一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

以下实验的总体目标是生成结构切换型适配体，作为识别元件整合到检测平台上，该平台通过信号报告适配体在结合靶标后发生的构象变化来实现检测。该目标通过将生物素标记的捕获探针和互补DNA文库加入链霉亲和素包被的磁珠中，从而将DNA文库固定在磁珠表面来实现。随后，将磁铁置于溶液中，使能够结合的序列保留在磁珠上，而无法结合的序列则被分离去除。

随后对保留的序列进行纯化并扩增，以用于下一轮筛选。经过几轮筛选后，将负筛选步骤加入该过程。在经过多轮筛选后，所筛选出的适体在结合靶标时会表现出结构变化，这一结果基于金纳米颗粒靶标检测实验。

与基于溶液的细胞X等现有技术相比，该技术的优势在于无需将目标物固定在固体载体上。因此，该技术的应用意义在于对个体生理状态的风险评估，这得益于皮质醇作为应激指标，可进一步用于评估健康问题。本方案中务必使用新鲜配制的DNA溶液，特别是用于目标物和对照的DNA溶液。

DNA 的制备需要特别注意。取 100 微升 DNA 文库 aliquot 转移至 PCR 管中，放入恒温混匀仪，在 95 摄氏度加热 5 分钟。然后将 PCR 管转移至冰上，待后续使用前保存。在使用该 DNA 前，需用分光光度计测定其准确浓度。

接下来，准备磁珠，涡旋振荡编码磁珠，并将其中 400 µL 转移至新的微量离心管中。将该管置于磁力架上静置两分钟，吸除上清液，然后洗涤磁珠。加入 400 µL 结合缓冲液，涡旋振荡以完成洗涤步骤。

使用磁铁分离磁珠并弃去上清液。重复此洗涤过程三次。接下来，将捕获探针固定在磁珠上。

首先，将磁珠重悬于400微升结合缓冲液中，并加入50微摩尔的捕获探针。然后在室温下轻轻振荡孵育10分钟。为去除未结合的捕获探针，用400微升结合缓冲液按前述方法再洗涤磁珠三次。

经过三次洗涤后，再加入 400 微升缓冲液，取其中 100 微升珠子溶液用于后续步骤，其余部分保存在 4 摄氏度。剩余的珠子溶液可用于后续多轮筛选，最长可保存三周。当需要更多珠子时，可通过使用更长的探针以提高该筛选方案的严谨性来制备。

例如，在第13轮之后使用更长的探针，此时已通过其他严谨性条件实现了显著富集。当使用从储存中取出的磁珠时，首先用结合缓冲液对工作等分试样进行两次洗涤，每次洗涤使用200 µL结合缓冲液。否则，新制备的磁珠已处于洁净状态。

现在将 100 µL 快速冷却的 DNA 加入磁珠中，并在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。孵育结束后，分离磁珠，弃去上清液。计算所含 DNA 的浓度，以确定结合到磁珠上的 DNA 量。

接下来，用200 µL结合缓冲液洗涤磁珠三次。每次加入结合缓冲液后，轻轻振荡5分钟，使缓冲液充分洗涤磁珠。然后在结合缓冲液中配制浓度为100 µM的目标分子溶液，并用200 µL该溶液重悬磁珠，即含有目标分子的溶液。

在此情况下，皮质醇通常在第一轮筛选中高度富集。在常温条件下，将磁珠与靶标轻柔振荡孵育半小时。孵育结束后，保留含有靶标结合序列的上清。

每轮富集后，从最终的上清液中取样以监测富集过程。通过透析去除上清液中的皮质醇。如果目标分子在每轮富集后不会干扰在260纳米处测定DNA吸光度，则可省略此步骤。使用阳性筛选步骤中收集的上清液作为模板，通过PCR扩增目标结合DNA。

初步应始终运行小规模的测试性PCR，以确定最佳扩增循环数。每个循环后取10微升样品，并与25个碱基对的DNA分子量标准参照物进行比较。此处文库应在85个碱基对处出现条带，而过度扩增的产物在第10个循环后即已显现，因此应使用更少的循环次数。

该结果在不同轮次之间可能存在差异，因此每次都需要进行预实验。然后使用选定的循环次数，利用八排管进行大规模PCR反应。扩增6至8毫升反应混合物，以获得下一轮筛选所需的扩增产物量，即1至2.5纳米摩尔的DNA。

使用凝胶对部分 PCR 产物进行再次验证。然后利用非磁性链霉亲和素包被珠将大部分产物转化为单链 DNA。将 300 微升珠子加入由 Fritz 封阻的小型层析柱中。

然后使用带锁扣的注射器，用五毫升结合缓冲液轻轻洗涤珠子。更换溶液以洗涤柱子时，将注射器从柱子上取下，并将柱塞从注射器中取出。这样可以避免对珠子造成不必要的扰动。

为每列1毫升PCR产物制备并洗涤足够数量的磁珠柱。使用轻微压力将PCR产物通过磁珠柱。DNA产物将通过其反义链与磁珠结合而被保留。

然后用五毫升结合缓冲液洗涤与DNA结合的柱子，以去除所有PCR组分，仅保留结合池中的DNA。为使DNA从柱子上解离，加入0.5毫升0.2摩尔的氢氧化钠。随后使用预先以无核酸酶水制备的脱盐柱，对洗脱液中的单链DNA进行脱盐。弃去最初流出的0.5毫升穿流液。

然后将一毫升无核酸酶水通过层析柱，以收集脱盐后的DNA。测定所收集DNA的吸光度，并为其进行下一轮筛选做好准备。如文本方案所述，将收集到的单链DNA重新加入到一份新制备的、含有捕获探针的磁珠等分试样中。

第二轮筛选与第一轮类似，但采用较低浓度的皮质醇。然而，从第三轮开始，在正向筛选之前需加入负向筛选步骤。对于第一轮负向筛选，在结合缓冲液中加入200微升浓度为1微摩尔的孕酮至珠粒中。

它在结构上与皮质醇相似但不同。在后续步骤中，于室温下轻轻摇动混合物30分钟，然后提高孕酮的浓度。弃去上清液，并用200 µL结合缓冲液洗涤磁珠两次。

然后进行阳性筛选。如前所述，随着筛选轮次的进行，底物浓度有所变化，以调节筛选过程的严格性。具体细节在文本方案中讨论。

接下来，按照文本方案进行用于皮质醇检测的金纳米粒子分析。这种快速且简单的比色读数依赖于适体在结合目标物时发生的结构变化。因此，该方法可提供一种评估筛选具有结构转换特性的适体能力的指标。

金纳米颗粒检测法的另一个优势在于其能够放大信号，使得通常对小分子具有微摩尔亲和力的适配体，能够在远低于解离常数数个数量级的水平下被检测到。以下筛选方案用于分离特异性结合皮质醇的适配体。通过透析和富集监测，证明在后续筛选步骤后目标分子的洗脱量有所增加。

在最终步骤中，当使用较少的目标分子和较长的捕获探针时，观察到洗脱量减少。通过下一代测序技术对经过多轮筛选后洗脱的DNA进行分析。在第六轮筛选后早期，仅有较低比例的序列拷贝数增加，经过13轮筛选后，这些序列被划分为20个区间。

更大比例的抗体处于高拷贝数。随后通过提高筛选过程的严格性，在第14轮和第15轮中，近一半被筛选出的抗体位于拷贝数频率的第一等级。

在此阶段的 30,000 次运行中，大约有 3000 个独特的序列。将选定的适配体（AP）与金纳米颗粒孵育，随后加入目标物或用于比较的对照底物。该检测结果显示，该适配体对皮质醇的特异性高于胆酸，或在尝试此操作时表现出更高的特异性。

在每一轮筛选中控制筛选的严谨性以及优化PCR循环次数非常重要。观看本视频后，您应能够充分理解如何选择结构转换型适体（AP）并进行金纳米粒子检测实验。