适用于比色金纳米粒子检测方法的选择结构切换适配方法

以下实验的总体目标是生成结构转换 apti，以作为识别元件集成到检测平台上，这些元件通过在靶标结合时发出适配体确认变化的信号来发挥作用。这是通过向链球菌 tabin 包被的磁珠中添加生物素化捕获探针和互补 DNA 文库来实现的，以将 DNA 文库固定在磁珠表面。接下来，将磁铁施加到溶液中，以将结合序列与残留在磁珠上的非结合序列分开。

然后对保留的序列进行纯化和扩增，用于下一轮选择。经过几轮选择后，将在流程中添加一个负数选择步骤。经过几轮选择，所选的 aptr 在基于金纳米颗粒靶标检测测定的靶标结合后表现出结构变化。

与基于溶液的细胞 X 等现有技术相比，这种技术的真正优势在于，我们不必将目标固定在坚实的支撑物上。因此，这项技术的含义在于对个人生理状态的风险评估，这是因为皮质醇是压力的指标，这可能导致对健康问题的评估。对于此方案，请始终使用新鲜制备的 DNA 溶液，特别是对于靶标和对照。

DNA 的制备需要特别注意。将 100 μL 等分试样的 DNA 文库转移到热循环仪管中，并在热混合器中以 95 摄氏度加热 5 分钟。然后将试管转移到冰中，直到需要为止，然后再使用此 DNA 在分光光度计上确定其确切浓度。

接下来，准备磁珠，涡旋 strept 编码的磁珠，并将其中的 400 μL 转移到新的微量离心管中。将此试管放在磁力架上 2 分钟，去除上清液，然后清洗磁珠。加入 400 μL 结合缓冲液并涡旋以完成洗涤。

使用磁铁分离珠子并丢弃上清液。重复此洗涤过程 3 次。接下来，将捕获探针固定在磁珠上。

首先，用 Resus 悬浮磁珠和 400 μL 结合缓冲液，并使用 50 μmol 捕获探针。然后在室温下轻轻搅拌微珠孵育 10 分钟。要去除游离的捕获探针，请像以前一样再洗涤珠子 3 次，每次洗涤使用 400 μL 结合缓冲液。

洗涤 3 次后，再加入 400 微升缓冲液，并收集 100 微升微珠溶液用于其余步骤，同时将剩余部分保存在 4 摄氏度。剩余部分可用于后续轮次选拔，最长可达三周。当需要更多微珠时，可以使用更长的探针来制备它们，以提高此选择方案的严格性。

例如，在第 13 轮之后使用较长的探针，此时使用其他严格性已经实现了显著的富集。当使用从储存中取出的微珠时，首先洗涤工作等分试样两次，每次洗涤使用 200 μL 结合缓冲液。否则，新鲜制作的珠子已经很干净了。

现在向磁珠中加入 100 μL 速冻 DNA，在室温下轻轻搅拌孵育半小时。孵育后，在丢弃上清液之前分离珠子。计算 DNA 的浓度以确定与珠子结合的 DNA 量。

接下来，用 200 μL 结合缓冲液洗涤珠子 3 次。让结合缓冲液每次轻轻搅拌洗涤珠子 5 分钟。然后在 100 微摩尔的结合缓冲液中制备目标分子，并将珠子重悬于 200 微升该制剂（目标分子）中。

在这种情况下，皮质醇通常在第一轮选择中高度浓缩。将微珠与目标一起孵育半小时，并在环境条件下轻轻搅拌。孵育后，保存包含目标暗示序列的 snat。

每隔一轮富集后，从最终上清液中取样以监测过程。通过透析去除上清液中的皮质醇。如果靶分子在每轮后不干扰 260 纳米处的 DNA 吸光度测量，则可以跳过此作，使用从阳性选择步骤中收集的上清液作为模板，通过 PCR 扩增靶标结合 DNA。

初步地，始终运行小规模测试 PCR 以确定最佳扩增次数。每个循环后取 10 μL 样品，并将样品与 25 碱基对分子量标准进行比较。在这里，文库应在第 10 个循环后看到扩增产物上以 85 个碱基对运行，因此应使用更少的循环。

此结果可能因轮次而异，因此始终需要试运行。然后使用 8 个联排管使用选定的循环次数进行大规模 PCR。扩增 6 至 8 mL 反应混合物，以获得下一轮选择所需的扩增子量，即 1 至 2.5 纳摩尔 DNA。

使用凝胶仔细检查 PCR 产物样品。然后使用非磁性 strept 包被的磁珠将大部分产物转化为单链 DNA。将 300 μL 珠子加载到被 fritz 堵塞的小柱中。

然后使用诱饵锁注射器，用 5 毫升结合缓冲液轻轻洗涤珠子。更换溶液以清洗色谱柱时，请从色谱柱中取出注射器，然后从注射器中取出柱塞。这可以防止对珠子造成不必要的干扰。

创建并洗涤足够的微珠柱，每根柱可制备 1 mL PCR 产物。通过轻轻的压力将 PCR 产物通过色谱柱。DNA 产物将被其反义链连接的珠子保留。

然后用 5 mL 结合缓冲液洗涤 DNA 结合柱以去除所有 PCR 组分，只留下结合池 DNA 以从柱中脱杂 DNA，加入 0.5 mL 0.2 摩尔氢氧化钠。然后使用用不含核酸酶的水制备的脱盐柱对 eit 中的单链 DNA 进行脱盐。丢弃最初的 0.5 mL 流出物。

然后用 1 mL 无核酸酶的水通过色谱柱以收集脱盐的 DNA。测量收集的 DNA 的吸光度，并为下一轮选择做好准备。如文本方案中所述，现在将收集的单链 DNA 添加回用捕获探针制备的新鲜制备的珠子等分试样中。

第二轮选拔与第一轮相似，采用的皮质醇浓度较低。但是，从第三轮开始，在正选之前加入一个负选步骤。对于第一轮阴性选择，向磁珠中加入 200 μL 的 1 μmol 孕酮结合缓冲液。

它在结构上与皮质醇相似但不同。在随后的几轮中，在室温下轻轻摇动混合物半小时后增加黄体酮的浓度。丢弃脊髓突起物，并使用 200 μL 结合缓冲液洗涤珠子两次。

然后继续进行正选。如前所述，随着轮次的进行，基材的浓度会发生变化，从而影响筛选过程的严格性。详细信息在 text protocol 中讨论。

接下来，按照文本方案进行金纳米颗粒测定以检测皮质醇。这种快速直接的色度量读依赖于靶标结合时适配体的结构变化。因此，它提供了一个指标来评估该方法选择具有结构切换特性的 abers 的能力。

金纳米颗粒检测的另一个优点是它可以放大信号，从而可以在比解离常数低几个数量级的水平上检测到小分子共有的微摩尔亲和适配体。以下选择方案用于分离皮质醇特异性的 abers。透析和富集监测用于显示后续选择步骤后目标分子的洗脱增加。

当在最后步骤中使用较少的靶分子和较长的捕获探针时，观察到洗脱减少。使用下一代测序分析几轮不同轮次后逃避的 DNA。在第六轮选择后的早期，低比例的序列增加了拷贝数，13 轮后被排入 20 个区间。

高拷贝数的 abers 比例要大得多。然后通过使选择过程更加严格。在第 14 轮和第 15 轮中，近一半的所选 abers 处于拷贝数频率的第一级。

此时，在 30， 000 次运行中大约有 3000 个独特的序列。将选定的 AP 与金纳米颗粒一起孵育，然后添加靶标或用于比较对照底物。该测定表明 AP 对皮质醇的特异性高于结肠酸或 While 尝试该程序。

控制每轮选择的严格性以及优化 PCR 循环的数量非常重要。观看此视频后，您应该对如何选择结构切换 AP 并进行金纳米颗粒检测分析有很好的了解。