简单的聚丙烯酰胺为基础的多井刚度检测方法的刚度依赖的细胞反应的研究

该程序的总体目标是能够快速、高效且廉价地制备多孔板形式的聚丙烯酰胺凝胶。这是通过首先夹在疏水涂层玻璃板和丙烯酰胺胶粘剂柔性塑料载体之间的凝胶前驱体溶液来实现的。第二步是将凝胶从玻璃板上剥离，玻璃板在聚合时共价连接到柔性塑料载体上并使其干燥。

接下来，将干燥凝胶和下面的柔性塑料支架切割成所需的形状，并将塑料面向下粘合到多孔板或任何其他细胞培养容器的孔底。最后一步是在多孔板组装的聚丙烯酰胺凝胶上涂上细胞粘合剂涂层，例如单层 1 型胶原蛋白。最终，显微镜以及其他细胞表征技术用于观察底层聚丙烯酰胺底物的效果。

特别是，它对细胞行为的刚度。与现有方法相比，该方法的主要优点是可以以低成本和省时的方式处理任何刚度和厚度的聚合物凝胶，并以多孔板形式组装它们，这是其他方法无法提供的。演示该程序将作为我的实验室的学生完成。

首先，通过将丙烯酰胺、交联剂双丙烯酰胺和去离子水混合制备聚丙烯酰胺凝胶前体溶液，以 50 毫克/毫升的浓度将 Sul OPA 溶解在二甲基砜中。将 20 μL 储备液分装到 10 个微量离心管中。然后闪蒸，将溶液在液氮中冷冻，并在零下 80 摄氏度下储存。

接下来，将每硫酸根离子的铵溶解在去离子水中，使每硫酸根离子铵的最终浓度为 10%（按体积计）重量。Eloqua 将每个硫酸盐溶液中 25 微升铵放入 10 个微量离心管中，并在负 20 摄氏度下储存。通过在 pH 值为 7.4 的 XPBS 中稀释 1 型胶原蛋白储备溶液，制备每毫升 0.2 毫克的胶原蛋白溶液。

所有溶液均保存在冰上直至使用。此时，将几滴疏水溶液滴在玻璃板上，并使用薄纸涂抹在表面上。让板风干后，再次用薄纸擦拭以均匀疏水涂层。

切割一个柔性塑料支撑，以匹配疏水涂层玻璃板的尺寸。然后用手术刀等锋利的工具轻轻刮擦表面，标记柔性塑料支架的疏水面。对于凝胶制备，将 4972.5 μL 所需最终浓度的聚丙烯酰胺前体溶液添加到 50 mL 锥形管中。

将试管放入脱气室中，打开盖子 30 分钟。在此之后，将 25 微升先前制备的每硫酸盐铵溶液加入 DGA 凝胶溶液中，以达到 0.05% 的最终每硫酸盐铵浓度，然后加入 2.5 微升 TM me 以达到 0.5% 的最终 TM ME 浓度通过上下吹打 3 至 5 次轻轻混合溶液。接下来，将所需厚度的硅胶垫片放在柔性塑料支架的亲水侧。

然后将凝胶溶液移液到垫片之间的柔性塑料支架上，并用疏水涂层载玻片灯夹住。让凝胶聚合 45 分钟后，撕下柔性塑料载体，顶部共价连接的聚丙烯酰胺凝胶，将凝胶面朝上自然干燥。干燥后，将聚丙烯酰胺凝胶切成所需的形状。

根据制造商的说明，每 96 孔板准备大约 500 微升聚甲基索烷，以将凝胶粘合到多孔板的底部。使用镊子将一小滴聚甲基索烷放在每个孔的中心。将一块聚丙烯酰胺凝胶放入每个孔中柔性塑料支撑面朝下。

固化聚二甲基 suboxane 后，用移液管将少量先前制备的纤维素 sampa 放入每个孔中，并左右旋转以均匀涂覆凝胶表面。将孔板置于高强度紫外灯下 5 分钟。完成后，用 PBS 冲洗凝胶以去除多余的玻璃纤维。

按照该移液管，将大约 50 微升先前制备的 1 型胶原蛋白溶液加入每个溶液中。用 PBS 冲洗后，将板盖在室温下至少两小时，以去除多余的胶原蛋白溶液。在组织培养罩中在紫外光下对凝胶消毒 2 小时。

最后，将凝胶浸泡在完全培养基中过夜，以水合和平衡。立即使用凝胶进行细胞固定，或在冰箱中存放长达两天杨氏模量作为几种丙烯酰胺和双的函数。此处分别指定为 A 和 B 的丙烯酰胺浓度与预期相同。

储能模量 G 素数和损耗模量 G 双素数都与频率无关。还证实，干燥然后再水化凝胶不会影响它们的杨氏模量。通过使用交联剂 Sulo sampa，可以在任何刚度的水凝胶上实现均匀的胶原蛋白涂层。

据观察，当接种在聚丙烯酰胺凝胶上 24 小时时，乳腺癌 M-D-A-M-B 2 31 细胞在 0.5 公斤和 1 公斤的软帕斯卡凝胶上保持圆形，但能够在 100 公斤的硬帕斯卡凝胶上扩散和伸长。此外，在柔性塑料支架上制成的水凝胶是透明的，便于观察和显微镜检查。此外，柔性塑料支架不会自动发出荧光，因此不会干扰荧光标记细胞的成像。

根据整体细胞铺展面积和细胞圆度进一步量化细胞形态。观看本视频后，您应该对以多孔板形式组装聚酰胺凝胶的效率、成本有一个很好的了解。用于研究刚度依赖性细胞生物学。