Name: 重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解如何使用强力霉素诱导慢病毒转导系统从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞。该方法通过四个转录因子实现细胞重编程，为干细胞生物学研究提供可靠技术。

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1. 胚胎成纤维细胞的病毒转导
 <ol>
<li>实验前一天，用经ddH2O灭菌过滤的0.2%明胶包被一个15 cm细胞培养皿。将培养皿置于37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
<li>吸除明胶包被培养皿中的液体，以每皿4×105个细胞的密度接种MEF细胞（我们使用了Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）。在30 ml MEF生长培养基（450 ml DMEM中添加50 ml胎牛血清、5 ml 100倍非必需氨基酸、5 ml青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺和0.5 ml 55 mM β-巯基乙醇）中，于37°C、5% CO2条件下培养两天，直至细胞融合度达到约80%。</li>
<li>吸除培养基，加入30 ml含有浓缩慢病毒的MEF生长培养基（4 × 100 μl病毒储存液 + 29.6 ml生长培养基）。轻轻摇动培养皿以确保培养基均匀分布。于37°C、5% CO2条件下过夜孵育细胞。</li>
</ol>
 2. 多西环素诱导重编程
 <ol>
<li>转导后20-24小时，用胰蛋白酶消化转导的细胞，以200 × g离心5分钟，然后重悬于ES/iPS生长培养基中（450 ml Knockout DMEM，添加50 ml ES细胞级胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素、5 ml 200 mM L-谷氨酰胺、0.5 ml β-巯基乙醇和25 μl LIF）。根据细胞培养皿的尺寸，以适当的浓度接种转导的MEF细胞（在重编程效率实验和克隆分离中，我们每10 cm培养皿接种2.5 × 105个细胞；在ICC实验中，每4孔板的每孔接种2 × 104个细胞）。在37°C、5% CO2条件下培养过夜。注意：剩余的转导细胞可冻存于液氮中，以备后续分析。</li>
<li>吸除培养基，更换为新鲜配制的ES/iPS培养基，并添加强力霉素至终浓度为2 μg/ml（我们同时设置了不加DOX的培养基作为阴性对照）。在37°C、5% CO2条件下继续培养。</li>
</ol>
 3. 转导效率的免疫细胞化学分析
多西环素诱导 48 小时后，通过免疫组织化学（ICC）检测转导效率。对重铺于 4 孔板中的细胞进行 ICC 检测。以下方案中所列所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行相应调整。
<ol>
<li>用 PBS（不含 Mg2+ 或 Ca2+）轻轻洗涤细胞一次。</li>
<li>加入 500 μl 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温下固定细胞 15 分钟。</li>
<li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
<li>加入 500 μl 冰冷的含 0.2% Tween®-20 的 PBS 溶液，进行细胞通透处理，室温孵育 10 分钟。</li>
<li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
<li>加入 200 μl 封闭缓冲液，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性结合位点。</li>
<li>加入 200 μl 特异性一抗溶液，4°C 过夜孵育（我们使用了 Oct4、Klf4、Sox2 和 c-Myc 抗体）。</li>
<li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
<li>加入 200 μl 二抗溶液，室温避光孵育 1 小时（我们使用了驴抗兔 Rhodamine 标记二抗、驴抗山羊 AlexaFluor® 594 标记二抗、驴抗小鼠 Rhodamine 标记二抗以及驴抗兔 Rhodamine 标记二抗）。</li>
<li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
<li>加入 DAPI（终浓度为 2 μg/ml 的 PBS 溶液），孵育 10 分钟以显示细胞核。</li>
<li>用 PBS 轻轻洗涤细胞一次。</li>
<li>成像前加入抗荧光淬灭剂 Aqua-Mount，并使用倒置荧光显微镜进行观察。</li>
</ol>
4. 分离与扩增iPS细胞克隆
<ol>
<li>启动重编程过程后（如第2节所述），需监测细胞培养状态，并每48小时更换一次培养基。前12天使用含多西环素的培养基培养细胞，随后从培养基中去除多西环素，以确保后续手动挑选并扩增的iPS克隆为多西环素非依赖性。</li>
<li>应每天观察细胞形态变化，以判断重编程进程；若使用Nanog-GFP/rtTA MEF等细胞，则需同时观察形态变化和GFP荧光以识别重编程克隆。每次实验情况可能不同，但克隆通常在16至22天之间达到足够大小以便分离。在此时间段内识别出的克隆可进行手动分离，并经胰酶消化后用于扩增和分析。</li>
<li>在分离和胰酶消化重编程克隆的前一天，准备24孔板，以每孔5 × 104个细胞的密度接种经γ射线照射的饲养层MEF细胞，于37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
<li>手动挑选每个iPS克隆，并通过胰酶消化使其解离为单细胞悬液。将iPS细胞以每孔2 × 105个细胞的密度重铺至已预接种γ射线照射饲养层MEF细胞的24孔板各孔中，使用ES/iPS培养基培养。置于37°C、5% CO2条件下孵育，每24小时更换一次培养基。</li>
<li>每天观察iPS克隆的生长状态及GFP荧光表达。我们通常在传代前继续培养6天。</li>
<li>判断24孔板中哪些孔的细胞均一表达GFP。对于GFP表达良好的孔，可进行胰酶消化，并按1:8比例传代至已预接种γ射线照射饲养层MEF细胞的4孔板中。这些细胞可用于通过免疫细胞化学（ICC）和碱性磷酸酶（AP）染色进行多能性标志物分析。</li>
</ol>
5. 多能性的免疫细胞化学分析
我们的免疫细胞化学检测在4孔板中扩增的细胞上进行。以下方案中列出的所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行调整。
<ol>
 <li>用不含 Mg2+ 或 Ca2+ 的 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
 <li>每孔加入 0.5 ml 冰冷的含 0.2% Tween 20 的 PBS，4°C 孵育 10 分钟。</li>
 <li>用 PBS 轻轻洗涤细胞三次。</li>
 <li>每孔加入 200 μl 封闭缓冲液，室温孵育 1 小时以封闭非特异性结合位点。</li>
 <li>加入 200 μl 特异性一抗，4°C 过夜孵育（我们使用了 SSEA-1、Nanog 和 Oct4 抗体）。</li>
 <li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
 <li>加入 200 μl 二抗，室温避光孵育 1 小时（我们使用了驴抗小鼠 Rhodamine 偶联抗体和驴抗兔 Rhodamine 偶联抗体）。</li>
 <li>用 PBS 轻轻洗涤细胞两次。</li>
 <li>加入 DAPI（终浓度为 2 μg/ml 的 PBS 溶液），孵育 10 分钟以显示细胞核。</li>
 <li>用 PBS 轻轻洗涤细胞。</li>
 <li>成像前加入抗荧光淬灭剂 Aqua-Mount，并使用倒置荧光显微镜观察。</li>
</ol>
6. 诱导多能干细胞集落的碱性磷酸酶（AP）染色
<ol>
<li>第4部分的iPS细胞集落也可使用市售试剂盒，按照生产商提供的方案检测碱性磷酸酶（AP）活性。</li>
</ol>
第7部分. 代表性结果
Stemgent DOX 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可用于将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）。在MEFs转导后，经多西环素处理的细胞（DOX+）中可检测到转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达，而在未处理（DOX-）的细胞中则几乎检测不到或无表达（图1）。随着时间推移（本示例中为12天的DOX处理），细胞形态逐渐发生变化，形成更大、更类似胚胎干细胞（ES细胞）的克隆，其克隆边界清晰，并呈现三维生长特征（图2a）。当撤除DOX后，部分类似ES细胞的克隆出现明显的形态逆转，但仍有大量克隆保持iPS细胞形态（图2a）。这些iPS克隆在挑取并传代后，表现出典型的多能性标志物表达，包括碱性磷酸酶（AP）、Nanog、Oct4和SSEA-1（图3）。本实验所用MEF细胞类型（Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）在重编程至多能状态时，会从内源性Nanog位点表达GFP。因此，GFP表达可作为重编程成功与否的初步指标（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="细胞荧光显微镜图像；有无Dox条件下的基因表达；Oct4、c-Myc、Klf4、Sox2。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1： DOX诱导后48小时的免疫细胞化学（ICC）分析。最左侧图（-DOX）为未进行DOX诱导时四种转导因子表达的代表性阴性对照。通过相应的抗体（红色显示）检测正确表达的转录因子，并使用DAPI染色以显示细胞核。
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="不同阶段的细胞培养比较，显微镜下的GFP荧光分析图像及示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2： Nanog-GFP/rtTA小鼠胚胎成纤维细胞向诱导性多能干细胞状态的形态学转变。A) 100倍相差显微成像显示细胞随时间从第3天（D3+Dox）至第22天（D22）逐渐压缩并转化为iPS细胞集落的过程。多西环素（DOX）于第12天撤除。左上角图：未加DOX培养板的20倍阴性对照图像。B) DOX诱导后第18天一个典型iPS细胞集落的200倍相差显微与GFP荧光图像。C) DOX诱导后第18天另一个iPS细胞集落的200倍相差显微与GFP荧光图像。
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="细胞分化分析；免疫荧光显微镜；GFP、罗丹明、DAPI染色结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3： 诱导性多能干细胞（iPS）克隆的分析。（A）iPS克隆的相差显微镜图像及碱性磷酸酶（AP）染色结果（200倍放大）。（B）多能性标志物分析：左图显示相差显微镜图像与GFP重编程报告基因表达的叠加图像，GFP表达反映内源性Nanog的表达水平；中图显示多能性标志物的免疫细胞化学（ICC）染色结果；右图显示DAPI染色结果，用于显示细胞核形态（100倍放大）。

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+mouse+liver+and+stomach+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells.</a> Science. 321, 699-702 (2008).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Lerou, P. H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of embryonic stem cells.</a> Blood Rev. 19, 321-331 (2005).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
</ol>

作者 Brad Hamilton 受雇于 Stemgent 公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

这些结果表明，Stemgent DOX 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可通过诱导小鼠胚胎成纤维细胞中外源性转录因子的表达，高效生成诱导多能干细胞（iPS）克隆。在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，可在初次感染步骤中调整活性病毒与靶细胞的比例（即感染复数，M.O.I.），以提高或降低转导效率，从而影响靶细胞群体中整合的病毒数量。其次，调整细胞暴露于DOX的时间长度可影响iPS细胞克隆生成的效率。第三，靶细胞的增殖能力会影响重编程效果，因为处于活跃生长和分裂状态的细胞更易于进行重编程。最后，当针对不同细胞数量或不同规格的组织培养皿修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞数量。

<table><tbody><tr><td>DOX 诱导型小鼠转录因子浓缩型慢病毒套装</td><td>Stemgent</td><td>00-0003</td><td></td></tr></tbody></table>

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

通过使用一组特定的转录因子和细胞培养条件，Yamanaka 及其同事证明，利用逆转录病毒介导的方式递送并表达 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，能够诱导小鼠成纤维细胞重编程为多能状态。1 后续研究进一步表明，使用多西环素（DOX）诱导型慢病毒递送系统，可从多种其他成年小鼠体细胞类型中生成初级和次级诱导多能干细胞（iPS 细胞）。2,3
诱导性多能干细胞（iPS细胞）在形态、增殖能力以及诱导畸胎瘤形成的能力方面与胚胎干细胞（ES细胞）相似。这两类细胞均可作为再生医学中分化细胞或组织生成的多能性起始材料。4-6 相较于ES细胞，iPS细胞还具有独特优势，因其在不涉及胚胎破坏所引发的伦理问题的前提下，仍具备ES细胞的关键特性。
本文演示了使用Stemgent DOX诱导型小鼠转录因子慢病毒套装对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行重编程的实验方案。同时我们还证明，该Stemgent DOX诱导型小鼠转录因子慢病毒套装能够在转导MEF后表达全部四种转录因子，从而诱导产生具有多能性干细胞状态的细胞，这些细胞表现出与胚胎干细胞（ES细胞）特征一致的多能性标志物。

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS 细胞克隆。

利用一组特定的转录因子和细胞培养条件，Yamanaka 及其同事证明了通过逆转录病毒介导的递送和……

大家好，我是 Brad Hamilton，来自 STEM Gen 的研发部门。今天我们将向您展示一种从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞的实验方法。该实验步骤既可用于诱导性多能干细胞的生成，也可用于研究重编程过程。现在我们开始操作。首先将小鼠胚胎成纤维细胞（或称为MEF细胞）接种至直径15厘米的明胶包被培养皿中，接种密度为每皿4 × 10⁵个细胞。现在加入 30 毫升甲醇生长培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养细胞两天，直至细胞融合度达到约 80%。培养结束后，吸除培养基，加入 30 毫升含有浓缩慢病毒的生长培养基。轻轻摇晃培养皿，以确保培养基分布均匀。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，完成病毒转导。接下来进行多西环素诱导的重编程。转导后20至24小时开始重编程，用胰蛋白酶消化转导的细胞，并在200 ×g下离心5分钟。接下来，小心吸除细胞沉淀中的培养基，并将细胞重悬于生长培养基中。待细胞悬浮后，根据所使用的细胞培养皿尺寸，以适当的浓度接种转导的细胞。在此，我们使用每10厘米培养皿2.5×10⁵个细胞进行重编程效率实验和iPS克隆分离，使用每孔2×10⁴个细胞接种于4孔板中进行免疫化学实验。为监测转导效率，将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。在此阶段，如需后续分析，细胞可冻存于液氮中。第二天，吸去培养基，更换为添加了多西环素的新鲜生长培养基，使其终浓度为每毫升2微克。设置一个不含多西环素的培养基作为阴性对照。最后将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。我们已启动重编程过程。一般来说，多能干细胞克隆在16至22天后将生长至足够大，可用于分离。在演示该步骤之前，我们需要首先使用化学方法检测转导效率。在多西环素诱导后48小时，对重新接种于四孔板中的细胞进行免疫化学检测。本方案中列出的所有体积应根据细胞培养板的尺寸进行调整，首先轻柔地洗涤细胞。用不含镁离子和钙离子的 PBS 洗涤一次后，在室温下用 500 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。随后在室温下用 PBS 轻柔洗涤细胞两次。接着，加入 500 µL 冰冷的含 0.2% Tween 20 的 PBS，室温孵育 10 分钟，以通透细胞。再洗涤细胞两次后，在室温下加入200微升封闭缓冲液，封闭非特异性抗体结合，孵育1小时。然后加入200微升所需的一抗。此处我们使用多能性标志物 T 4K LF four、SOX two 和 cmic。第二天将细胞在 4 摄氏度下孵育过夜。用 PBS 轻轻洗涤细胞两次后，避光条件下于室温加入 200 微升二抗孵育一小时。此处我们使用与荧光染料偶联的适当二抗进行可视化，在孵育后采用倒置荧光显微镜观察。再将细胞洗涤两次，随后加入DPI并再次孵育10分钟以显示细胞核。最后，在最后一次洗涤后，加入抗荧光淬灭封片剂（antifa aqua mount），然后使用倒置荧光显微镜对细胞成像，以确定转导效率。开始分离和扩增多能干细胞。启动重编程过程后，每天监测培养物，并每48小时更换一次相应的培养基。我们使用添加了多西环素的培养基培养细胞前12天，之后从培养基中去除多西环素。用于扩增而人工挑选的诱导性多能干细胞（IPS）克隆需在含多西环素的条件下培养。应每天监测独立细胞，观察是否出现表明重编程过程的形态学变化。每次实验情况可能不同，但通常在DS诱导后16至22天，克隆即可达到足够大小，适合进行分离；应在开始分离和胰蛋白酶消化重编程克隆的前一天进行此操作。通过在24孔板中接种经γ射线照射的mets饲养层细胞，密度为每孔5×10⁴个细胞，制备培养板。将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，手动挑选每个IPS克隆，并用胰蛋白酶消化以解离细胞聚集体，将解离后的IPS细胞重悬于小鼠胚胎干细胞培养基中，接种至前述24孔板的各个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下继续培养细胞。每24小时更换一次培养基。每天观察iPS细胞集落的生长情况和GFP荧光。我们在进行多能性分析前，将培养物孵育了六天，然后分装到四孔板中。确定24孔板中哪些孔的细胞均匀表达GFP。选择GFP表达良好的孔，进行传代处理，以1:8的比例接种至已预先铺有经γ射线照射的间充质细胞饲养层的4孔板中。这些细胞可用于免疫细胞化学（ICC）分析，以启动多能性分析。用不含镁离子和钙离子的PBS轻柔洗涤细胞两次。每孔加入 0.5 毫升预冷的含 0.2% 20 的 PBS，冰上孵育细胞 10 分钟。在 PBS 中再洗涤三次后，每孔加入 200 微升封闭缓冲液，室温下封闭非特异性结合位点 1 小时。然后每孔加入 200 微升所需的一抗。此处，我们使用SSEA、nanog和OCT4在4°C条件下过夜孵育细胞。轻柔洗涤细胞两次后，在避光条件下加入200 µL二抗，室温孵育1小时。我们采用与荧光染料偶联的相应二抗，通过倒置荧光显微镜进行观察；再经过两次洗涤后，加入DPI并孵育细胞10分钟。最后洗涤一次后，在使用倒置荧光显微镜观察细胞前，加入抗荧光淬灭封片剂（antifa aqua mount）。也可利用市售试剂盒对诱导多能干细胞（IPS）集落进行碱性磷酸酶活性检测。该干细胞基因转导可诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可用于在转导中表达转录因子，从而将胚胎干细胞（MES）重编程为IPS细胞。在用多西环素处理的细胞中可检测到 T four、SOX two、KLF four 和 seic 的表达，而在未处理的细胞中则几乎无法检测到表达。随着时间推移，形态学变化将逐步进展，形成更大、更类似胚胎干细胞（ES 细胞）的克隆集落，其边界清晰，并呈现三维生长特征。当去除多西环素后，部分类似 ES 细胞的克隆集落会出现明显的细胞形态逆转现象。然而，许多克隆仍保持其诱导多能干细胞（IPS）形态。挑取并传代这些IPS克隆后，可观察到典型的多能性标志物表达，包括碱性磷酸酶、Nanog、T四和SSEA一。本实验所用的甲基细胞在内源性 nag 位点表达了 GFP。因此，当细胞重编程至多能性状态时，GFP 的表达可作为重编程成功的一个初步指标。我们刚刚向您展示了如何利用四因子多西环素诱导型抗病毒系统，将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。进行此操作时，需注意在设计重编程实验时，应考虑多个变量以优化重编程效率。首先，可在初次感染步骤中调整有活性的病毒与细胞的比例，以提高或降低转导效率，从而影响靶细胞群体中整合病毒的数量。其次，调整细胞暴露于docs的时间长短，会影响生成的诱导多能干细胞（IPS）克隆数量。第三，靶细胞的增殖能力会影响重编程效率，因为处于活跃生长和分裂状态的细胞更易于进行重编程。最后，当针对不同细胞数量或不同规格的组织培养皿修改实验方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整靶细胞的数量。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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生物学

重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。...

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

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由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

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使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

通过强制表达转录因子 Oct-4、Sox-2、Klf-4 和 c-Myc，可将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞，但效率较低。重编程过程中的稀有中间态细胞可通过针对细胞表面标志物 Thy-1.2、Ssea-1 和 Epcam...

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利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

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