重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统
November 13th, 2009
Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置可以重新编程诱导多能干细胞（iPS细胞）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。在这里，我们展示了鼠标重新编程转录因素Oct4的DOX诱导表达的协议，SOX2，KLF4和c - Myc基因产生的iPS殖民地，表达共同的MES多能性标志物。
大家好，我是 Brad Hamilton。我在 STEM Gen 的研发部门工作。今天，我们将向您展示如何从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞的程序。
该程序可用于产生诱导多能干细胞和研究重编程过程。那么让我们开始吧。首先将小鼠胚胎成纤维细胞或甲基细胞接种到 15 cm 明胶包被的培养皿上，接种密度为每培养皿第五个细胞的 4 倍 10 倍。
现在加入 30 毫升冰毒生长培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞两天，直到它们达到大约 80% 汇合。完成后，孵育吸出培养基并加入 30 mL 生长物。补充有浓缩慢病毒的培养基。
轻轻摇动培养皿，确保培养基均匀分布。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜，病毒转导完成。让我们继续讨论多西环素诱导的重编程。
转导后 20 至 24 小时开始重编程，胰蛋白酶是转导的细胞，并以 200 Gs 离心 5 分钟。接下来，小心地从细胞沉淀中吸出培养基，并将细胞重悬于生长培养基中。悬浮种子后，以适合您使用的细胞培养皿大小的浓度转导的 MES。
在这里，我们使用每 10 厘米培养皿中 2.5 倍 10 至第五个细胞进行重编程效率实验和 IPS 集落分离，在四个孔板中使用 2 倍 10 至第四个细胞进行免疫化学实验。为了监测转导效率，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。在此阶段，如果需要，可以将细胞冷冻在液氮中以备将来分析。
第二天，吸出培养基，并用补充有多西环素的新鲜生长培养基替换，最终浓度为 2 μg/mL。我们包括含有不含多西环素的阴性对照培养基。最后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。
我们已经启动了重新编程过程。通常。多能干细胞集落将在 16 至 22 天后足够大，以便分离。
在我们演示该程序之前，我们需要首先使用化学来验证转导效率，以确定转导效率。在多西环素诱导后 48 小时，对重新接种在 4 个孔板中的细胞进行免疫化学测试。本方案中列出的所有体积都应根据细胞培养板的大小进行调整，首先轻轻洗涤细胞。
使用不含镁或钙离子的 PBS 后，用 500 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞 15 分钟。在室温下，用 PBS 再次轻轻洗涤细胞两次。接下来，加入 500 微升冰冷的 0.2% 吐温 20 的 PBS 溶液，在室温下孵育 10 分钟，渗透细胞。
再洗涤细胞两次后。在室温下加入 200 μL 封闭缓冲液 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。现在加入 200 μL 所需的一抗。
这里我们使用多能性标记物 T 4K LF four、SOX 2 和 cmic。第二天在 4 摄氏度下孵育细胞过夜。用 PBS 轻轻洗涤细胞两次后，在室温下与 200 μL 二抗孵育 1 小时，保护板避光。
在这里，我们使用与荧光四联体偶联的适当二抗进行可视化，在孵育后使用倒置荧光显微镜进行可视化。再洗涤细胞两次，然后添加 DPI 并再次孵育 10 分钟以观察细胞核。最后，在最后一次洗涤后，在用倒置荧光显微镜对细胞进行成像之前添加 antifa aqua 支架以确定转导效率。
开始分离和扩增多能干细胞。开始重编程过程后，每天监测培养物，并每 48 小时更换一次适当的培养基。我们使用补充多西环素的培养基在前 12 天培养细胞，然后从培养基中去除多西环素。
手动挑选用于扩增的诱导多能干细胞或 IPS 集落是多西环素。应每天监测独立细胞的形态变化，以指示重编程过程。每个实验都会有所不同，但菌落通常足够大，可以在 DS 诱导后 16 至 22 天（即开始分离和胰蛋白酶重编程菌落过程的前一天）进行分离。
通过以 5 倍 10 的密度接种 mets 的 γ 辐照饲养层制备 24 孔板到每孔的第四个细胞。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第二天，手动挑选每个 IPS 集落并尝试，将其茴香化以解离细胞聚集体，在先前 24 孔板的各个孔中的小鼠胚胎干细胞培养基中复制 IPS 细胞，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。
每 24 小时更换一次媒体。每天监测 IPS 菌落的生长和 GFP 荧光。我们将培养物孵育 6 天，然后包装到 4 个孔板中进行多能性分析。
确定 24 个轮板的哪些孔均匀表达 GFP，具有良好的 GFP 表达的孔可以被绊曲、切入并传代 1 到 8 个孔板中，这些孔板之前有 mes 的 γ 辐照饲养层。然后，这些板可用于多能性的 ICC 分析，以开始多能性分析。用不含镁或钙离子的 PBS 轻轻洗涤细胞两次。
每孔加入 0.5 毫升冰冷的 0.2% 的 PBS 溶液，在 20 种 PBS 中加入，并将细胞孵育 10 分钟。在 PBS 模块中再洗涤 3 次后，在室温下与 200 μL 封闭缓冲液非特异性结合 1 小时。现在加入 200 μL 所需的一抗。
在这里，我们使用 SSEA one nanog 和 OCT four 在 4 摄氏度下孵育细胞过夜。轻轻洗涤细胞两次后，在室温下用 200 μL 二抗孵育 1 小时，避光。在这里，我们使用适当的荧光力偶联的二抗进行可视化，在另外两次洗涤后使用倒置荧光显微镜，添加 DPI 并孵育细胞 10 分钟。
现在，在最后一次洗涤后，在用倒置荧光显微镜对细胞成像之前添加 antifa aqua 支架。也可以使用市售试剂盒分析 IPS 集落的碱性磷酸酶活性。Stem gent Docs 诱导小鼠 TF 慢病毒组可用于在转导转录因子的 MES 表达后将 MES 重编程为 IPS 细胞。
在用多西环素处理的细胞中可以检测到 T 4、SOX 2、KLF 4 和 seic，但在未处理的细胞中可以检测到很少或没有表达。形态变化将随着时间的推移而发展，以产生更大、更像 ES 细胞样的集落，具有明确的集落边缘和三维生长。当 docs 被删除时，一些 ES 细胞样集落的细胞形态发生了明显的逆转。
然而，许多菌落保持了其 IPS 形态。这些 IPS 集落在挑取和传代时显示。碱性磷酸酶、nano T four 和 SSEA one 的典型多能性标志物表达。
本实验中使用的冰毒细胞类型表达来自内源性 nag 基因座的 GFP。因此，当重编程为多能性状态时，GFP 表达可用作成功重编程的初步指标。我们刚刚向您展示了如何使用四转录因子多西环素诱导型抗病毒系统诱导小鼠胚胎成纤维细胞的重编程以诱导多能干细胞。
执行此程序时，请务必记住，在设计重编程实验时，应考虑几个变量以优化重编程的效率。首先，可以在原发性感染步骤中修改活性病毒与靶细胞的比例，以提高或减少转导效率，从而影响靶细胞群中整合病毒的数量。其次，调整细胞暴露给 docs 的时间长度会影响生成的 IPS 菌落的数量。
第三，靶细胞的增殖能力会影响重编程，因为积极生长和分裂的细胞更容易接受重编程。最后，当修改不同细胞数或不同大小的组织培养皿的方案时，建议根据培养皿的表面积按比例调整目标细胞数。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种使用Dox诱导的慢病毒系统从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）生成诱导多能干细胞（iPSCs）的协议。该方法允许对重编程过程进行研究，并生成表达多能性标记的iPS集落。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 重编程技术
- 细胞培养方法
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）可以从体细胞生成。
- 重编程涉及特定转录因子的表达。
- Dox诱导系统允许这些因子的受控表达。
- 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为iPSC生成的模型。
研究目的
- 展示从MEFs生成iPSCs的协议。
- 评估使用Dox诱导转录因子重编程的效率。
- 提供分析iPSCs中多能性标记的方法。
所用方法
- 将MEFs接种到明胶涂层的培养皿中并用生长培养基孵育。
- 用浓缩慢病毒转导细胞并用多西环素诱导重编程。
- 通过免疫化学监测转导效率。
- 分离和扩展iPSCs集落以进行进一步分析。
主要结果
- 从MEFs成功生成iPSCs集落。
- 在分离的集落中表现出多能性标记的表达。
- 建立了一种可靠的监测重编程效率的方法。
- 为未来关于iPSCs生成的研究提供了详细的协议。
结论
- Dox诱导的小鼠TF慢病毒集对MEFs的重编程有效。
- 该方法可以用于研究多能性和重编程机制。
- 未来的应用可能包括疾病建模和再生医学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Controlled reprogramming of mouse embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using a doxycycline-inducible lentiviral system enables precise interrogation of pluripotency mechanisms and target gene function. This approach supports early-stage discovery by providing a reproducible, scalable platform for generating disease-relevant cell types and evaluating reprogramming efficiency. The method enhances predictive confidence in stem cell-based models, facilitating risk-adjusted portfolio decisions in regenerative medicine and cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic testing of transcription factor combinations for functional target validation in reprogramming.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of individual factors on pluripotency induction.
- Facilitates hypothesis-driven studies of gene regulatory networks in cell fate transitions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, inducible system for generating validated pluripotent cells for downstream assays.
- Enables reproducible quantification of reprogramming efficiency and marker expression.
- Supports assay development for screening compounds that modulate reprogramming or pluripotency.
Translational & Preclinical Research
- Offers a platform for generating disease-relevant iPSC lines for preclinical modeling.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling marker-based validation of pluripotency.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This inducible reprogramming system fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling iterative hypothesis testing and functional validation of pluripotency targets.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of transcription factor requirements and pathway dependencies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing reprogramming conditions and efficiencies.
- Analytics: Provides immunochemical and fluorescence-based readouts for robust statistical analysis.
- Translational Research: Enables generation of iPSC lines for disease modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable workflow for iPSC generation across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pluripotency induction and target validation.
- Operational Value: Standardizes reprogramming protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling quantitative assessment of reprogramming success.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction and stem cell culture techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and immunochemistry infrastructure for marker analysis.
- Demands cross-team standardization of cell seeding densities and induction protocols.
- Protocol adaptation may be necessary for different cell types or plate formats.
- Efficiency and reproducibility depend on careful control of viral titers and doxycycline exposure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:09
Introduction
0:30
Viral Transduction of Mouse Embryonic Fibroblasts
1:25
Doxycycline Induced Reprogramming
3:18
Immunocytochemical Analysis of Transduction Efficiency
5:31
Isolating and Expanding Induced Pluripotent Stem Cell Colonies
7:39
Immunocytochemical Analysis for Pluripotency
9:14
Pluripotency Marker Analysis
10:31
Conclusion
