭氧清洁器中，待处理表面朝向灯具。让氧气以每平方英寸五磅的压力流入腔室，持续五分钟。然后关闭氧气流。
现在开紫外线灯15分钟，然后让盖子滑套静置至少10分钟，让臭氧消散。将刚清洗过的封套放入25毫米样品架中。使用一根四分之一英寸的SM单镜头筒，切出一个直径八毫米的双层平面胶片垫片，并将其置于样品架中央。
将一滴50微升的小型单层囊泡滴到8毫米垫圈中心。密封舱室后，在37摄氏度下孵育一小时。孵育后，用移液器冲洗溶液。
向双层中加入50微升新鲜缓冲液，重复此过程共10次。最后冲洗后，取出样品架上的缓冲液。在洗涤剂中加入50微升所需蛋白质分量，确保浓度处于或低于临界胶束浓度。
将样本在37摄氏度下孵育至少一小时，以便蛋白质掺入，然后用缓冲液冲洗样品，去除未掺入的蛋白质和洗涤剂。将垂直像素移位速度设置为约600纳秒，并通过超频模式提高垂直时钟电压。然后将水平像素读出配置为最大速度。
把前级增益调到2。将放大器输出设置为电子倍增，并将电子倍增器增益设为最高。然后将曝光时间设置为25毫秒。
确认实际帧率是否略高于曝光时间。现在调整激光功率，直到信号明显从背景噪声中突出。收集足够的成像数据，每个样本至少有1000条音轨。
为了跟踪分析，将所有数据集裁剪到一致大小，并使用 Image J.In Fiji 进行背景校正，拖放电影或堆栈 TIFF 文件，插入需要分析的视频文件。要输入像素校准详情，请进入分析标签，选择设置比例，并应用针对该仪器的像素与距离校准。然后保存数据集副本，以保存原始数据并跟踪任何更改。
从选定的感兴趣区域减去背景，并将其应用到保存的原始数据副本上。进入进程标签，选择减去背景。在插件标签页中，选择追踪，然后点击 trackmate，即可启动跟踪对话窗口进行追踪分析。
利用紫外可见光谱法计算AQP四聚体的标记度为4.12，泊松分布分析显示98%的四聚体至少携带一种荧光染料分子。直方图显示了与不同大小正交粒子阵列扩散相符的广泛步长分布，计算出的平均扩散系数为0.0143平方微米每秒。在本视频中，我们确定了对水滴蛋白四调控及其相关的热力学力学力至关重要的关键状态。
该方案消除了利用纯化跨膜蛋白制造适合延时单分子追踪的仿生膜时的猜测。在拐点作的蛋白质机器，时间流逝单蛋白跟踪使得对随机通路、分支和死胡同的直接观察成为可能。
概述
本文详细介绍了在固体支持的脂质双层中进行单蛋白跟踪的样品制作程序。它讨论了使用具有单分子灵敏度的荧光显微镜并概述了单蛋白轨迹的提取。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 单分子成像
背景
- 蛋白质在复杂的状态空间中运作，这些状态通常是隐藏的。
- 单分子成像可以揭示这些隐藏的状态。
- 挑战包括样品制备、光漂白和时间分辨率。
- 理解蛋白质动力学对于洞察细胞过程至关重要。
研究目的
- 提供跟踪单一膜蛋白的协议。
- 增强对蛋白质在脂质双层中行为的理解。
- 改进研究蛋白质动力学的方法。
使用的方法
- 使用氯仿和甲醇制备脂质双层。
- 超声处理和离心以创建均匀的脂质溶液。
- 清洁石英盖玻片以获得最佳成像。
- 设置荧光显微镜以跟踪蛋白质轨迹。
主要结果
- 成功创建了用于蛋白质整合的仿生膜。
- 跟踪分析揭示了水通道蛋白四的调节的关键状态。
- 计算了蛋白质的扩散系数和标记效率。
- 确定了与蛋白质动力学相关的热力学力。
结论
- 该协议简化了单一蛋白质研究的脂质双层的创建。
- 获得的见解可以为未来关于膜蛋白的研究提供信息。
- 该方法可以适应各种蛋白质类型和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence tracking in artificial lipid bilayers enables direct observation of membrane protein dynamics, revealing mechanistic states inaccessible to ensemble assays. This capability is critical for de-risking target validation and improving predictive confidence in early-stage drug discovery, especially for membrane protein targets. The approach supports portfolio decisions by clarifying functional mechanisms and enabling quantitative assessment of protein interactions in near-native environments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly visualizes individual protein states and transitions, supporting mechanistic de-risking.
- Quantifies diffusion and interaction parameters for functional target validation.
- Enables hypothesis-driven interrogation of membrane protein behavior in controlled systems.
- Facilitates identification of regulatory states relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, biomimetic membrane systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative single-molecule readouts for assay standardization and benchmarking.
- Supports scalability and platform reuse by adapting to various proteins and bilayer compositions.
- Enables robust evaluation of compound effects on protein mobility and interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro protein dynamics with disease-relevant membrane environments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic insights.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying target engagement and functional modulation.
- Offers predictive value for translational biomarker development when supported by protein-specific data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical model selection.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by tracking single-protein trajectories in controlled bilayers.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay development and compound profiling.
- Analytics: Provides diffusion coefficients, labeling efficiencies, and trajectory data for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic findings to disease-relevant systems when protein context is aligned.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports broad application across membrane protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane protein targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and single-molecule analysis.
- Demands access to high-sensitivity imaging instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis.
- Adaptable to various proteins and bilayer compositions with protocol optimization.
- Photobleaching and time resolution must be managed to ensure data quality.
