Name: 适用于比色金纳米粒子检测方法的选择结构切换适配方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学习利用磁珠分离技术筛选结构切换适配体，用于皮质醇等小分子检测的比色金纳米粒子分析方法。该方法无需固定靶标，可提高检测灵敏度并应用于健康评估。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究是在作者（JAM）持有美国国家研究委员会研究协会奖期间，在美国空军研究实验室完成的。合著者 MW 获得了美国空军科学研究办公室资助的赖特学者奖学金。本工作得到了美国空军科学研究办公室、空军研究实验室和 Bio-X 战略技术推动力项目的支持。

1. 文库与引物的设计与合成
<ol>
	<li>设计初始文库和引物（该主题在先前的出版物中已有广泛综述）25,26。
	<ol>
		<li>使用标准的亚磷酰胺化学方法合成本研究所需的以下序列： 
		文库：GAATGGATCCACATCCATGG-N40-TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA 
		正向引物：GGAATGGATCCACATCCATGG 
		反向引物：Biotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA</li>
		<li>设计cDNA捕获探针，使其与文库的5´端区域互补。通过在线熔解温度分析软件确定初始长度，使熔解温度略高于室温，并随着每个后续碱基的增加而逐步提高熔解温度。 
		mer 捕获探针：CCATTCC-Biotin 
		mer 捕获探针：TCCATTCC-Biotin 
		mer 捕获探针：ATCCATTCC-Biotin</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过标准高效液相色谱法（HPLC）纯化文库。引物和捕获探针仅需进行脱盐处理即可。将寡核苷酸溶解于无核酸酶的水中，配制成所需浓度，于-20 °C保存，可稳定数月。</li>
</ol>
2. 缓冲液、文库和样品制备
<ol>
	<li>在500 ml的Millipore水或无核酸酶级水中配制缓冲液，其中含有50 mM Tris、137 mM NaCl和5 mM MgCl2，pH 7.4。将缓冲液通过无菌0.2 µm滤膜过滤；可在常温下保存数月。
	<ol>
		<li>或者使用其他缓冲液，例如 PBS（磷酸盐缓冲盐水）、HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸） 等等。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置两台恒温混匀仪；一台设定为 95 °C，另一台保持室温条件（本研究中约为 20 °C）。准备一个冰桶。</li>
	<li>通过将100 µl文库（约2.5 nmol，适用于10）置于加热/快速冷却条件下处理DNA文库15-1016 在95 °C的恒温混匀仪中孵育5分钟。在准备磁珠的同时（步骤3.1–3.6），将试管置于冰上。通过在λ = 260 nm处测定紫外吸收值，并结合文库适用的转换系数，确定DNA文库的实际浓度。</li>
	<li>根据目标物质的溶解性，选择合适的培养基配制目标储备溶液。
	<ol>
		<li>在DMSO中配制100 mM的分析物储备液。这些储备液在常温条件下可稳定保存约1个月，但不同目标物质的降解特性可能有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 磁珠的制备与初始筛选轮次
<ol>
	<li>涡旋6.7 × 108 个/mL链霉亲和素包被的磁珠，并移取400 µl至新的微量离心管中。将试管置于磁架上2分钟，吸除上清液。</li>
	<li>加入400 µl结合缓冲液，涡旋混匀，将试管置于磁架上分离磁珠后吸除上清液，以此洗涤磁珠。重复此步骤三次。</li>
	<li>通过将磁珠重悬于含50 µM（终浓度）捕获探针的400 µl结合缓冲液中，于常温条件下在温控混合仪上轻柔振荡孵育10分钟，使捕获探针固定于磁珠上。</li>
	<li>按照3.2节所述洗涤步骤，用400 µl结合缓冲液洗涤磁珠三次，以去除未结合的捕获探针。</li>
	<li>将磁珠重悬于400 µl结合缓冲液中。取出100 µl磁珠溶液用于后续步骤，剩余300 µl于4 °C保存，可用于最多三周内的进一步筛选循环。</li>
	<li>按照3.2节所述方法，用200 µl结合缓冲液洗涤磁珠两次。</li>
	<li>将2.3节中快速冷却的100 µl DNA加入洗涤后的磁珠中，于常温条件下在温控混合仪上轻柔振荡孵育30分钟。 
	注：前几轮筛选中DNA浓度高于后续轮次，以尽量减少在理论上含有更多独特序列的早期轮次中的序列丢失。</li>
	<li>使用2.3节所述的紫外吸收法测定上清液中的DNA含量，并从3.7节中加入的初始量中减去该值，以评估结合到磁珠上的DNA量。
	<ol>
		<li>用200 µl结合缓冲液洗涤磁珠，随后在常温条件下于温控混合仪上轻柔振荡5分钟，再用200 µl结合缓冲液进行两次额外洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将磁珠重悬于200 µl用结合缓冲液稀释的100 µM目标分子溶液中，在常温条件下于温控混合仪上旋转孵育30分钟。因观察到目标分子和对照分子随时间在水溶液中发生聚集，需在每次筛选当天开始前新鲜配制工作溶液。保留含有目标分子洗脱序列的上清液，用于进一步研究。</li>
	<li>在完成1-2轮筛选后进行阴性筛选：向3.8.1节制备的磁珠中加入200 µl浓度为1 µM的孕酮溶液，在常温条件下于温控混合仪上轻柔振荡30分钟。</li>
	<li>使用磁力架捕获磁珠，弃去上清液，并在加入皮质醇前按照3.9节方法用200 µl结合缓冲液洗涤磁珠两次。</li>
</ol>
4. 富集监测、PCR 和单链 DNA 生成
<ol>
	<li>将上清液加入透析盒中，以监测筛选富集情况。透析是必要的步骤，用于去除洗脱DNA中的皮质醇，因为皮质醇的浓度远高于DNA，且其紫外吸收峰与标准DNA的紫外吸收波长（λ）重叠。最大值 = 260 nm
	<ol>
		<li>每两轮执行一次此步骤（第2、4、6轮， &amp;在筛选的早期轮次中，这可以减少样品损失，因为此时每种序列的拷贝数可能较少（多样性最高）。为了更快地获得结果，也可采用其他方法，如尺寸排阻柱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含样品的透析盒在250 ml新鲜结合缓冲液中，于常温下透析2小时，重复两次。更换缓冲液后，于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>通过紫外光谱分析透析后的样品池，以确定目标物洗脱的DNA百分比（与第3.8节结果进行比较）。</li>
	<li>制备含1%（w/v）溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶。本实验中，使用1.5 g琼脂糖、50 ml TAE缓冲液（40 mM Tris乙酸盐，1 mM EDTA，pH = 8.0）和10 µl溴化乙锭配制凝胶。</li>
	<li>通过小规模PCR（5 × 50 µl等份）对透析后的样品池进行循环优化，使用约5–15个循环。PCR反应体系包含：1× PCR反应缓冲液（最终浓度），200 µM dNTPs，10%反应体积的DNA模板，每种引物500 nM，以及2.5 U聚合酶（2.5 U/µl原液）。
	<ol>
		<li>在95 °C下预变性2 min，随后进行循环扩增：95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1 min，共重复若干循环，最后在72 °C延伸10 min，然后于4 °C保存。</li>
		<li>使用25 bp标准DNA标记物进行比对，并在凝胶成像系统中观察。选择在正确大小位置产生最强条带且无非特异性副产物的扩增循环数。</li>
		<li>通过将每个PCR循环产物各取10 µl与2 µl 6x蓝/橙色上样染料混合，加载至第4.4步制备的3%琼脂糖凝胶中的5个独立加样孔内（125 V，45 min），分析循环优化结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用第4.5节中确定的反应条件和适当的循环次数进行大规模PCR。通常需要6–8 ml的PCR反应体系，以获得每轮筛选所需的1–2.5 nmol产物。使用8联管以简化大量PCR扩增所需管材的处理操作。</li>
	<li>按照第4.4节所述制备3%琼脂糖凝胶，并根据第4.5.2–4.5.3节的步骤验证PCR产物条带是否出现在正确位置。</li>
	<li>将第4.7节中获得的双链DNA产物通过以下步骤转化为单链DNA：
	<ol>
		<li>向已用滤片阻塞的小型层析柱中加入 300 µl 链霉亲和素包被的微珠（非磁性）。通过连接鲁尔锁式注射器并对柱塞施加轻柔压力，用 5 ml 结合缓冲液洗涤微珠。每次添加物料后，将注射器从层析柱上取下，并在离线状态下将柱塞从注射器中取出，以避免柱塞抽吸扰动微珠。</li>
		<li>将PCR产物加入柱中，并轻轻按压活塞使液体通过。使用多个柱子，确保每个柱子中加入的PCR产物不超过1-1.2 ml。弃去最后的穿流液，因为反义链上的生物素基团会将DNA保留在柱子上。</li>
		<li>用5 ml结合缓冲液洗涤层析柱。</li>
		<li>加入0.5 ml 0.2 M NaOH使DNA变性。保留洗脱液，其中含有单链正义DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无核酸酶水洗涤脱盐柱后，将0.5 ml的ssDNA加入0.2 M NaOH中进行脱盐。弃去最初的0.5 ml流出液，然后加入1 ml无核酸酶水，收集脱盐后的ssDNA样品。每0.5 ml样品需使用多个脱盐柱。
	<ol>
		<li>通过在 λ = 260 nm 处的紫外吸收测定洗脱 DNA 的浓度。</li>
		<li>真空干燥样品，并用适量的结合缓冲液重新溶解。如果获得的 DNA 量不足以进行下一轮筛选，则重复步骤 4.6–4.9.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 后续多轮筛选与测序
<ol>
	<li>根据富集监测结果（第4.1节）调整筛选条件的严格程度。通常，在后续的筛选轮次中逐步提高筛选条件的严格性，以从文库中筛选出亲和力最高的结合子。 
	注意：这可能包括提高DNA浓度、增加洗涤步骤的次数、时间或体积、降低靶标浓度、提高负筛选化合物的浓度，或采用其他多种方法27。
	<ol>
		<li>应适当设置对照，以确保所获得序列对靶分子具有特异性。在本研究中，从第3轮开始引入负筛选分子（黄体酮）至体系中（表1），并在后续筛选过程中逐步提高其浓度。从第11轮开始，在将DNA文库固定到磁珠前（即第3.7节之前），先将DNA文库与10–20 µM黄体酮预孵育30分钟。</li>
		<li>在观察到最大富集后，延长捕获探针的长度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行测序，通过使用兼容引物和高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，制备最终文库（第15轮）以及其他代表最大富集（第13轮）和最小富集（第6轮）状态的文库。
	<ol>
		<li>配制50 µl反应体系，终浓度为1x（反应缓冲液）、200 µM（每种dNTP）、400 nM（每种引物）、0.5 µl DNA文库和0.5 µl DNA聚合酶。根据第4.5节所述步骤，针对每一轮进行循环优化，PCR条件相同，但最终延伸步骤在72 °C维持7分钟。</li>
		<li>将制备好的50 µl文库样品装入微量离心管，用防粘连封口膜严密封闭管盖，再将离心管放入装有泡沫垫的15 ml锥形管中，使用冰袋低温过夜运输至测序机构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定每条序列的拷贝数，以评估测序文库的富集程度。
	<ol>
		<li>使用编程/排序步骤（参见补充代码文件），对测序机构提供的所有文库的FASTA格式高通量测序数据进行分析，计算各序列在数据中重复出现的频率或拷贝数：</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析拷贝数最高的序列的特异性和亲和力。所采用的分析方法取决于相互作用类型（蛋白质或小分子）、适配体结合后的结构特性以及预期的亲和力水平。该主题在多个参考文献中已有更详细的综述1,28-30。</li>
</ol>
6. AuNP 的合成与检测
<ol>
	<li>采用柠檬酸盐还原法合成金纳米颗粒（AuNPs）21。将98 ml的Millipore水与2 ml的50 mM HAuCl4混合，并加热至沸腾。</li>
	<li>一旦开始回流，立即加入10 ml的38.8 mM柠檬酸钠。数分钟后溶液颜色将变为红色。停止加热后继续搅拌20分钟。</li>
	<li>让AuNP溶液冷却至室温，然后通过0.2 µm聚酯膜过滤。所有AuNP悬浮液均应储存在避光的棕色瓶中。</li>
	<li>通过紫外吸收测定AuNP浓度，使用消光系数2.4 × 108 L mol-1 cm-131。本研究中AuNP浓度为10 nM，粒径为17 ± 0.6 nm，由动态光散射法测定21。</li>
	<li>在铝箔遮光条件下，将DNA与10 nM AuNP在常温下孵育1小时。调整AuNP体积以确保有足够的溶液完成所有预期测试（约1–2 ml）。本研究考察了73、120和200 D/NP（每个AuNP上的DNA分子数）三种负载密度，相应地调整体积和浓度。</li>
	<li>用HEPES缓冲液（20 mM HEPES，2 mM MgCl2，pH = 7.4）将DNA/AuNP溶液按1:1稀释。用铝箔覆盖后在室温下平衡混合物。 
	注意：此步骤所需时间需由研究人员优化。本研究中考察了从数分钟到过夜（O/N）的不同时间。</li>
	<li>用DMSO配制分析物（皮质醇、胆酸、2-甲氧基萘）的储备液，浓度为100 mM，并用铝箔包裹。每次实验前，用1/3浓度的皮质醇结合缓冲液（第2.1节）将储备液稀释至100 µM，制备新鲜的初始溶液。再用1/3结合缓冲液进一步稀释初始溶液，使加入的目标物体积恒定（10 µl），从而获得一系列不同浓度。</li>
	<li>通过向80 µl DNA/AuNP溶液中加入10 µl 1/3结合缓冲液（称为“空白”）来优化所需的盐浓度。
	<ol>
		<li>在室温下孵育20分钟后，加入不同体积的NaCl溶液。观察加入盐后颜色是否刚刚出现可察觉的蓝移（本研究中使用了13–40 µl的1 M NaCl）。此条件可作为良好起点，但后续可能需根据加入目标物的结果进一步调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将80 µl DNA/AuNP溶液与10 µl目标溶液混合，在室温下孵育20分钟。使用96孔板和多通道移液器同时分析多个目标浓度，每次均需包含空白对照（第6.8节）。
	<ol>
		<li>加入适量的NaCl溶液（本研究中使用13 µl的1 M NaCl），并立即使用酶标仪在650 nm和530 nm处测定吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将结果绘制成吸光度比值（E650/E530）相对于空白测量值归一化后的目标浓度曲线。</li>
</ol>

<ol><li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).</li>
<li>Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortisol+assays+and+diagnostic+laboratory+procedures+in+human+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids.</a> Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).</li>
<li>Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+among+plasma+cortisol%2C+catecholamines%2C+neuropeptide+Y%2C+and+human+performance+during+exposure+to+uncontrollable+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosom.+Med%22%5BJournal%5D)">Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress.</a> Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).</li>
<li>Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Biomarkers+of+Physical+Fatigue+as+Markers+of+Sleep+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Sleep+Med%22%5BJournal%5D)">Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation.</a> J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).</li>
<li>Kwak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+biomarkers+from+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chrom.+B%22%5BJournal%5D)">Volatile biomarkers from human melanoma cells.</a> J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).</li>
<li>Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Cortisol+in+Saliva+with+a+Flow-Filtered%2C+Portable+Surface+Plasmon+Resonance+Biosensor+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System.</a> Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).</li>
<li>Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+functionalized+interdigitated+%CE%BC-electrode+%28ID%CE%BCE%29+based+impedimetric+cortisol+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor.</a> Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).</li>
<li>Kapczinski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allostatic+load+in+bipolar+disorder%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+RNA+domain+that+binds+Zn2%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Selection of an RNA domain that binds Zn2.</a> RNA. 1 (5), 538-550 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Aptamers+Specific+for+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue.</a> PlosOne. 7, e37789(2012).</li>
<li>McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+biosensor+arrays+for+detection+and+quantification+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules.</a> Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free+electrochemical+biosensor+based+on+a+DNA+aptamer+against+codeine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine.</a> Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX%E2%80%94A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+An+Emerging+Class+of+Molecules+That+Rival+Antibodies+in+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics.</a> Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Morse, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+of+RNA+beacon+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct selection of RNA beacon aptamers.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).</li>
<li>Nutiu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Switching+Signaling+Aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Structure-Switching Signaling Aptamers.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).</li>
<li>Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+fluorescence+biosensor+for+multiplex+detection+using+unmodified+gold+nanoparticles+Chem%5BTitle%5D)+AND+%22Commun%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem.</a> Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li>
<li>Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer%E2%80%93gold+nanoparticle+conjugates%3A+effect+of+aptamer+length+on+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).</li>
<li>Hagen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+Zinc+Oxide+Field+Effect+Transistors+for+Selective+Sensing+of+Riboflavin+with+Current+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation.</a> Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).</li>
<li>Han, K., Liang, Z., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Strategies+for+Aptamer-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors.</a> Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li>
<li>Hall, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+and+Amplification+of+DNA+Pools+for+In+Vitro+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Nucleic+Acid+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection.</a> Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
<li>Djordjevic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+experiments%3A+New+prospects%2C+applications+and+data+analysis+in+inferring+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways.</a> Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).</li>
<li>Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small Molecules.</a> Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).</li>
<li>Jing, M., Boswer, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Methods+for+Measuring+Aptamer-Protein+Equilibria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).</li>
<li>Sachs, E. -F., Diederichsen, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSachs%2C+E-F+%22Binding+of+Triostin+Analogues+to+DNA%22">Binding of Triostin Analogues to DNA</a>. , AN NT008. (2011).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aptamer-linked+gold+nanoparticle+purple+aggregates+for+colorimetric+sensing+of+analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes.</a> Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+Aptamer+Antidote+to+the+Anticoagulant+Drug+Bivalirudin%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin.</a> Plos One. 8 (3), e57341(2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+SELEX+Process+with+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing.</a> Plos One. 6 (12), e29604(2011).</li>
<li>Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclic+identification+of+aptamers+for+human+alpha-thrombin+using+over-represented+libraries+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing.</a> Plos One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li>
<li>Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Responses+to+Psychological+Stress+in+Men+Preparing+for+Skydiving%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).</li>
<li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Multiplexed+Proteomic+Technology+for+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery.</a> Plos One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+Addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).</li>
<li>Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+metabolites+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.-Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progesterone metabolites in breast cancer.</a> Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).</li>
</ol>

分发声明 A：&#160;已批准公开发布，分发不受限制（88 ABW-2014-4103）。&#160;作者声明不存在任何竞争性财务利益。&#160;

小分子具有重要的生物学意义，但在目前已报道的适体中仅占19%，这一事实凸显了开发适用于小分子适体筛选方法的重要性。相较于蛋白质，小分子可用于与核酸序列相互作用的功能基团、结构基序及表面积较少，因此其SELEX筛选尤为困难。1，据估计，入选的样本中少于30% 全部 已尝试的靶标最终获得了适体38因此，为了成功筛选出针对小分子靶标的适体，必须格外注意实验设计与操作的各个环节。
本研究中描述的适配体筛选方法具有优势，因为它适用于小分子，且无需进行任何可能改变其结合特性的化学修饰。该方法还基于洗脱原理，即DNA最初结合到磁珠上，随后被目标分子从磁珠上洗脱下来，因此与DNA结合但与磁珠基质相互作用的序列不会在下一轮筛选中被扩增，因为针对目标分子的结合序列会被释放到上清缓冲液中，而非特异性结合基质的DNA则仍保留在磁珠上。相反，对于每轮都需要将目标分子固定在固相载体上的方法，则必须采用针对基质的负筛选策略，否则与基质相互作用的DNA序列将与目标结合子一同被扩增1。当前方法设计为一种基于熔解温度（Tm）限制的筛选策略。这意味着cDNA与文库DNA杂交的Tm保持接近室温（RT）。Morse曾使用类似策略，但采用了一个Tm &#60; 10 °C的6碱基cDNA探针，并在4 °C条件下进行筛选17。我们的应用旨在室温下进行生物传感检测，因此相应调整了cDNA的长度。这使得筛选的严谨性保持在足够低的水平，从而避免因目标分子的结合位点位于远离杂交区域的位置、不足以引发导致cDNA解离的构象变化时，造成潜在结合序列的丢失。然而，该方法的分离效率较低，因为部分序列可能仅因热力学原因而发生去杂交。相比之下，Nutiu et al. 使用了15碱基的cDNA，结果仅从四个目标分子中成功鉴定出两个的适配体，可能原因是15碱基cDNA的Tm过高，无法被小分子目标有效释放18。因此，尽管当前筛选策略需要较多轮次以去除背景序列，但通过控制筛选严谨性并最大限度减少潜在结合子的丢失，可提高最终筛选成功的可能性。
许多初次进行适配体筛选的研究人员并未意识到与潜在结合子PCR相关的一些重要事项。循环次数优化（第4.5节）是必要的，因为在高循环数下对DNA文库进行过度扩增会产生不需要的副产物（通常分子量更大），而仅多出5个循环就可能导致目标产物完全消失39。一旦发生过度扩增，PCR产物将不再代表由靶标洗脱出的序列，从而显著降低筛选成功的可能性。图4展示了本研究中第5轮循环优化的一个示例：最少循环数产生的条带信号最弱，随着循环数增加至8次，条带信号逐渐增强；在10个循环时，条带开始向更高分子量的过度扩增产物转变；至12个循环时，产物几乎完全由过度扩增的副产物组成。另一个缺乏SELEX经验的研究人员可能忽略的细节是，在第一轮大规模PCR扩增（第4.6节）中必须对整个文库进行扩增，以避免结合子的丢失。寡核苷酸可能产生的唯一序列数量为4N，其中4代表四种核酸碱基，N代表文库随机区域的碱基数。在本研究中，N = 40，因此可能的唯一序列空间为1.2 × 1024。第一轮筛选所用的2.5 nmol文库相当于约1015个分子，这意味着初始文库中每个DNA拷贝很可能代表一个独特的序列。因此，必须对靶标从磁珠上洗脱出的全部体积的DNA进行扩增，以确保每种潜在结合子在下一轮筛选中均有保留。一旦完成这一初始扩增，在后续轮次中将有多个拷贝可用于筛选，此时可假设取样时溶液处于均一状态。
每轮筛选中还应仔细考虑靶标浓度。Nutiu et al. 在整个筛选过程中使用了 1 mM 的靶标浓度，并筛选出解离常数 Kd = 600 µM 的 ATP 适体18。本研究与 Morse17 的研究均起始于 100 µM 的靶标浓度，并在筛选过程中逐步降低浓度，最终获得具有低微摩尔亲和力的适体。增加筛选严格性（即降低靶标浓度）的具体轮次，取决于观察到富集效果的时间。另一个关键步骤是实施适当的反向筛选，以确保适体对靶分子具有特异性。所采用的对照类型取决于所筛选适体的预期应用。例如，适体 15-1 被设计用于皮质醇生物传感检测中的识别元件，因此使用孕酮作为反向筛选分子，因为孕酮是存在于生理体液中的皮质醇代谢前体40。而 Nutiu et al. 筛选的 ATP 适体未包含反向筛选步骤，会与结构相似的分子（包括 ADP、AMP、腺苷和 dATP）发生相互作用18。
最后需要考虑的一点是，金纳米粒子（AuNP）检测通常需要针对每种适配体/靶标组合进行大量优化。寻找在加入盐后仅引起肉眼勉强可察觉的向蓝色变化的盐体积是一个良好的起点，但可能需要调整该起始点以观察到响应信号。我们还发现，检测结果会因缓冲液浓度（筛选缓冲液可能需要稀释，因为高盐浓度常导致聚集）、缓冲液组成、DNA覆盖程度（图3）、样品制备（用于溶解靶标的某些有机溶剂可能产生高背景信号，从而掩盖靶标响应）、温度、盐的种类与浓度以及孵育时间（包括DNA与AuNP的孵育，以及DNA/AuNP与靶标的孵育）而产生显著差异。在完全优化的条件下，通常在靶标孵育时间&#60;5分钟内即可观察到结果，这体现了AuNP生物传感平台快速响应靶标的优势。例如，在图5中，适配体/AuNP步骤的孵育时间从过夜（O/N）（图3）缩短至30分钟，并且在加入靶标后立即（&#60;10秒）添加盐，而不是20分钟后（图3），同时保持73 D/NP的负载密度。在10 µM靶标浓度下，该调整使皮质醇的响应比空白值提高了约82%（图5A），而此前条件下的响应仅提高约40%（图3）。这一响应差异可通过肉眼分辨（图5B）。需要注意的是，皮质醇检测的线性范围与此前条件下的结果不同，表明这些条件可进一步优化以适应特定的检测范围需求。胆酸和2-甲氧基萘（2MNP）对照未产生显著响应（图5A-B）。研究人员必须意识到，缩短这些孵育时间可能会促进分析物与AuNP表面的相互作用增强，从而导致总体信号增强（靶标）或背景升高（非靶标分子）。因此，针对每种适配体/靶标组合，必须谨慎设计AuNP检测方案并进行性能表征。
本实验流程描述了一种用于筛选在生物传感平台（如文中所述的 AuNP 检测法）中发挥作用的小分子结构转换型适配体的方案，此类平台需依赖 DNA 的构象变化来检测目标物的存在。然而，该方法也可应用于其他基于相同原理的生物传感器系统，例如电化学或荧光检测系统，可用于几乎任意尺寸的目标物检测。该方案的效能可通过多种实验手段进一步优化提升。首先，可通过探索优化方法来改进筛选过程本身，例如确定 cDNA/文库杂交的最佳 Tm 值，使其既能与小分子目标物发生足够弱的相互作用以促进结合，又足够强以减少仅因热力学因素而解离的背景序列，从而降低筛选所需的循环次数，节省人力时间并减少试剂消耗。进一步的研究还可探索对筛选条件的改进，以确定磁珠与 DNA 的最佳浓度，确保在初始筛选轮次中使尽可能多样化的序列群体暴露于目标物。这些原理验证实验的成功为后续投入更多资源以优化和调整 AuNP 缓冲液检测法用于生理流体奠定了基础。目前迫切需要一种快速、稳健的生物传感平台，可作为评估个体生理状态的诊断工具，而将 AuNP 检测法进一步开发应用于人血清、汗液或唾液中，将有助于填补当前的技术空白。

小分子长期以来被认为在多种生物过程中发挥着关键作用，例如生理毒性或营养、细胞信号传导，以及作为治疗疾病的药物1。已有研究提出，多种小分子可作为指示生理状态（包括应激2,3、疲劳4和疾病5）的生物标志物。例如，皮质醇水平升高与应激相关，可能导致生理机能下降及其他健康问题6-8。同样，唾液中某些肽类比例的变化可预测疲劳状态，其生理表现包括注意力缺乏、反应时间延长和认知功能降低4。因此，开发针对特定目标的小分子生物传感器，可能为评估个体的健康状况和机能表现提供一种极为宝贵的量化指标。
传统上，小分子检测依赖于劳动密集型的分离技术或基于抗体的识别方法6,7。近年来，核酸适配体9,10作为识别元件逐渐兴起，在特定应用中展现出相较于抗体的独特优势。由于适配体能够结合从金属离子11到组织12等多种尺寸的目标物，它们已被广泛用作生物传感平台中的识别元件13,14。与抗体相比，适配体可通过化学合成制备，因此易于引入可重复的化学修饰，用于表面固定或信号报告。通过调整筛选条件，可在所需条件下筛选出对目标物具有高特异性的适配体，而抗体的使用则受限于生理条件15,16。此外，由于适配体分子尺寸更小，可实现更高的配体密度，从而在生物传感器平台上产生更强的目标信号响应；同时，适配体具有更高的稳定性，可实现重复使用和长期储存16。
适配体通过一种称为指数富集配体系统进化（SELEX）的技术生成，该过程从包含1013-1015个不同分子的初始序列文库开始，经过多轮筛选进化为一个富集的终末文库，其中包含若干（101-102）能够结合靶标分子的序列。随后对富集后的文库进行测序，并通过结合实验测定其中拷贝数最高的序列与靶标分子之间的解离常数（Kd）。文库向最终富集群体的进化过程可通过监测每轮筛选中与靶标结合的序列所占百分比进行追踪，直至达到最大富集程度。该过程需经历多轮进化，在每轮中将能够结合靶标的序列与非结合序列分离，并通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增。能否高效地分离并保留结合序列是决定筛选效率的关键因素之一，直接影响所获得适配体的特性15。对于小分子而言，SELEX中的分离步骤更具挑战性，因为小分子缺乏蛋白质靶标所具有的尺寸优势和多样的功能基团，而这些特性有助于蛋白质靶标的分离过程1,15。例如，许多针对蛋白质的分离平台依赖于基于分子大小或电荷的分离方法，但DNA-小分子靶标复合物的理化性质通常与非结合序列相比并无显著差异，导致分离效果不佳1。其他SELEX分离方法可能涉及将靶标固定化或标记，但这可能会改变小分子的结合特性。因此，针对小分子靶标设计适配体筛选方案时需特别考虑上述因素。
为了提高原始SELEX方法的分离效率、增强最终文库中序列的亲和力或特异性，或使其更适用于不同应用场景，已开发出多种SELEX技术的改进方法15,16。其中一种改进方法可用于筛选小分子，其设计目的是获得结构转换型适配体，即在与目标分子相互作用时发生构象变化的适配体17,18。该方法的一个实例是：将文库与固定在磁珠上的短片段非结合性互补DNA（cDNA）杂交17。当目标分子结合后，结合序列发生构象改变，从而从cDNA上解离，释放到上清液中；而未结合的序列仍保持与cDNA/磁珠的杂交状态，可通过磁性分离被去除。该方法对小分子具有优势，因其无需对目标分子进行固定化或标记即可实现分离。
具有结构转换能力的适配体（aptamer）对于任何需要通过适配体结构变化来检测目标分子存在的潜在生物传感器平台而言，具备一项重要特性。具体而言，适配体可与金纳米颗粒（AuNPs）结合，构建基于结构转换原理的检测方法，在加入盐溶液后，当目标分子存在时产生比色响应19,20。在AuNP检测中，单链DNA（ssDNA）适配体最初吸附在AuNP表面，并保护其免受盐溶液的聚集作用。当目标分子存在时，会诱导适配体发生构象变化，暴露AuNP表面，从而在加入盐后出现由红到蓝的颜色变化。研究表明，AuNP检测还具有信号放大效应，即使适配体对目标分子的亲和力处于微摩尔级别，仍可检测到远低于其解离常数（Kd）数个数量级浓度的目标分子21。这一特性对于小分子目标尤其具有吸引力，因为小分子与适配体的结合亲和力通常处于低微摩尔至毫摩尔浓度范围1,15。总体而言，该检测方法操作快速且相对简便，推动了适配体-AuNP检测体系作为生物传感检测平台的进一步研究。
本研究的目标是提供一种通用的筛选策略，用于选择针对小分子的结构转换型适配体，以应用于生物传感，并以压力标志物皮质醇作为代表性分子。由于操作简便且具有比色读出特性，基于金纳米颗粒（AuNP）的生物传感器检测方案备受关注；但结构转换型适配体同样适用于其他传感平台的输出方式，例如电化学22或荧光23检测，这些方法也通过适配体在结合靶标后发生构象变化来实现检测。与以往方法相比，本方案在设计中引入了多个负筛选步骤17,18，并实施了一种基于紫外光的简单富集检测策略（图1）。该方法不同于传统方法中使用的放射性配体富集检测方案17。所提出的方法还增加了在筛选过程中使用的cDNA捕获探针的长度，以提高分离效率，并在观察到最大富集后有效调节筛选的严格性24。经过优化的严格性导致最终文库中由靶标洗脱的DNA总比例降低，但却获得了一个相较于前几轮中拷贝数最高的序列具有更高亲和力的序列，且其拷贝数更高。最终文库中拷贝数最高的序列被应用于AuNP检测体系，以证明该序列适用于依赖结构变化来指示靶标结合的检测平台。该基于缓冲液的检测实验表明，通过调节固定在AuNP表面的DNA密度，可以调控AuNP检测体系的响应性能，为后续研究在生理液体中开发基于小分子适配体的AuNP生物传感器提供了原理性验证。

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M280 链霉亲和素</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td>与 DynaMag-2 磁力架兼容</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁铁</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>与 Dynabeads M280 链霉亲和素兼容</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Sepharose 高性能柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>这是一种用于单链DNA制备的高密度链霉亲和素产品</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td>&amp;ge;98%</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td>&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>胆酸</td><td>Sigma</td><td>C1129</td><td>&amp;ge;98%</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>由 ND-2000 型号替代</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td>&amp;ge;98%</td></tr><tr><td>500 ml 过滤系统</td><td>康宁</td><td>430769</td><td>0.22 &amp;micro;m 醋酸纤维素膜</td></tr><tr><td>DNA文库</td><td>操纵子</td><td>自定义</td><td>HPLC 纯化</td></tr><tr><td>所有其他DNA</td><td>IDT</td><td>自定义</td><td>捕获探针和引物 &amp;#8212; 脱盐；适配体 &amp;#8212; 高效液相色谱</td></tr><tr><td>恒温混匀仪&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>R</td><td>任何模型&amp;nbsp; 温度和混匀速度控制将正常工作</td></tr><tr><td>PfuUltra II 融合热启动 DNA 聚合酶，400 次反应</td><td>安捷伦</td><td>600674</td><td>Taq 聚合酶也可使用</td></tr><tr><td>脱氧核苷酸混合物，PCR级&amp;nbsp;</td><td>安捷伦</td><td>200415</td><td>其他品牌在此也可使用</td></tr><tr><td>10x 克隆Pfu DNA聚合酶缓冲液</td><td>安捷伦</td><td>200532</td><td>该缓冲液针对PfuUltra II聚合酶进行了优化</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR 系统</td><td>应用生物系统公司</td><td>9700</td><td>任何允许研究人员打开盖子以进行循环优化的仪器均可使用</td></tr><tr><td>琼脂糖-LE</td><td>Ambion</td><td>AM9040</td><td>&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma</td><td>E-1510</td><td>急性毒性，吸入；疑似致癌物</td></tr><tr><td>空合成柱，1 &amp;micro;m Expedite 风格</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>该模型因采用鲁尔锁扣接头以连接注射器而非常理想</td></tr><tr><td>更换滤器加快速度</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>1 &amp;micro;m 大小</td></tr><tr><td>Illustra NAP-25 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0852-01</td><td>任何品牌的DNA级凝胶过滤层析柱均可使用</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>66205</td><td>使用 2k 截留分子量</td></tr><tr><td>三水合氯化金(III)</td><td>Sigma</td><td>254169</td><td>99.999% 纯度至关重要</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>SAFC</td><td>W302600</td><td>我们发现，不同生产商提供的化合物对金纳米颗粒（AuNP）检测结果有显著影响</td></tr><tr><td>SpectraMax&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td>结果与 Bio-TEK 系统相似</td></tr><tr><td>协同作用</td><td>Bio-TEK</td><td>HT</td><td>结果与 Molecular Devices 系统相似</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Amresco</td><td>J848</td><td>任何生产灭菌产品的品牌均可使用</td></tr><tr><td>250 ml 滤器系统</td><td>康宁</td><td>430767</td><td>0.22 &amp;micro;m 醋酸纤维素膜</td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>Varian</td><td>Cary 300&amp;nbsp;</td><td>其他品牌在此也可使用</td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309646</td><td>该模型因采用鲁尔锁扣接头以连接Expedite柱，故十分理想</td></tr><tr><td>ThermoEC Minicell Primo</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EC320</td><td>与电源适配器兼容</td></tr><tr><td>电源</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB300</td><td>兼容 ThermoEC Minicell Primo</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>易燃液体</td></tr><tr><td>2-甲氧基萘</td><td>Sigma</td><td>148245</td><td>99%</td></tr><tr><td>检测板</td><td>康宁</td><td>3370</td><td>96孔平底，无菌</td></tr></tbody></table>

一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

小分子因其作为人体健康与机能多个方面生物标志物的生理意义，为生物传感应用提供了丰富的检测靶标。核酸适配体 increasingly 被用作生物传感器平台上的识别元件，但针对小分子靶标的适配体筛选需要特殊的设计考量。本文描述了一种用于筛选针对小分子靶标的构象转换型适配体的方法的改进及其关键步骤。该方法通过磁珠上互补DNA捕获探针杂交的DNA文库中的结合序列，在靶标诱导的构象变化下，与非结合序列实现分离。此方法的优势在于，与固相基质（磁珠）结合的序列不会被进一步扩增，且无需对靶分子进行固定化。然而，捕获探针与文库的熔解温度保持在室温或略高于室温，因此基于热力学而发生去杂交的序列也会存在于上清液中。这实际上限制了分离效率（即区分靶标结合序列与非结合序列的能力），因此需要进行多轮筛选以去除背景序列。本研究所报道的方法与以往的构象转换型适配体筛选方法不同之处在于引入了负筛选步骤、简化了富集过程的监测，并在富集筛选后延长了捕获探针的长度，以提高筛选的严谨性。所获得的构象转换型适配体在基于金纳米粒子的检测平台中具有优势，该平台通过适配体的构象变化来报告靶分子的存在。采用金纳米粒子检测法是因为其能够提供一种简单、快速的比色信号读出方式，适用于临床或现场检测环境。本文还提出了该检测方法的设计与优化考虑因素，作为在缓冲液中进行的原理验证工作，为后续将该技术拓展至生理液体中的小分子生物传感奠定了基础。

在最初几轮筛选中，条件的严谨性保持在较低水平，以保留拷贝数较少的结合分子。特别是第一轮采用了最低的严谨性，以保护通常以唯一序列形式存在的结合分子，这通过高浓度的皮质醇和DNA以及缺乏阴性筛选步骤得以体现。该适配体筛选的成功体现在筛选池中被目标物洗脱的DNA比例从较低水平（第二轮）逐渐升高，并在第12至13轮保持相对稳定（表1）。目标物洗脱的DNA比例达到平台期通常被视为筛选（“富集”）的终点。然而，本方法在富集后进一步提高了筛选的严谨性，方法是延长cDNA捕获探针的长度（图1）。延长该探针可增强cDNA与筛选池之间的杂交强度，提高复合物的熔解温度（Tm），从而要求目标物与序列之间具有更强的相互作用，才能将结合序列释放到溶液中。在第一轮筛选中，由于文库5´端少一个G碱基，cDNA的相互作用较弱。这与第一轮通常较低的严谨性条件一致，预期不会对筛选产生显著影响，仅允许更多潜在的结合分子以及背景序列（基于热力学去杂交）进入下一轮筛选。随着筛选向富集阶段推进，后续各轮通过提高严谨性条件，逐步减少了这些背景序列。当在第14轮将cDNA从7聚体延长至8聚体时，目标物洗脱的DNA比例从15.3%下降至11.1%，同时Tm从19.2 °C升至26.7 °C。在第15轮中，cDNA进一步延长至9聚体，Tm达到31.3 °C，总洗脱量降至3.3%。
为了追踪每一轮中样品池的富集进展，可通过测序多个富集与非富集的样品池来获得更深入的信息。下一代测序技术（NGS）已成为筛选过程中一种强大的测序方法，主要原因是与桑格测序相比，NGS可获得更高的序列读数（报告的序列总数）。更高的序列读数意味着对样品池中总序列数具有更全面的覆盖，从而更完整地反映序列的多样性。NGS还可消除克隆偏差32，并通过添加条形码实现单次运行中对多个样品池的并行测序24,33。在本项样本筛选中，采用NGS分析了三个独立样品池的富集进程（图2）。选择第6轮（与第2轮相比洗脱率略有富集）、第13轮（富集程度最高）和第15轮（筛选严格性最高）的样品池作为筛选过程的代表性节点。将每个独特序列的拷贝数表示为各池总序列读数的百分比进行作图。在第6轮中，排名最高的序列（拷贝数最多）仅占所有序列的0.1%（共33,435条序列，其中独特序列22,463条）。随着样品池在第13轮达到最大富集，排名最高的序列占比上升至整个池的15.4%（共17,681条序列，其中独特序列2,987条），尽管紫外吸收监测显示其富集程度仅比第6轮高出约5倍，但该序列的相对丰度却高出约150倍。在第15轮（共28,919条序列读数，其中独特序列2,980条），单一条目中排名最高的序列占比跃升至44.9%，尽管紫外吸收监测显示目标物洗脱量比第13轮低约5倍（表1）。随着样品池从大量序列逐步演化为少数几个可能具有靶标结合能力的序列，独特序列所占比例也显著下降（从第6轮的67%降至第15轮的10%），进一步证明了富集效果。此外，在第13轮中排名最高的序列（15-3）在cDNA长度延长后的第15轮中变为拷贝数第三高的序列，而第13轮中排名第二的序列则成为第15轮中拷贝数最高的序列（15-1）：
15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT 
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT 
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
先前的研究通过微量热泳法和平衡透析法检测了这两个序列的结合情况24结果显示序列15-1具有显著的皮质醇结合能力（Kd = 6.9 ± 2.8 µM 通过平衡透析法；16.1 ± 0.6 µM 通过微尺度热泳法检测，皮质醇与序列15-3之间的结合极弱。这表明第15轮中捕获探针长度的增加有助于提高筛选严谨性，从而分离出亲和力更高的结合序列。此外，两个序列均未表现出对阴性筛选分子孕酮的可观察结合，说明引入阴性筛选步骤对实验流程具有积极作用。
在提高筛选严格性条件的后续几轮筛选中，通过传统方法（即分析目标物洗脱的DNA百分比）确定经过最大程度富集后出现更高亲和力结合子，这一事实验证了在富集后延长cDNA捕获探针长度的方法。该结果表明，测序文库中的拷贝数与对目标物的亲和力之间的关联可能仅在特定条件下成立24,34，这与先前一项暗示两者存在直接相关性的报道形成对比35。同时，该结果也凸显了采用NGS监测富集程度的优势，而非仅依赖大多数筛选实验中常用的“洗脱百分比”策略，因为随着筛选轮次中严格性条件的逐步提高，洗脱百分比本身可能自然波动。然而，当多轮筛选中采用相似条件时，洗脱百分比仍可用于监测富集情况。例如，第6至第10轮均采用了相似的条件，富集程度未发生显著变化（表1）。当连续多轮观察到此类情况时，说明筛选条件可能过于严格，不利于进一步富集，研究人员应在下一轮降低筛选严格性。例如，在第11至第13轮中，皮质醇浓度从35 µM提高至100 µM，洗脱百分比从第10轮的2.5%上升至第12轮的14.5%。因此，在各轮条件相似的情况下，洗脱百分比可作为调整筛选过程中严格性的参考指标，并可与NGS数据相互补充，用于确定筛选的终点。
将序列15-1应用于AuNP检测，以确定通过结构转换型适配体筛选策略获得的序列是否能在依赖靶标结合后发生构象变化从而产生信号响应的检测体系中发挥作用。前期初步研究表明，含有15-1的AuNP检测体系可对压力生物标志物皮质醇产生响应，但对另外两种压力标志物——肾上腺素和去甲肾上腺素，以及在结构上与皮质醇相似的肝病标志物胆酸无响应24。该响应发生在人血清中游离皮质醇的正常浓度范围（~150–600 nM）内6，证实了在结合皮质醇后发生结构变化的适配体可在AuNP检测中产生可检测信号。在本研究中，通过调节15-1在AuNP表面的覆盖密度（密度），对该体系进行了进一步表征。在相同实验条件下，DNA的覆盖密度从73 D/NP（DNA分子数/金纳米颗粒）提高至120 D/NP和200 D/NP（图3）。胆酸仅在200 D/NP条件下于10 µM浓度时产生微弱响应，其余情况下响应极小。随着覆盖密度的增加，检测信号强度及检测限（LOD）均有所下降。73 D/NP、120 D/NP和200 D/NP条件下的LOD分别为29.5 nM、145.2 nM和27.3 µM。该结果与Smith 等的研究一致，后者表明当可卡因适配体在AuNP表面的覆盖密度从60 D/NP增至300 D/NP时，AuNP检测的响应信号随之降低36。这表明，可通过优化AuNP检测中DNA在表面的覆盖密度来调节目标物的检测范围。例如，在比较人血清中游离皮质醇浓度范围（~150–600 nM）与人唾液中浓度范围（~5–25 nM）时，这一特性可能具有重要意义6,37。尽管生理流体远比缓冲体系复杂，但本研究结果拓展了原理验证工作，表明AuNP检测条件可根据具体应用需求进行调整，且进一步开展将检测体系拓展至生物流体的研究将对生物传感器领域具有重要意义。
<img alt="DNA文库的磁分离过程；蛋白质纯化和PCR扩增示意图。" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 结构转换筛选方法的总体流程。 一种小型生物素化的cDNA捕获探针被固定在链霉亲和素包被的磁珠上。该cDNA与文库的5´区域互补，从而使文库杂交结合到磁珠上。当加入靶标分子后，会诱导发生构象变化，使结合序列从磁珠上释放，通过施加磁场实现分离。收集上清液，在将靶标分子从DNA中透析去除后，通过紫外吸收检测富集情况（被靶标洗脱的DNA百分比）。如果靶标分子在与DNA相同的紫外吸收范围内有吸收，则此步骤是必要的。随后对序列进行PCR扩增，并为下一轮筛选做准备。随着筛选进程的推进，会进行负向筛选，即丢弃被负向筛选分子洗脱的序列，而将可能结合靶标的磁珠与靶标分子共同孵育。在达到最大富集（洗脱百分比）后，延长cDNA探针的长度，以提高筛选的严谨性。本图经许可转载自24。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>轮次</td>
			<td>[皮质醇] (µM)</td>
			<td>[孕酮] (µM)</td>
			<td>结合DNA (pmol)</td>
			<td>被目标洗脱的百分比</td>
			<td>cDNA长度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>357.57</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>145.49</td>
			<td>1.4</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>50</td>
			<td>1</td>
			<td>188.74</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>50</td>
			<td>5</td>
			<td>336.4</td>
			<td>2.3</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>35</td>
			<td>5</td>
			<td>88.05</td>
			<td>N/A </td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>303.89</td>
			<td>3.1</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>255.01</td>
			<td>N/A </td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>236.81</td>
			<td>2.1</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>318.95</td>
			<td>2.6</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>297.18</td>
			<td>2.5</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>10</td>
			<td>147.61</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>100</td>
			<td>10</td>
			<td>154.36</td>
			<td>14.5</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>100</td>
			<td>10</td>
			<td>150.39</td>
			<td>15.3</td>
			<td>7-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>247.71</td>
			<td>11.1</td>
			<td>8-mer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>50</td>
			<td>40</td>
			<td>409.63</td>
			<td>3.3</td>
			<td>9-mer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 通过洗脱率（%）表示的筛选进程与富集情况24。 对于早期筛选轮次中未进行透析/紫外监测以避免低拷贝数序列丢失的情况，记录为N/A（不适用）。本表经许可转载自24。
<img alt="比较第6轮、第13轮和第15轮数据分布的饼状图；显示排名百分比。" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 通过下一代测序确定的筛选富集结果。 （A）第6轮；（B）第13轮；（C）第15轮。序列根据拷贝数进行排序。随着文库中皮质醇结合序列的富集，拷贝数最高的序列在总测序文库中所占比例从第6轮的较低水平（0.1%）上升至第15轮的较高水平（44.9%）。本图已获许可转载自24。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度比值图，显示 A650/530 与分析物浓度（µM）的关系，并带有误差线。" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 不同适配体 15-1 覆盖密度下 AuNP 检测的响应情况。 与 AuNPs 孵育的适配体密度从 73 D/NP（红色三角形）增加至 120 D/NP（绿色方块）和 200 D/NP（蓝色圆形）。皮质醇的响应以深色表示，胆酸的响应以浅色表示。在较低密度下，皮质醇的检测响应得到改善，从而降低了检测限（LOD）以及可检测目标物的浓度范围。其中皮质醇响应最高的条件（73 D/NP）进一步在线性范围内进行了表征，以在人血清（~150–500 nM）和唾液（5–25 nM）中报道的游离皮质醇正常范围6,37内提供更多数据点。相同 73 D/NP 条件下胆酸的最低响应已在先前研究中详细描述24。所有曲线图均表示两次或三次重复测量的平均值 ± 标准误（SEM）。
<img alt="电泳凝胶示意图，DNA分离，PCR循环比较，含75 bp和25 bp标记的DNA Ladder。" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. PCR循环数优化的代表性结果。 从左至右各加样孔分别为：4个循环、6个循环、8个循环、10个循环、12个循环、阴性对照（无DNA模板）、25 bp DNA Ladder标准品。在8个循环时观察到最佳条件，此时单一产物条带强度高，且未出现更高循环数下的过量扩增产物。
<img alt="A650/530 吸光度比值与分析物浓度的关系图，显示比色法检测结果。" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. AuNP 检测法孵育时间的优化。 AuNP/DNA 步骤在 73 D/NP 条件下的孵育时间从过夜（图 3）缩短至 30 分钟，并在目标物孵育后立即加入盐，而非等待 20 分钟后添加（图 3）。（A）可观察到皮质醇（蓝色菱形）产生响应信号，而胆酸（绿色圆形）或 2MNP（2-甲氧基萘；红色方形）则无响应。所有数据点代表重复两次或三次测量的平均值 ± 标准误。（B）从左至右：空白对照、10 µM 皮质醇、10 µM 胆酸、10 µM 2MNP。仅凭肉眼即可观察到皮质醇样品的颜色变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

提供了一种基于可调节严格度磁珠筛选方法的小分子靶标结构转换型适体选择方案。具有结构转换特性的适体有利于需要通过构象变化来指示靶标存在的检测方法，例如文中所述的金纳米粒子检测法。

小分子因其作为人体健康多方面生物标志物的生理意义，为生物传感应用提供了丰富的检测靶点……

以下实验的总体目标是生成结构转换型适体，以作为识别元件整合到检测平台上，该平台通过信号报告适体在结合靶标时构象发生变化。这一目标通过将生物素标记的捕获探针和互补DNA文库加入链霉亲和素包被的磁珠中，使DNA文库固定在磁珠表面来实现。随后，将磁铁置于溶液旁，利用磁珠分离保留在珠上的结合序列与未结合的非结合序列。随后对保留的序列进行纯化并扩增，以用于下一轮筛选。经过几轮筛选后，将负筛选步骤加入流程中。在多轮筛选后，所筛选出的适体在结合靶标时会基于金纳米粒子靶标检测法显示出结构变化。与基于溶液的细胞X等现有技术相比，该技术的优势在于无需将目标物固定在固相载体上。因此，该技术的应用意义在于对个体生理状态的风险评估，这主要是因为皮质醇是应激反应的指标，可由此进一步评估健康问题。本方案中，务必使用 freshly prepared DNA 溶液，特别是用于目标物和对照组的溶液。DNA 的制备需要特别注意。取 100 微升的 DNA 文库 aliquot 转移至 PCR 管中，放入恒温混匀仪，在 95 摄氏度加热 5 分钟。然后将 PCR 管转移至冰上，待后续使用前，需在分光光度计上测定该 DNA 的准确浓度。接下来，准备磁珠，涡旋振荡含有 strept 编码的磁珠，并将其中 400 µL 转移至新的微量离心管中。将该管置于磁力架上静置 2 分钟，吸除上清液，然后洗涤磁珠。加入 400 µL 结合缓冲液，涡旋振荡以完成洗涤步骤。使用磁铁分离磁珠并弃去上清液。重复此洗涤过程三次。接下来，将捕获探针固定在磁珠上。首先，用 400 微升结合缓冲液重悬磁珠，并加入 50 微摩尔的捕获探针。然后在室温下轻轻振荡孵育磁珠 10 分钟。为去除未结合的游离捕获探针，用 400 微升结合缓冲液按前述方法再洗涤磁珠三次。经过三次洗涤后，再加入 400 微升缓冲液，取其中 100 微升珠子溶液用于后续步骤，其余部分保存在 4 摄氏度。剩余的珠子溶液可在三周内用于后续多轮筛选。当需要更多珠子时，可通过使用更长的探针以提高该筛选方案的严谨性来制备珠子。例如，在第13轮之后使用更长的探针，此时已通过其他严谨性条件实现了显著富集。当使用从储存中取出的磁珠时，首先用结合缓冲液对工作等分试样进行两次洗涤，每次使用200 µL结合缓冲液。否则，新制备的磁珠已处于洁净状态。现在将100微升快速冷却的DNA加入磁珠中，在室温下轻轻振荡孵育30分钟。孵育结束后，分离磁珠，弃去上清液。测定DNA含量以计算结合到磁珠上的DNA量。接下来，用200 µL结合缓冲液将磁珠洗涤三次。每次加入结合缓冲液后，轻轻振荡5分钟，使缓冲液充分洗涤磁珠。然后在结合缓冲液中配制浓度为100 µM的目标分子溶液，并用200 µL该溶液重悬磁珠，即含有目标分子的溶液。在此情况下，皮质醇通常在第一轮筛选中高度富集。在常温条件下，将磁珠与靶标轻柔振荡孵育30分钟。孵育结束后，保留含有靶标结合序列的上清。每轮其他富集步骤之后，从最终的上清液中取样以监测过程。通过透析去除上清液中的皮质醇。如果目标分子在每轮之后不会干扰在260纳米处测定DNA吸光度，则可省略此步骤，使用阳性筛选步骤中收集的上清液作为模板，通过PCR扩增目标结合DNA。初步实验时，应始终先进行小规模的测试性PCR，以确定最佳扩增循环数。每个循环后取10微升样品，并与25个碱基对的DNA分子量标记进行比较。在此示例中，文库大小约为85个碱基对，而在第10个循环后已可见过量扩增产物，因此应使用更少的循环次数。该结果在不同轮次之间可能存在差异，因此每次都需要进行预实验。然后使用选定的循环次数，利用八排管进行大规模PCR扩增。扩增六到八毫升反应体系，以获得下一轮筛选所需的DNA扩增产物量，即1至2.5纳米摩尔的DNA。使用凝胶对部分 PCR 产物进行再次验证。然后利用非磁性链霉亲和素包被的磁珠将大部分产物转化为单链 DNA。将 300 微升磁珠加入由 Fritz 封阻的小型层析柱中。然后使用带锁扣的注射器，用五毫升结合缓冲液轻轻洗涤珠子。更换溶液以洗涤层析柱时，需将注射器从层析柱上取下，并将柱塞从注射器中取出。这样可以避免对珠子造成不必要的扰动。为每列1毫升PCR产物制备并洗涤足够数量的磁珠柱。使用轻微压力将PCR产物通过磁珠柱。DNA产物将通过其反义链与磁珠结合而被保留。然后用五毫升结合缓冲液洗涤结合了DNA的柱子，以去除所有PCR组分，仅保留结合池中的DNA。为使DNA从柱子上解离，加入0.5毫升0.2摩尔的氢氧化钠。随后使用以无核酸酶水制备的脱盐柱，对洗脱液中的单链DNA进行脱盐。弃去最初流出的0.5毫升穿流液。然后将1毫升无核酸酶水通过层析柱，以收集脱盐后的DNA。测定所收集DNA的吸光度，并将其准备用于下一轮筛选。如文本方案中所述，将收集到的单链DNA重新加入到用捕获探针制备的新鲜等分珠中。第二轮筛选与第一轮类似，但采用较低浓度的皮质醇。然而，从第三轮开始，在正向筛选之前加入负筛选步骤。对于第一轮负筛选，在结合缓冲液中加入200微升浓度为1微摩尔的孕酮至珠粒中。它在结构上与皮质醇相似但有所不同。在后续步骤中，于室温下轻轻摇动混合物半小时后，提高孕酮的浓度。弃去上清液，并用200 µL结合缓冲液将磁珠洗涤两次。然后进行阳性筛选。如前所述，随着筛选轮次的进行，底物浓度有所调整，以改变筛选过程的严格程度。具体细节在文本方案中有详细讨论。接下来，按照文本方案进行用于皮质醇检测的金纳米粒子分析。这种快速且简单的比色读数依赖于适配体在结合靶标后发生的结构变化，因此可提供一种评估该方法筛选具有结构转换特性的适配体能力的度量指标。金纳米颗粒检测法的另一个优势在于其能够放大信号，使得通常针对小分子的微摩尔亲和力适体可在远低于解离常数数个数量级的水平下被检测到。以下筛选方案用于分离特异性识别皮质醇的适体。通过透析和富集监测，证明在后续筛选步骤后目标分子的洗脱量有所增加。在最终步骤中，当使用较少的目标分子和较长的捕获探针时，观察到洗脱量减少。通过下一代测序技术对经过多轮筛选后洗脱的DNA进行分析。在第六轮筛选后早期，仅有较低比例的序列拷贝数增加，经过13轮筛选后，这些序列被划分为20个区间。更大比例的抗体片段具有高拷贝数。通过提高筛选过程的严格性，在第14轮和第15轮中，近一半被筛选出的抗体片段处于拷贝数频率的第一等级。在此阶段的 30,000 次运行中，大约有 3000 个独特的序列。将选定的 AP 与金纳米颗粒孵育，随后加入目标物或对照底物进行比较。该检测表明，AP 对皮质醇的特异性高于对胆酸或在尝试此操作时的其他物质。在每一轮筛选中控制筛选的严谨性以及优化 PCR 循环次数都非常重要。观看本视频后，您应该能够充分理解如何选择结构转换型适体（AP）并进行金纳米颗粒检测实验。

a-method-for-selecting-structure-switching-aptamers-applied-to

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

适用于比色金纳米粒子检测方法的选择结构切换适配方法

使用随机DNA文库进行无引物适配体筛选

在本视频中，我们介绍了一种基于拉曼光谱的直接免疫分析方法，用于检测特定的目标抗原。附着在拉曼探针表面的金纳米颗粒上的抗体可与目标抗原发生相互作用，产生特定的拉曼光谱，随后被检测到。...

一种基于拉曼光谱的直接免疫测定法检测特定抗原

本文介绍了一种基于负载药物蛋白模板原位合成超小荧光金纳米簇（Au...

一种快速定量的荧光法用于靶向蛋白质的小分子药物筛选

研究了用于现场检测小分子的适体-金纳米粒子比色法的设计与开发。此外，验证了一种基于智能设备的比色应用程序（app），并建立了该检测方法的长期储存条件，以满足现场使用需求。...

基于适配体-金纳米粒子比色法检测技术的设计与开发及其在野外现场的应用

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。...

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

本研究介绍了一种用于增强基于纳米探针生物传感信号的实验方案。该方案基于将氯金酸还原至现有纳米探针表面，这些纳米探针由金、银、二氧化硅或氧化铁纳米颗粒组成。...

快速纳米探针信号增强 原位 金纳米颗粒的合成

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本自我诊断的实用工具，已有效应用于毒素、...

用于小分子化合物快速定量检测的侧向流动免疫层析试纸条的开发

本实验方案描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，该技术利用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成方法，用于检测细胞中金属硫蛋白标签蛋白。...

细胞内直接合成电磁可见金纳米颗粒用于超微结构良好保存的蛋白质定位分析

本视频展示了如何利用秀丽隐杆线虫（C.

秀丽斑马鱼多巴胺能神经元变性检测法在帕金森病潜在致病基因验证中的应用

体外培养早期鸡胚的方法（新培养法）

学习利用磁珠分离技术筛选结构切换适配体，用于皮质醇等小分子检测的比色金纳米粒子分析方法。该方法无需固定靶标，可提高检测灵敏度并应用于健康评估。

一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

探索更多视频