简单的聚丙烯酰胺为基础的多井刚度检测方法的刚度依赖的细胞反应的研究
March 25th, 2015
这里描述了一种能够快速、高效且廉价地制备多孔板形式的聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法不需要任何专用设备，任何研究实验室都可以轻松采用。它在专注于了解刚度依赖性细胞反应的研究中特别有用。
该程序的总体目标是能够快速、高效且廉价地制备多孔板形式的聚丙烯酰胺凝胶。这是通过首先夹在疏水涂层玻璃板和丙烯酰胺胶粘剂柔性塑料载体之间的凝胶前驱体溶液来实现的。第二步是将凝胶从玻璃板上剥离，玻璃板在聚合时共价连接到柔性塑料载体上并使其干燥。
接下来，将干燥凝胶和下面的柔性塑料支架切割成所需的形状，并将塑料面向下粘合到多孔板或任何其他细胞培养容器的孔底。最后一步是在多孔板组装的聚丙烯酰胺凝胶上涂上细胞粘合剂涂层，例如单层 1 型胶原蛋白。最终，显微镜以及其他细胞表征技术用于观察底层聚丙烯酰胺底物的效果。
特别是，它对细胞行为的刚度。与现有方法相比，该方法的主要优点是可以以低成本和省时的方式处理任何刚度和厚度的聚合物凝胶，并以多孔板形式组装它们，这是其他方法无法提供的。演示该程序将作为我的实验室的学生完成。
首先，通过将丙烯酰胺、交联剂双丙烯酰胺和去离子水混合制备聚丙烯酰胺凝胶前体溶液，以 50 毫克/毫升的浓度将 Sul OPA 溶解在二甲基砜中。将 20 μL 储备液分装到 10 个微量离心管中。然后闪蒸，将溶液在液氮中冷冻，并在零下 80 摄氏度下储存。
接下来，将每硫酸根离子的铵溶解在去离子水中，使每硫酸根离子铵的最终浓度为 10%（按体积计）重量。Eloqua 将每个硫酸盐溶液中 25 微升铵放入 10 个微量离心管中，并在负 20 摄氏度下储存。通过在 pH 值为 7.4 的 XPBS 中稀释 1 型胶原蛋白储备溶液，制备每毫升 0.2 毫克的胶原蛋白溶液。
所有溶液均保存在冰上直至使用。此时，将几滴疏水溶液滴在玻璃板上，并使用薄纸涂抹在表面上。让板风干后，再次用薄纸擦拭以均匀疏水涂层。
切割一个柔性塑料支撑，以匹配疏水涂层玻璃板的尺寸。然后用手术刀等锋利的工具轻轻刮擦表面，标记柔性塑料支架的疏水面。对于凝胶制备，将 4972.5 μL 所需最终浓度的聚丙烯酰胺前体溶液添加到 50 mL 锥形管中。
将试管放入脱气室中，打开盖子 30 分钟。在此之后，将 25 微升先前制备的每硫酸盐铵溶液加入 DGA 凝胶溶液中，以达到 0.05% 的最终每硫酸盐铵浓度，然后加入 2.5 微升 TM me 以达到 0.5% 的最终 TM ME 浓度通过上下吹打 3 至 5 次轻轻混合溶液。接下来，将所需厚度的硅胶垫片放在柔性塑料支架的亲水侧。
然后将凝胶溶液移液到垫片之间的柔性塑料支架上，并用疏水涂层载玻片灯夹住。让凝胶聚合 45 分钟后，撕下柔性塑料载体，顶部共价连接的聚丙烯酰胺凝胶，将凝胶面朝上自然干燥。干燥后，将聚丙烯酰胺凝胶切成所需的形状。
根据制造商的说明，每 96 孔板准备大约 500 微升聚甲基索烷，以将凝胶粘合到多孔板的底部。使用镊子将一小滴聚甲基索烷放在每个孔的中心。将一块聚丙烯酰胺凝胶放入每个孔中柔性塑料支撑面朝下。
固化聚二甲基 suboxane 后，用移液管将少量先前制备的纤维素 sampa 放入每个孔中，并左右旋转以均匀涂覆凝胶表面。将孔板置于高强度紫外灯下 5 分钟。完成后，用 PBS 冲洗凝胶以去除多余的玻璃纤维。
按照该移液管，将大约 50 微升先前制备的 1 型胶原蛋白溶液加入每个溶液中。用 PBS 冲洗后，将板盖在室温下至少两小时，以去除多余的胶原蛋白溶液。在组织培养罩中在紫外光下对凝胶消毒 2 小时。
最后，将凝胶浸泡在完全培养基中过夜，以水合和平衡。立即使用凝胶进行细胞固定，或在冰箱中存放长达两天杨氏模量作为几种丙烯酰胺和双的函数。此处分别指定为 A 和 B 的丙烯酰胺浓度与预期相同。
储能模量 G 素数和损耗模量 G 双素数都与频率无关。还证实，干燥然后再水化凝胶不会影响它们的杨氏模量。通过使用交联剂 Sulo sampa，可以在任何刚度的水凝胶上实现均匀的胶原蛋白涂层。
据观察，当接种在聚丙烯酰胺凝胶上 24 小时时，乳腺癌 M-D-A-M-B 2 31 细胞在 0.5 公斤和 1 公斤的软帕斯卡凝胶上保持圆形，但能够在 100 公斤的硬帕斯卡凝胶上扩散和伸长。此外，在柔性塑料支架上制成的水凝胶是透明的，便于观察和显微镜检查。此外，柔性塑料支架不会自动发出荧光，因此不会干扰荧光标记细胞的成像。
根据整体细胞铺展面积和细胞圆度进一步量化细胞形态。观看本视频后，您应该对以多孔板形式组装聚酰胺凝胶的效率、成本有一个很好的了解。用于研究刚度依赖性细胞生物学。
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概述
本文描述了一种在多孔板格式中快速、高效和低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该技术对任何研究实验室都是可行的，对于研究依赖刚度的细胞反应尤其有益。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物材料
背景
- 聚丙烯酰胺凝胶广泛用于细胞培养和生物力学。
- 了解细胞对基质刚度的反应对于各种生物应用至关重要。
- 传统的凝胶制备方法可能耗时且需要专门的设备。
- 这种新方法简化了过程，使其对研究人员更容易使用。
研究目的
- 提供一种制备聚丙烯酰胺凝胶的简单方法。
- 促进研究细胞如何对不同的刚度水平做出反应。
- 消除凝胶制备中对专门设备的需求。
使用的方法
- 在疏水玻璃板和柔性塑料支撑之间夹紧凝胶前体溶液。
- 聚合后将凝胶从玻璃板上剥离。
- 将干燥的凝胶切割成所需形状并粘贴到多孔板上。
- 用细胞粘附层（如胶原蛋白一型）涂覆凝胶。
主要结果
- 该方法允许快速制备适合细胞培养的凝胶。
- 凝胶可以轻松定制形状和大小以适应各种实验。
- 可以在这些基质上有效研究细胞粘附和行为。
- 该方法具有成本效益，且不需要专门的工具。
结论
- 该方法提高了研究细胞力学的研究人员的可及性。
- 它为研究依赖刚度的细胞反应提供了可靠的平台。
- 该技术可以在各种实验室环境中轻松采用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Stiffness-dependent cell responses are critical in target validation and phenotypic screening, yet traditional hydrogel preparation limits throughput and reproducibility in early discovery. This multiwell plate-compatible polyacrylamide gel assay enables rapid, cost-effective preparation of tunable substrates, supporting scalable assessment of mechanobiology in disease-relevant systems. By eliminating equipment barriers and enabling custom gel formats, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating substrate stiffness to clarify pathway dependencies in cell-based assays.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible preparation of polyacrylamide gels across stiffness ranges mimicking physiological tissues.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking extracellular matrix mechanics to cellular phenotypes, improving target confidence in mechanosensitive pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides validated, stiffness-tunable biological systems ready for downstream compound screening and target engagement studies.
- Operational Value: Ensures assay standardization and quantitative outputs via consistent gel thickness, crosslinking, and collagen coating across multiwell formats.
- Scalability: Enables platform reuse and high-throughput evaluation of compound effects on stiffness-dependent cell responses without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant modeling by recapitulating tissue stiffness ranges (0.1–100 kPa) observed in fibrotic, tumorigenic, or neurodegenerative microenvironments.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through quantification of cell spreading area and circularity as functional readouts of mechanotransduction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by revealing how substrate mechanics modulate drug sensitivity in 3D-like culture conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling mechanobiology-informed assay design at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating stiffness as an independent variable in cell response modeling.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible gel fabrication, ensuring consistent mechanical cues for compound library evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., cell area, circularity) that enable statistical comparison of conditions across stiffness gradients.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by maintaining physiological relevance in substrate mechanics.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, scalable capability for mechanobiology studies across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through multiwell plate compatibility and room-temperature gel handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering barriers to mechanobiology research and reducing reliance on outsourced hydrogel fabrication.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on stiffness-dependent phenotypic anchors in early-stage models.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture and gel casting expertise, including handling of acrylamide and bis-acrylamide solutions.
- Needs standard laboratory equipment: centrifuge tubes, degassing chamber, UV lamp, and tissue culture hood for sterilization.
- Demands cross-team standardization of gel thickness, crosslinking ratios, and collagen coating protocols for inter-experiment comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to 3D models or primary cell systems with distinct adhesion requirements.
- Includes practical limitations such as gel handling post-delamination and potential variability in hydrophobic coating uniformity affecting gel adhesion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Hydrogel-associated Solutions and Aliquots
2:41
Hydrogel Preparation
4:29
Multiwell Plate Assembly, Collagen Coating, and Sterilization
6:00
Results: Polyacrylamide Gel Preparation in Multiwell Plates for Stiffness-dependent Cell Response Studies
7:19
Conclusion
